RhoA蛋白通路在DLC-1基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制

目的: 探讨Rho A蛋白通路在DLC-1(frequently deleted in liver cancer-1)基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制.方法: 构建pcDNA3.1-DLC1质粒载体,脂质体法转染HT29细胞,筛选稳定细胞系;pull-down方法分析Rho A蛋白活性;实时定量PCR检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1、p21的表达变化;流式细胞仪检测细胞周期分布.结果: 野生型人结肠癌HT29细胞DLC-1基因表达呈阴性,经转染获得DLC-1稳定表达细胞系.与野生型及空载组HT29细胞相比,转染组细胞Rho A蛋白活性下降;Cyclin D1表达下调, p21表达上调;G1期及凋亡细胞数增加,而G2期细胞数下降.结论: 转染DLC-1基因引起人结肠癌HT29细胞Rho A蛋白活性下调,进而可能通过对Cyclin D1、p21表达的调控使细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡,同时分裂前期细胞数减少,细胞增殖受抑.     

白花蛇舌草对人骨肉瘤MG-63细胞Bax基因表达的影响

目的：探讨白花蛇舌草对人骨肉瘤M G‐63细胞Bax基因表达的影响。方法采用M T T法检测一定浓度白花蛇舌草注射液对MG‐63细胞作用6、12、24、48 h后的细胞增殖抑制率,实时荧光PCR（RT‐PCR）检测细胞内Bax基因的表达情况。结果白花蛇舌草注射液能明显抑制MG‐63细胞增殖,浓度为100μL／mL时,随着作用时间的延长,Bax基因表达明显升高（P＜0．05）。结论白花蛇舌草注射液可能通过上调Bax基因表达诱导人骨肉瘤M G‐63细胞凋亡。     

p27kip1过表达对肝细胞癌细胞株细胞周期的影响

目的探讨肿瘤抑制基因p27^kip1编码的P27蛋白过表达与HCC细胞株细胞周期的关系。方法本研究从野生型p27^kip1基因真核表达质粒pEYFP-P27（WT）出发,采用定点诱变技术构建了突变型p27^kip1基因表达载体pEYFP-P27（S10A）、pEYFP-P27（T157A）和pEYFP-P27（T187A）,然后用脂质体法将上述质粒转染HCC细胞株HepG2和Hep3B,Western Blotting检测内源和转入的P27蛋白表达,流式细胞仪检测P27蛋白过表达对HCC细胞株细胞周期的影响。结果野生型和3种突变型的P27融合蛋白在HepG2和Hep3B中的过表达都能增强G0／G1期阻抑;同时,对HepG2细胞,核定位位点突变体P27（T157A）比野生型P27蛋白及其他两个突变体具有更强的细胞周期阻抑活性,而对Hep3B细胞,3个突变体和野生型p27蛋白对细胞周期的影响无明显差异。结论P27蛋白过表达能够显著增强HCC细胞株的G0／G1期阻抑。     

脆性位点基因WWOX调控人胆囊癌细胞的体外增殖效应

［摘要］目的　探讨脆性基因WWOX调控胆囊癌细胞的增殖效应及其机制．方法　将前期成功构建的pcDNA3.0-WWOX重组质粒按脂质体介导转染GBC-SD细胞,同时转染空载体、脂质体为阴性对照及GBC-SD为空白对照．转染48 h后采用倒置显微镜观察各组胆囊癌细胞形态学变化,MTT、BrdU检测胆囊癌细胞增殖水平,流式细胞仪检测细胞增值周期的变化．结果　倒置显微镜观察pcDNA3.0-WWOX组GBC-SD细胞数量明显减少,悬浮细胞及细胞碎片增加,而Vector control、NC、Mock组细胞呈正常增殖状态．MTT检测显示pcDNA3.0-WWOX组GBC-SD细胞增殖于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h低于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）,并随时间推移,pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖活性抑制明显．BrdU检测显示pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖率为（0.44±0.03）,对照组分别为（0.78±0.02）,（0.81±0.01）,（0.85±0.01）,表明pcDNA3.0-WWOX组细胞增殖活性较对照组降低,差异有统计学意义（P＜0.05）．细胞周期检测发现pcDNA3.0-WWOX组G0 /G1期细胞增多,G2 /M 期和S 期细胞减少,细胞凋亡率较对照组（Vector control,NC,Mock）明显增高、增殖指数下降（P＜0.05）,而对照组间差异无统计学意义（P＞0.05）．结论　过表达WWOX基因体外可有效抑制胆囊癌细胞增殖活性, WWOX可能参与胆囊癌细胞恶性生物学行为的发展过程,有望成为胆囊癌基因治疗新的潜在靶点．     

