小鼠CD36基因片段合成、表达及GST融合蛋白的表达和纯化

目的获取小鼠CD36基因片段,并高效表达和纯化GST-CD36融合蛋白。方法设计合成CD36的基因功能片段,测序后,通过酶切克隆至表达载体pGEX-5X-2,构建重组表达载体,并导入E.coli BL21宿主菌中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组的GST融合蛋白,亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE进行分析鉴定。结果获得小鼠CD36基因片段,测序结果与GenBank的基因序列一致,重组GST融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子量28.5kDa处,出现特异性蛋白条带,重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论合成小鼠CD36基因片段,并在E.coli BL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST-CD36融合蛋白。     

小鼠TSR2-3/TSP-1基因片段的克隆及其GST融合蛋白的表达和纯化

目的：获取小鼠TSR2—3／TSP-1基因片段，并高效表达和纯化GST—TSR2—3融合蛋白。方法：应用RT—PCR技术，从小鼠肺总RNA中，获得编码TSR2—3的基因片功能片段，测序后，通过酶切克隆至表达载体pGEX-5X-2，构建重组表达载体，并导入E.coli BL21宿主菌中，IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白，亲和层析纯化表达产物，SDS—PAGE和Westem blot进行分析鉴定。结果：获得小鼠TSR2-3基因片段，测序结果与GenBank的基因序列一致，重组GST融合蛋白经SDS-PAGE和Westem blot分析，在相对分子量39kDa处，出现特异性蛋白条带，重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后，得到了高纯度的融合蛋白。结论：成功克隆小鼠TSR2—3基因片段，并在Ecoli BL21中高效表达，亲和层析后获得高纯度GST—TSR2—3融合蛋白。     

结核分枝杆菌furB基因的克隆、表达和纯化

目的: 从H37Rv基因组中扩增furB并高效表达和纯化. 方法: 用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增furB序列,将其与pGEM-T-Easy载体连接转化E.coli DH5α,构建重组克隆载体pGEM-T-Easy/furB,测序正确后将目的基因片断克隆入pQE-80L原核表达载体并转化E.coli DH5α,IPTG诱导目的蛋白表达. 经Western blot鉴定目的基因与(His)6融合表达,将已表达的蛋白质通过Ni2 -NTA亲和色谱柱进行纯化. 结果: PCR得到结核分枝杆菌furB,测序结果与Genbank中报道的完全一致. SDS-PAGE显示,在Mr为15.0×103处有相应的蛋白质表达条带,Western blot鉴定为(His)6融合表达蛋白. 经Ni2 -NTA亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白. 结论: 成功克隆了铁调节蛋白基因furB序列,并在E.coli DH5α高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白.     

大鼠Nogo基因片段的克隆及与GST融合蛋白的表达和纯化

目的: 获取大鼠Nogo基因片段并高效表达纯化. 方法: 用RT-PCR技术,从成年SD大鼠脊髓的总RNA中,获得编码Nogo基因功能片段的DNA. 测序后,通过酶切亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达载体,并导入E. coli DH5α中,IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白. 对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化. 结果: 获得成年SD大鼠Nogo(570～691和1028～1089氨基酸残基)的基因,测序结果与已发表的基因序列相一致. 重组GST融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr) 39 000和32 000处,有特异的蛋白条带. 重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白. 结论: 成功克隆成年大鼠Nogo基因片段,并在E. coli DH5α中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白.     

结核分枝杆菌特异性抗原Rv3117的克隆表达和诱导小鼠免疫应答的实验研究

目的 克隆表达结核分枝杆菌Rv3117蛋白,并进行诱导小鼠免疫应答的初步研究.方法 通过聚合酶链反应(PCR)扩增结核分枝杆菌Rv3117基因,克隆入pET32a载体,构建重组质粒pET32a-Rv3117,转化入大肠埃希菌BL21(E.coli) plysS(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍柱亲和纯化,通过SDS-PAGE鉴定其表达情况;以目的蛋白免疫C57BL/6小鼠血清并行Western blotting分析.结果 成功构建原核表达载体pET32a-Rv3117,获得纯化的目的蛋白,其在E.coli BL21 plysS(DE3)中主要以可溶性形式表达,相对分子质量(48 100)与预期相符.Western blotting分析结果显示在目标位置有阳性条带.结论 成功克隆结核分枝杆菌重组蛋白Rv3117,其能够诱导C57BL/6小鼠的免疫应答.     

