羊膜间充质干细胞静脉移植治疗脊髓损伤的实验

目的:探讨羊膜间充质干细胞静脉移植对脊髓损伤修复的影响。方法:90只成年SD大鼠按改良Allen′s打击方法建立脊髓损伤模型,随机分为3组:对照组、假移植组和移植组,每组30只。于脊髓损伤后1周经尾静脉移植Brdu标记的羊膜间充质干细胞。3组大鼠分别于损伤后第1 d、3 d、1周及移植后1 d、3 d、1周、2周、4周采用BBB评分法对行为学进行评价。并于移植后1 d、3 d、1周、2周、4周分批处死,切片观察Brdu标记的细胞能否迁移到损伤区。结果:脊髓损伤后第1 d,3组实验动物后肢运动功能BBB评分皆为0分;细胞移植1周后移植组动物BBB评分为5.6±0.6,对照组和假移植组动物BBB评分分别为5.3±0.4和5.2±0.6;细胞移植2周后移植组、假移植组和对照组BBB评分分别为11.3±0.9、6.4±0.5和6.5±0.8;4周后3组实验动物评分分别为13.4±0.9、8.3±0.6和8.5±0.7;在损伤部位出现了Brdu标记的羊膜间充质干细胞。结论:经静脉移植的羊膜间充质干细胞能够迁移到损伤区并对脊髓损伤有一定的修复作用。     

氯化锂联合脐血干细胞移植修复大鼠脊髓损伤

目的 观察氯化锂联合脐血干细胞移植对大鼠脊髓全横断损伤的修复效果.方法 成年雌性SD大鼠80只,建立胸9脊髓全横断损伤模型,随机分对照组(A组,n=20)、氯化锂组(B组,n=20)、细胞移植组(C组,n=20)和氯化锂+细胞移植组(D组,n=20).于术后1 d、3 d及每周的最后1天,应用BBB评分评价大鼠脊髓功能的恢复情况;8周后取材,通过Brdu细胞核标记观察移植细胞的存活、迁移;通过荧光金逆行追踪,观察脊髓神经纤维的再生与分布.结果 4只大鼠死亡.术后8周可观察到Brdu标记的脐血干细胞在体内存活并在脊髓内迁移;细胞移植组和氯化锂+细胞移植组可见少量连续性神经纤维通过损伤区.荧光金逆行脊髓追踪显示C组和D组可见被荧光金标记的神经锥体细胞穿越损伤区.术后8周A、B、C、D四组后肢功能运动BBB评分分别为4.11+0.14、4.50+0.15、8.31±0.11、11.15±0.18.结论 氯化锂能促进人脐血间充质干细胞在损伤区的存活并向神经细胞分化,氯化锂联合脐血干细胞与脊髓去细胞支架移植能够促进细胞移植修复大鼠脊髓损伤的效果.     

BMSCs联合人发角蛋白移植治疗陈旧性脊髓损伤效果

目的研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)联合人发角蛋白支架复合体移植治疗陈旧性脊髓损伤可行性。方法体外采用全骨髓贴壁筛选法原代培养大鼠BMSCs,移植前应用5溴-2脱氧尿嘧啶(BrdU)标记。采用改良Allen打击法制备大鼠陈旧性脊髓损伤模型,随机分为对照组、单纯BMSCs移植组、BMSCs联合人发角蛋白移植组,每组10只,采用立体定位移植方法分别于各组脊髓损伤部位植入细胞培养基、BMSCs悬液、人发角蛋白+BMSCs细胞悬液。移植后第1、2、4、8周应用动物后肢运动功能评分法(BBB)对大鼠后肢运动功能进行评分;移植后第8周处死大鼠,取T9~T11节段脊髓组织制备切片,采用苏木精-伊红(HE)染色法观察脊髓组织大体形态,免疫组化方法检测BrdU阳性细胞的存活及移植细胞的分化情况。结果单纯BMSCs移植组、BMSCs联合人发角蛋白移植组各时段大鼠BBB评分均优于对照组,BMSCs联合人发角蛋白移植组优于单纯BMSCs移植组,差异均有显著性(F=25.64,q=11.86~20.79,P<0.05)。HE染色观察见3组脊髓均严重受损,灰白质界限模糊,均有空洞和坏死瘢痕组织,BMSCs联合人发角蛋白移植组空洞较其余两组少。BMSCs联合人发角蛋白移植组移植部位以及头尾端距离移植中心约1 cm处均可见BrdU染色阳性细胞及BrdU+神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性细胞。结论 BMSCs联合人发角蛋白移植后移植细胞可以存活并分化为神经元样和神经胶质样细胞,有效促进陈旧性脊髓损伤大鼠模型后肢功能的恢复,其效果较单纯干细胞移植显著。     