人21．5kDaMBP基因沉默对神经胶质瘤细胞增殖与凋亡的作用研究

目的：研究人21．5kDa人脑髓鞘碱性蛋白（MBP）基因沉默对神经胶质瘤U251细胞增殖与凋亡的影响。方法将21．5kDaMBP序列特异性短发夹RNA（shRNA）重组质粒pGenesil‐1‐MBP‐3转染神经胶质瘤细胞株（U251）作为MBP基因沉默组,以空质粒转染为阴性对照组,脂质体转染为脂质体空转组;用实时定量PCR（RT‐PCR）和Westernblot方法检测各组21．5kDaMBPmRNA和蛋白的表达水平,CCK‐8法测定细胞增殖曲线,流式细胞法分析细胞凋亡率。结果与阴性对照组相比,MBP基因沉默组细胞中21．5kDaMBP在mRNA和蛋白水平的表达均显著下降（P＜0．05）、细胞增殖活性明显降低（P＜0．05）、细胞凋亡率显著增高（P＜0．05）。结论人21．5kDaMBP基因沉默对神经胶质瘤细胞U251具有显著的抑制增殖和促进凋亡的双重调节作用。     

恢复野生型PTEN基因表达对炎性乳腺癌MDA-MB-468体外生物学行为的影响

目的研究野生型PTEN基因转染对人炎性乳腺癌MDA—MB-468细胞体外生物学行为的影响及机制。方法应用基因重组技术构建重组质粒pcDNA3．1-PTEN，用脂质体转染乳腺癌细胞株MDA—MB-468，用RT—PCR、免疫组化及免疫印迹方法分析目的基因及其蛋白表达，并用免疫印迹方法检测转染后，在表皮生长因子的诱导下，磷酸化蛋白激酶B（PKB／Akt）的表达，四甲基唑蓝（MTT）法分析细胞增殖。Annexin V—FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果RT—PCR、免疫组化及免疫印迹显示pcDNA3．1-PTEN转染组有PTEN mRNA及其蛋白表达，且显示转染组在表皮生长因子的诱导下，p-Akt蛋白表达下调。MTT检测表明pcDNA3．1-PTEN转染组活细胞数较其它各组均低（P〈0．01），流式细胞分析其凋亡率达21．68％。结论野生型PTEN基因依赖其磷酸酶活性可诱导乳腺癌MDA—MB-468细胞凋亡。     

miR-302a对叶酸缺乏小鼠胚胎干细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨miR‐302a对叶酸缺乏小鼠胚胎干细胞（mESC）增殖和凋亡的影响。方法mESC分为完全培养基组（对照组）,无叶酸培养基组（无叶酸组）,无叶酸培养基＋miR‐302amimic组（miR‐302a组）,通过RT‐PCR进行检测miR‐302a在完全培养基及无叶酸培养基中的表达。构建miR‐302amimic,后转染到无叶酸培养基mESC中,采用MTT法检测miR‐302amimic对mESC活力的影响,AnnexinV‐FITC／PI流式细胞术检测miR‐302amimic对mESC细胞凋亡的影响;流式细胞术检测miR‐302amimic对mESC细胞周期的影响;Westernblot检测及磷脂酰肌醇3羟激酶（PI3K）／蛋白激酶B（Akt）／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路激活情况,以及下游分子细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、p21、p27表达的影响。结果RT‐PCR证实无叶酸组中miR‐302a表达量下降（P＜0．01）。与完全培养基比较,无叶酸培养基中,mESC细胞活力下降,细胞凋亡增加,细胞周期阻滞在G1期,Akt及mTOR磷酸化水平下降,CyclinD1表达下调,p21及p27表达上调,差异均具有统计学意义（P＜0．01）。与无叶酸组比较,miR‐302a组中,mESC细胞活力上升,凋亡下降,G1期缩短,AKT及mTOR磷酸化水平提高,CyclinD1表达上调,p21及p27表达下调,差异均具有统计学意义（P＜0．01）。结论miR‐302a类似物能显著抑制缺乏叶酸mESC凋亡,能促进其增值,与PI3K／AKT／mTOR信号通路有关。     