重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。     

重组结核分枝杆菌ESAT-6的克隆与表达

目的:克隆和表达结核分枝杆菌ESAT-6。方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序。将esat-6基因亚克隆至pET-28a,构建pET-esat-6重组质粒,转化入大肠杆菌BL21感受态,PCR和双酶切鉴定阳性克隆,经IPTG诱导表达,用His-bindTM亲和层析柱纯化ESAT-6,SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果:PCR扩增出esat-6基因的特异片段,成功构建重组表达质粒pET-esat-6,并在BL21获得表达,纯化的ESAT-6能被结核病人血清所识别。结论:成功克隆和表达获得重组蛋白ESAT-6。     

HtsA表达质粒克隆和蛋白质的纯化

目的克隆HtsA重组表达质粒以获得HtsA表达蛋白。方法通过PCR方法扩增获得A组链球菌HtsA基因完整的序列,将此片段定向克隆到表达载体pET21d质粒中,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白,并运用离子交换层析和疏水层析分离纯化HtsA蛋白。结果经琼脂糖电泳证实成功克隆了重组表达质粒pET21d-HtsA,pET21d-HtsA融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达,SDS-PAGE分析表明纯化的HtsA纯度较高。结论成功构建了A族链球菌HtsA基因重组表达质粒,并纯化获得了目的蛋白HtsA。     

人血管内皮生长因子A(VEGFA)的原核载体构建、蛋白表达及鉴定

目的 克隆人VEGFA基因,与原核载体融合表达、纯化及其鉴定,并将其应用于肿瘤血管生长研究过程中.方法 采用PCR方法扩增人VEGFA序列,将其克隆入pGEX-KG原核载体,获得pGEX-KG-hVEGFA重组质粒.将该质粒转化入E.coli菌株BL21 (DE3),经IPTG诱导其表达,以GSTrap亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE电泳,Western Blot方法鉴定融合蛋白的表达.结果 PCR扩增获得了hVEGFA基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒载体经过PCR、酶切鉴定,证明重组质粒中已成功的插入了hVEGFA基因片段.成功构建了该蛋白的原核表达载体pGEX-KG-hVEGFA.结论 融合蛋白在IPTG终浓度为0.5 mmol/L、25℃条件下诱导表达,并获得纯化融合蛋白.采用Western Blot的方法可检测到目的融合蛋白GST-hVEGFA的表达.     

含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定

目的:在大肠埃希菌中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)vIL-6基因,并进一步纯化和鉴定表达蛋白.方法:以本实验室已构建的重组质粒pGEX-6p-1-vIL-6为模板,PCR扩增目的基因片段,将PCR产物克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建vIL-6的重组原核表达质粒pET-32a(+)-vIL-6.将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.表达产物通过镍亲和层析柱纯化并经蛋白质印迹法鉴定.结果:限制性内切酶检测和基因测序证实,成功构建了含有vIL-6基因的原核表达载体.蛋白质印迹法结果显示,在大肠埃希菌BL21(DE3)中His-Tag融合蛋白得到了表达,亲和层析法纯化后获得了相对分子质量为43 000的vIL-6融合蛋白.结论:重组质粒pET-32a(+) -vIL-6能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

87株幽门螺旋杆菌VacA等位基因的分析

目的以研究方法LiPA（Line Probe Assay）分析VacA等位基因的表达,了解幽门螺旋杆菌致病机理的理解。方法从三个不同城市87位进行胃镜检查患者的胃粘膜中培养出幽门螺旋杆菌,提取DNA,用LiPA方法分析VacA等位基因。结果（1）87位患者以sic（88．5％）和m2a（63．2％）分布为主,未发现s1b和s2;（2）混合菌株感染率为41．4％,远远高于西方国家,其中上海的混合感染率最高（62．5％）,与北京（41．0％）和南宁（20．8％）相比具有显著性差异,P〈0．01;（3）北京、海、南京三个不同城市s1、m等位基因亚型分布率存在差异;（4）溃疡病和非溃疡病患者m1和m2的分布率没有显著性差异。结论我国幽门螺旋杆菌多重菌株感染率较高,不同的m基因型与消化性溃疡的发生无显著性相关。     

降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值

目的 探讨降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值.方法 选取住院治疗的细菌性肺炎患者72例,根据治疗效果分为治疗有效组(有效组)47例和治疗无效组(无效组)25例,对治疗有效组和无效组中的降钙素酶原变化及影响肺炎治疗效果的危险因素进行分析.结果 有效组治疗后3天及治疗后7天的降钙素酶原显著低于无效组的患者(P＜0.05);年龄＞65岁、心功能≥3级、COPD、糖尿病、肺部双侧受累(X线示)、菌血症、感染性休克和3天内降钙素酶原变化率＜30％是影响细菌性肺炎治疗效果的危险因素;感染性休克、肺部双侧受累、3天内降钙素酶原变化率＜30％及心功能≥3级是影响细菌性肺炎治疗效果的独立危险因素.结论 测定降钙素原变化率对细菌性肺炎的疗效评估具有重要临床意义,可在临床推广应用.