神经干细胞与骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤修复的比较

目的:比较神经干细胞和骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤效果与机制的差异。方法:用成年Wist-ar大鼠建立脊髓半横切模型,随机分为神经干细胞(NSCs)组(n=10)、骨髓间充质干细胞(BMSC)注射组(n=10)、PBS注射组(n=10)及只打开椎板的假手术组(n=10)。移植后行BBB运动功能学评分,半切位置的免疫组化及核磁成像比较。结果:BBB评分NSCs注射组明显高于BMSCs注射组,NSCs注射组和BMSCs注射组均明显高于PBS注射组,脊髓切片中可观察到被标记的NSCs及BMSCs,核磁成像显示移植后半切形成的脊髓空洞有所减小。结论:静脉注射NSCs、BMSCs均能改善脊髓损伤大鼠的运动功能,但注射NSCs效果更明显。静脉注射干细胞后,细胞可迁移至脊髓损伤的位置,核磁成像显示脊髓空洞有所减小,提示干细胞可能通过补充或替代损失的神经细胞,修复已缺失的神经组织和功能性神经单位,重建神经环路。     

条件培养基局部移植对大鼠脊髓损伤的修复作用

目的：观察骨髓间充质干细胞的条件培养基(BMSC-CM)局部移植对脊髓损伤修复的作用。方法采用改良的Allen 装置制作大鼠 T9脊髓损伤模型,随机分为对照组(脊髓损伤后局部微量注射生理盐水10μl)和实验组(脊髓损伤后局部注射 BMSC-CM 10μl),两组均采用 BBB 评分、斜板实验法观察大鼠运动功能恢复情况,苏木精-伊红(HE)染色观察脊髓损伤处血管生长及空洞体积的改变情况。结果实验组大鼠的 BBB 后肢功能评分、斜板倾斜角度优于对照组(P <0．05),脊髓损伤处空洞体积明显小于对照组,血管直径大于对照组。结论 BMSC-CM 能够减小脊髓损伤处的空洞体积和促进血管生长,从而促进脊髓损伤后神经功能的恢复。     

BMSCs并BDNF移植治疗大鼠陈旧性脊髓损伤效果

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)并脑源性神经营养因子(BDNF)移植治疗大鼠陈旧性脊髓损伤的效果。方法对48只Wistar大鼠采用改良的ALLEN撞击法建立脊髓损伤模型,将其随机分为4组,4周后4组分别注射BMSCs+BDNF、BMSCs、BDNF及DMEM干预。分别于移植后1、2、4周采用BBB评分评估大鼠后肢运动情况,并于移植后4周采用免疫组化法检测BMSCs在脊髓损伤部位的分布,及生长相关蛋白43(GAP-43)的表达。结果移植后4周,BMSCs+BDNF组及BMSCs组的BMSCs在脊髓损伤部位均得以存活。BMSCs+BDNF组与BMSCs组及BDNF组比较,脊髓空洞较少并且GAP-43阳性表达面积较高(F=35.57,q=4.97～25.84,P<0.05)。BMSCs+BDNF组BBB评分与其他组比较,差异有显著性(F=27.51,q=3.89～11.57,P<0.05)。结论 BMSCs+BDNF联合移植对于大鼠陈旧性脊髓损伤有较好的修复作用。     