激活细胞外信号调节激酶-丝裂原蛋白激酶信号通路对人结肠癌细胞增殖及相关基因的影响

目的探讨野生型RAF和MEK持续激活细胞外信号调节激酶．丝裂原蛋白激酶信号通路（ERK-MAPK）对人结肠癌细胞增殖及细胞周期相关基因的影响。方法培养人结肠癌细胞系SW1116,脂质体介导RAF、MEK基因和空质粒转染,G418筛选阳性克隆。流式细胞仪分析细胞周期,光学显微镜下观察细胞形态学变化,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞活力,生长曲线和软琼脂集落形成检测细胞增殖,实时定量PCR检测p21^WAF1和p16^INK4A及癌基因c-myc转录水平。结果建立稳定表达RAF或MEK的细胞系,RAF或MEK高表达均能明显降低G0／G1期细胞百分比,促进细胞周期由G1向S期进行,增加DNA合成的S期细胞百分比,细胞活力和增殖力升高3—4倍,细胞分裂增殖旺盛。转染RAF／MEK质粒后,细胞均呈现p21^WAF1和p16^INK4A转录水平降低,c-myc转录水平升高。结论ERK-MAPK信号通路激活可下凋细胞周期相关基因p21^WAF1和p16^INK4A表达,并上调c-myc表达,减少G0期时相,加速G1／S期转化,促进细胞增殖。     

胃肠道间质瘤中C-kit原癌基因突变体的构建及功能研究

目的:构建含突变C-kit基因cDNA的真核表达质粒并行进一步的功能分析.方法:用RT-PCR方法从人胎脑组织克隆野生型C-kit基因蛋白编码区cDNA.根据胃肠道间质瘤中检测出的C-kit基因突变序列,体外突变野生型C-kit cDNA得到突变型C-kit cDNA,与pcDNA3重组成真核表达质粒,并用脂质体法稳定转染人胚胎肾细胞(human embryonic kidney cell,HEK)293细胞系,G418加压筛选出阳性克隆;用Western印迹法检测转染细胞KIT蛋白表达,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测转染HEK 细胞后细胞周期改变,并观察稳定转染突变型重组质粒人胚肾细胞在裸鼠内的成瘤性.分别设转染pcDNA3空白质粒和野生型的C-kit cDNA真核表达质粒的HEK细胞做为对照.结果:构建了突变型C-kit cDNA与pcDNA3的真核表达质粒; 功能检测分析表明:细胞生长曲线显示与对照组相比,实验组的生长速度明显增快;MTT比色显示,与对照组相比实验组细胞增殖活性显著增强;细胞周期检测结果显示,处于增殖期细胞(S G2-M)比例显著高于对照组;体内结果显示转染突变型C-kit基因的HEK细胞在裸鼠体内成瘤.结论:C-kit原癌基因突变体可促使人类细胞生长加快,增殖活性明显增强,并可以使更多的细胞由静止期进入增殖期, 并可使人胚胎肾细胞发生恶性转化,提示C-kit基因突变有可能是引起胃肠道间质瘤恶性转化的关键机制之一.     

人Bcl-6 3’UTR区报告质粒及其表达载体的构建和功能检测

目的通过构建bcl-6 基因野生型、突变体3’UTR区及其编码序列（CDS）,观察miR-127 对bcl-6 的直接靶向调控作用及
bcl-6表达载体回复miR-127抑制细胞周期和细胞生长的功能。方法利用PCR方法扩增bcl-6基因3’UTR区序列及其CDS,分
别构建在pcDNA3.0-Luc和pcDNA3.0-Flag载体上,在bcl-6基因3’UTR质粒基础上应用重组PCR方法构建miR-127结合位点
突变的突变体报告基因质粒,应用荧光素酶报告基因系统检测miR-127对bcl-6的直接靶向调控作用,在肝癌细胞HepG2中检
测过表达及敲低miR-127引起bcl-6基因表达抑制后细胞周期和细胞生长的改变,同时应用表达载体回复bcl-6蛋白水平,检测
bcl-6在miR-127调控细胞周期和细胞生长中的必要性。结果构建的重组质粒经酶切鉴定和测序证实构建正确,bcl-6 3’UTR
野生型和突变体报告质粒与miR-127共转293T细胞和HepG2细胞后荧光素酶报告基因检测显示miR-127明显降低野生型报
告质粒的活性,但对突变体活性没有影响,miR-127可引起HepG2细胞G2/M期阻滞并抑制细胞生长,bcl-6可以逆转miR-127
对细胞周期和细胞生长的影响。结论成功构建bcl-6基因3’UTR区野生型、突变体报告质粒和bcl-6基因的表达载体,荧光素酶
报告基因和回复实验证实均具有生物学功能。
     