骨髓单个核细胞移植对脊髓半横断大鼠损伤组织中髓鞘碱性蛋白表达的影响

目的：研究骨髓单个细胞移植脊髓半横断大鼠脊髓损伤区域后髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）表达的影响.方法：取Wistar大鼠胫骨及股骨提取骨髓单个核细胞,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,制成细胞悬液.建立大鼠脊髓右半横断模型,造模后分为假手术组、模型组、骨髓单个核细胞移植组.于模型建立成功后7d,14d,21d,28d手术的大鼠进行BBB评分从而评估损伤脊髓神经功能恢复情况,利用RT-PCR观察MBP mRNA的表达变化.结果：术后各时间点假手术组BBB评分均明显高于骨髓单个核细胞移植组、模型组（P＜0.05）;术后随时间延长骨髓单个核细胞移植组、模型组BBB评分逐渐增加,14、21、28d时骨髓单个核细胞移植组BBB评分明显优于模型组（P＜0.05）.PT-PCR测试各时间点骨髓单个核细胞移植组和模型组大鼠脊髓中MBP mRNA的表达量高于假手术组,且骨髓单个核细胞移植组高于模型组（P＜0.05）.结论：骨髓单个细胞移植可提高脊髓组织中MBP的表达,有助于大鼠半横断脊髓损伤神经功能的恢复.     

骨髓基质细胞体外诱导分化移植治疗大鼠脊髓损伤的研究

目的 探讨大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)在体外由碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、全反式维甲酸(RA)联合诱导下分化成的神经细胞样细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的可行性.方法 采用出生4周SD大鼠的全骨髓细胞进行培养,利用bFGF+EGF+RA在体外诱导BMSCs向神经细胞样细胞分化.在倒置相差显微镜下每日观察、记录BMSCs的诱导分化情况,并应用免疫组化技术对细胞进行兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)单克隆抗体鉴定.实验动物分为3组:细胞移植组(A组)、模型对照组(B组)、正常对照组(C组).A、B组采用改良Allens法建立大鼠急性脊髓损伤模型.A组在造模后立即将诱导后的BMSCs悬液多点缓慢注入到损伤节段的头侧和尾侧,B组同法注射等量磷酸盐缓冲液.C组不造模,于相同部位注射等量磷酸盐缓冲液.于伤后1～5周,按照BBB法观察脊髓神经功能恢复情况并处死动物取材,用HE染色观察脊髓病理变化.结果 诱导7 d后有部分细胞具备神经元样细胞形态,胞体呈锥形或圆形,有较长单极或多极的突起,有NSE阳性细胞表达;细胞移植后1～5周,A、B组动物运动功能均有不同程度恢复,但B组恢复较慢,BBB评分差异有统计学意义(P<0.05);组织形态学观察示A组损伤脊髓恢复较好.结论 bFGF、EGF和RA可以联合诱导BMSCs向神经干细胞分化,并可调控神经元分化,将其移植于大鼠脊髓损伤区,可促进脊髓损伤的恢复.     

移植共培养的骨髓间充质干细胞与胰岛细胞对糖尿病大鼠的降血糖作用

目的:观察与胰岛细胞共培养的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)能否转化为胰岛样细胞,并探讨将其移植入糖尿病大鼠体内对血糖的控制效果。方法:体外共培养BMSCs及胰岛细胞;18只雄性SD大鼠通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病大鼠模型,分为PBS组、BMSCs组、BMSCs与胰岛细胞共培养组。将Brdu标记的细胞从尾静脉移植入糖尿病大鼠模型体内,观察临床疗效,免疫组织化学染色确定Brdu标记的细胞及胰岛素抗体在胰腺的分布。结果: 细胞移植后用血糖仪检测大鼠尾静脉血糖,PBS组血糖较移植前无明显下降（P>0.05）,BMSCs组及共培养组大鼠血糖移植后14 d血糖开始下降,与移植前比较差异有显著性（P<0.01）,共培养组大鼠移植后血糖较BMSCs组血糖明显下降,组间比较差异有显著性（P<0.01）。免疫组织化学方法检测,BMSCs组及共培养组Brdu标记的细胞在细胞核显色,为棕黑色。其相应的胰岛素表达阳性,主要显色在胞浆,为棕红色。PBS组大鼠胰腺未发现Brdu标记细胞及胰岛素表达阳性。结论:大鼠BMSCs在体内微环境下经尾静脉移植入糖尿病大鼠体内,可以降低大鼠血糖,而经体外微环境与胰岛细胞共培养的BMSCs移植入糖尿病大鼠体内后能起到相同作用,且降糖作用强于前者。     