透明细胞乳头状肾细胞癌的研究进展

2016年WHO正式将透明细胞乳头状肾细胞癌作为一种肾细胞癌新类型。该肿瘤可以为散发性也可以发生于终末期肾病或Von Hippel?Lindau综合征（VHL综合征）,具有相对特征性的病理组织学形态、免疫表型和分子遗传学特点,诊断时应与透明细胞肾细胞癌、乳头状肾细胞癌以及Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌相鉴别。鉴于透明细胞乳头状肾细胞癌生物学行为相对惰性或低度恶性,因此准确诊断对指导临床治疗和判断预后具有十分重要的意义。     

汉族人肾透明细胞癌细胞系的建立

目的:取汉族人临床标本,建立肾透明细胞癌(ccRCC)细胞系,初步研究该细胞系的生物学特性.方法:2005～2007年间共采集43例ccRCC新鲜手术标本(包括肾原位肿瘤、骨转移、淋巴结转移肿瘤及癌栓),于手术后30～60 min内用植块法进行体外培养,记录传代超过50代的细胞株的生长曲线,测定集落形成率,对细胞进行染色体分析,病理学检查,流式细胞术检测及NOD-SCID鼠荷瘤实验.结果:绝大部分原代细胞传代次数在5代内,其中5例可连续传代5代以上,4例传代超过10代.仅1例来源于骨转移组织的原代细胞(命名为RCC05-TXJ)及1例来源于原位ccRCC的原代细胞(命名为RCC05-ZYJ)可稳定连续传代.RCC05-TXJ经历21个月传110代,群体倍增时间19.2 h,染色体众数为75,集落形成率为41%;RCC05-ZYJ经历18个月传160代,群体倍增时间为16.5 h,染色体众数为55,集落形成率为37%.免疫组化显示CA9及CD133阳性,流式细胞术分析发现随细胞传代增多CA9及CD133表达明显增高(P＜0.05).两株细胞在NOD-SCID鼠体内均有良好的致瘤及转移性,但是转移倾向明显不同.结论:应用汉族人肾透明细胞癌组织成功建立了2个转移潜能不同的细胞系,随着传代次数增加,肿瘤干细胞比例增加.     

肝星状细胞和胰腺星状细胞的比较

肝星状细胞和胰腺星状细胞在各自纤维化疾病中都发挥着重要作用,两者在诸多方面存在相似之处。文章就两者的生物学特性、凋亡、信号转导通路方面进行总结和比较,以探讨它们之间的关系。     

干细胞与肿瘤干细胞

目的了解干细胞、肿瘤干细胞和恶性肿瘤关系的研究进展。方法复习国内外相关文献,综述肿瘤干细胞与干细胞的关系、肿瘤干细胞与恶性肿瘤发生发展的关系、研究现状、前景及存在的问题。结果正常干细胞和肿瘤干细胞之间存在很强的相似性,其中淋巴造血系统恶性肿瘤和少数实体瘤干细胞分离鉴定的成功有力支持了肿瘤干细胞理论。结论肿瘤干细胞理论可解释很多恶性肿瘤的生物学行为,但目前仍迫切需要相关分离、纯化、鉴定实体瘤干细胞的思路和方法。     

人骨巨细胞瘤细胞系GCT-0404的建立和生物学特性

目的:研究骨巨细胞瘤细胞体外培养的生物学特性,并建立人骨巨细胞瘤细胞系. 方法: 采用原代组织块培养法培养骨巨细胞瘤手术标本,对存活细胞进行形态学观察、免疫组织化学染色、细胞周期检查、核型分析、裸鼠移植. 结果: 建立人骨巨细胞瘤细胞系GCT-0404,其形态学表现、免疫组织化学染色均符合骨巨细胞瘤纤维母细胞样基质细胞的特征. 经过近1 a的体外培养,现已传代100次,细胞倍增时间39.7 h,细胞周期测定G1期为67.5%,G2期为8.9%,S期为23.6%. 染色体具有三倍体核型. 裸鼠移植成瘤率100%,无支原体污染. 结论: 人骨巨细胞瘤细胞系GCT-0404可以用于对骨巨细胞瘤的研究.     