骨髓间充质干细胞和嗅黏膜神经干细胞共移植治疗大鼠脊髓损伤

【摘要】目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)和嗅黏膜神经干细胞(OM NSCs)共移植对大鼠脊髓损伤后运动功能的影响。方法 分别提取培养并鉴定大鼠BMSCs和OM NSCs。将60只雄性SPF级SD大鼠随机分为假手术组（仅做椎板切除,不损伤脊髓）,对照组（在脊髓损伤区域注射5 μL生理盐水）,BMSCs移植组（在脊髓损伤区域注射5 μL 5×104个细胞BMSCs单细胞悬液）,OM NSCs移植组（在脊髓损伤区域注射5 μL 5×104个细胞 OM NSCs单细胞悬液,BMSCs和OM NSCs共移植组（在脊髓损伤区域注射5μL 1〖DK〗∶1 5×104个细胞BMSCs和OM NSCs细胞混悬液）。细胞移植后第1、3、7、14、21、28天分别对大鼠进行BBB评分,28天后处死大鼠,分离脊髓组织,进行免疫荧光染色观察细胞迁移情况。结果 造模后,大鼠双后肢瘫痪,BBB评分0分。细胞移植后14天起,与对照组相比,干细胞移植组运动功能有显著改善,BBB评分比较差异具有统计学意义（P＜005）。与BMSCs移植组和OM NSCs移植组相比,移植后21、28天,共移植组BBB评分显著增加（P＜005）。免疫荧光观察结果表明,脊髓损伤28天后,损伤区脊髓内可见空泡形成,两种干细胞聚集在空泡周围,BMSCs在损伤区分布较为集中,而OM NSCs相对散在分布,细胞较为伸展。结论 干细胞移植可以一定程度上恢复脊髓损伤大鼠的运动功能,BMSCs和OM NSCs两种干细胞共移植效果优于单细胞移植。     

褪黑素对急性脊髓损伤大鼠血清及脊髓内神经生长因子表达的影响

目的研究褪黑素（MT）对脊髓损伤大鼠血清及脊髓内神经生长因子（NGF）表达水平的影响。方法84只健康成年雄性SD大鼠随机分为模型对照组（n=36）、模型MT组（n=36）及假手术组（n=12）。建立脊髓损伤模型后,模型对照组给予无水乙醇,模型MT组给予MT,均为腹腔注射。对比术后12h、3、5d大鼠血清及脊髓组织中NGF的表达及Tarlov评分。结果术后12h模型对照组及模型MT组Tarlov评分显著低于假手术组（P〈0．05）。模型MT组TarlOV评分稍高于模型对照组,但差异无统计学意义（P〉0．05）。术后3、5d模型MT组Tarlov评分均显著高于模型对照组（P〈0．05或P〈0．01）。术后12h、3、5d模型对照组和模型MT组血清NGF水平、脊髓组织NGF蛋白及NGFmRNA水平均较假手术组显著上升,模型MT组则显著高于模型对照组（P〈0．05或P〈0．01）。结论MT通过调高脊髓损伤大鼠体内NGF的表达起到减轻神经细胞损伤、促进神经细胞再生和神经功能恢复作用。     

骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后COX-2基因表达的影响

目的观察骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）移植对大鼠脊髓损伤后COX-2 mRNA表达的影响。方法分离培养BMSCs并传代。取Wistar雌性大鼠72只随机分为3组：A组18只（假手术组）、B组27只（细胞培养基对照组）和C组27只（BMSCs组）。B组和C组脊髓损伤后进行DMEM或BMSCs损伤周围区注射。应用RT-PCR法和免疫荧光方法检测损伤脊髓组织内COX-2 mRNA的表达及COX-2蛋白分布情况。结果 COX-2 mRNA在A组大鼠脊髓组织中低水平表达。脊髓损伤移植术后,C组COX-2 mRNA表达水平均显著高于相应时间点的B组（P〈0.01）。免疫荧光结果显示,A组COX-2仅表达于脊髓内的血管。脊髓损伤后,B组和C组COX-2表达分布则发生变化,主要见于损伤周围区脊髓内的血管和少数脊髓腹侧灰质内的神经元。结论 BMSCs移植能够增加脊髓损伤后COX-2 mRNA的表达。     