细胞黏附对干扰素、5-氟尿嘧啶诱导细胞凋亡的影响

目的探讨细胞黏附作用对干扰素、5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导细胞凋亡的影响。方法采用HepG2、HEK293细胞株,常规96孔板培养细胞,分为空白不加药(A组)、多聚赖氨酸包被预处理+贴壁后加药(B组)、贴壁后加药(C组)、未贴壁就加药(D组)、未贴壁就加药和Fn抗体(E组)。选用干扰素、5-Fu分别作用各组细胞,MTT法测定各组增殖抑制率和DNA Fragmentation ELISA测定凋亡率,Western blot检测干扰素诱导各组PKR蛋白水平的表达。结果经多聚赖氨酸包被预处理后,细胞对药物的敏感性减弱,MTT法显示抑制率:干扰素作用G2细胞,B、C组抑制率分别为(27.24±31.77)%、(39.04±14.88)%(P<0.05);5-Fu作用G2细胞,B、C组抑制率分别为(30.61±11.26)%、(32.94±20.93)%(P<0.05);干扰素作用293细胞,B、C组抑制率分别为(32.02±23.48)%、(46.22±25.20)%(P<0.05);5-Fu作用293细胞,B、C组抑制率分别为(14.07±21.91)%、(31.61±31.49)%(P<0.05)。DNAFrag...     

高浓度腺苷通过抑制细胞增殖促进细胞存活

目的：研究危机环境下腺苷浓度增高对细胞的意义。方法：向细胞培养物中添加高浓度的腺苷来模拟危机环境,研究细胞对高浓度腺苷的生物学反应。结果：高浓度腺苷抑制细胞增殖,而不诱导细胞凋亡的发生;腺苷通过抑制细胞周期的进行而抑制细胞增殖;腺苷促进细胞在无糖环境下的存活。结论：腺苷通过抑制细胞增殖从而促进细胞在无糖环境下的存活。     

高胆血红素血症新生儿T细胞亚群、NK细胞表达水平的研究

目的 探讨高胆血红素血症新生儿T细胞亚群、NK细胞表达水平,为高胆血红素血症新生儿的早期诊疗、干预保健提供科学依据.方法 无菌采集健康足月自然分娩1分钟Apger评分≥8分,5分钟评分10分,体重在2.8～4Kg新生儿脐静脉肝素抗凝血2ml及不同高胆血红素血症新生儿股静脉肝素抗凝血2ml,采用美国RD有限公司提供的试剂,采用间接免疫荧光技术和S.P法,测定其T细胞亚群及NK细胞的水平.结果 （1）三个组CD3、CD4、CD8、NKCD16、NKCD57与对照组比较,均P＜0.01差异显著,有统计学意义.（2）一组与二组、三组比较,除了二组CD8 P＞0.05差异无统计学意义外,其他均P＜0.01差异显著,有统计学意义.结论 证实了高胆血红素血症新生儿胆红素毒性对其T细胞亚群及NK细胞有免疫抑制作用,可致患儿细胞免疫功能低下.这也是高胆血红素血症新生儿易并发感染的理论基础.为高胆血红素血症新生儿早期诊疗、干预及保健提供了基础免疫学依据.     

人胚腺垂体细胞库的初步建立

目的：初步探讨建立人胚腺垂体细胞库的方法及冷冻移植物复温后的形态和功能。方法：将人胚腺垂体细胞培养至第5天冷冻，15天后复温再培养，与单纯培养组相对照，相差显微镜下观察细胞形态，苔盼蓝测拒染率及检测激素分泌功能。结果：冷冻复温后垂体细胞存活率平均达78．2％；光镜下生物学状态无改变；GH分泌细胞复温后第5－7天状态最佳；PRL、TSH分泌水平差。结论：本方法适于建立人胚腺垂体细胞库用于治疗垂体性侏儒症，移植时机为复温后5－7天，该冷冻方法不适于PRL分泌细胞，培养条件不适用于TSH分泌细胞。     

干细胞分化的表观遗传调控

干细胞具有自我更新能力和多谱系细胞分化能力,在基础医学和临床应用中有极大研究意义。以胚胎干细胞为模型,近年来干细胞分化的表观遗传调控已成为研究热点。染色质结构的表观遗传调控,比如DNA甲基化、翻译后组蛋白修饰,对于胚胎发育时基因的激活和抑制非常关键。本文综述了干细胞多潜能性维持和干细胞分化的表观遗传机制及其一些表观遗传修饰之间的联系。