永生化的BMSCs移植促进大鼠脊髓损伤后功能恢复

目的探讨神经生长因子(Nervegrowthfactor,NGF)和脑源性神经生长因子(BrainDerivednervegrowthfactor,BDNF)基因修饰后永生化的骨髓基质细胞(Bonemarrowstemcells,BMSCs)移植促进大鼠脊髓损伤后功能恢复。方法SD大鼠制备成脊髓损伤动物模型。随机分为损伤对照组(A组)、BMSCs移植组(B组)和NGF、BDNF基因修饰后永生化的BMSCs移植组(C组)。治疗后2、4、6周,每组动物分别进行联合行为评分(GBS)、运动诱发电位(MEP)、感觉诱发电位(SEP)检查、双下肢功能测定(爬坡试验),评价脊髓损伤功能恢复情况。结果随时间的延长,B组GBS、MEP、SEP及下肢功能明显改善,与其它组相比较,差异有显著性,P<0.05。结论NGF、BDNF基因修饰后永生化的BMSCs移植能恢复损伤脊髓的功能。     

骨髓基质细胞移植对大鼠脊髓损伤后环氧化酶-2和血管内皮生长因子表达的影响

目的：观察骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）移植对大鼠脊髓损伤后环氧化酶-2（cyclooxygenase-2, COX-2）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）蛋白表达的影响。方法大鼠随机分为3组：A为假手术组,B为细胞培养基（DMEM）对照组,C为BMSCs移植组。B组和C组大鼠进行脊髓压迫损伤模型制作。脊髓损伤后, B组和C组大鼠分别给予DMEM培养液或BMSCs脊髓损伤周围区注射。术后应用Western Blot方法检测COX-2、VEGF蛋白在损伤脊髓组织中的表达变化。结果 COX-2、VEGF蛋白在A组大鼠未损伤脊髓组织中均低水平表达。B组与A组相比,脊髓损伤后COX-2蛋白表达水平明显增加（P＜0.01）,VEGF蛋白表达水平则短暂显著增加（P＜0.05）。C组与B组相比, COX-2和VEGF蛋白表达水平均显著增加。结论 BMSCs移植能够增加脊髓损伤后COX-2、VEGF蛋白的表达。     

骨髓基质细胞移植对大鼠损伤脊髓GDNF mRNA表达的影响

目的:研究骨髓基质细胞(BMSCs)移植对大鼠损伤脊髓胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达的影响.方法:将大鼠36只随机分为移植组和对照组,每组3个时相点,每个时相点每组6只动物.移植或手术后24,72 h和7 d,用RT-PCR方法对GDNF的表达进行半定量分析.结果:移植组GDNF mRNA 24,72 h和7 d时都明显高于单纯损伤组(P＜0.05).结论:BMSCs移植可使损伤脊髓表达GDNF增强.     

褪黑素对脊髓损伤早期大鼠神经生长因子表达的影响

目的:通过观察褪黑素(MT)对脊髓损伤(SCI)早期大鼠体内神经生长因子(NGF)表达的影响,探讨MT治疗SCI的机制。方法:60只成年SD大鼠随机分为3组:模型组、MT组和假手术组,每组20只。前2组以改良的Allen’sWD法建立脊髓T12水平损伤模型,假手术组仅行椎板切除不损伤脊髓。MT组于术后10min腹腔注射MT100mg/kg,模型组则腹腔注射等体积无水乙醇。术后12h对3组大鼠进行BBB运动功能评分后处死,取血液检测NGF水平;取脊髓标本进行病理观察,RT-PCR法检测NGFmRNA,免疫组化SP法检测NGF蛋白。结果:模型组和MT组大鼠于术后均出现了严重的下肢神经功能障碍,2组的BBB运动功能评分差异无统计学意义(P>0.05)。MT组脊髓组织病理变化较模型组减轻。3组大鼠脊髓内NGFmRNA、NGF蛋白表达水平和血清NGF水平差异均有统计学意义(F=336.819,321.762和122.707,P均<0.001),3者均在MT组中最高,SCI组次之,假手术组最低(P<0.01)。结论:MT可通过提高SCI大鼠体内NGF的表达减轻SCI。     

红花黄素对骨髓间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的影响

目的:通过研究红花黄素对骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植修复大鼠脊髓损伤(SCI)的影响,探讨其可能的作用机制。方法:骨髓细胞贴壁法分离、培养、扩增BMSCs,并进行腺病毒介导的绿色荧光蛋白(GFP)标记。45只SD大鼠行改良Allen法制备SCI模型后,随机分为红花黄素组、单纯BMSCs组和PBS组,红花黄素组于损伤脊髓局部注入GFP-BMSCs,腹腔注射红花黄素40 mg/kg;单纯BMSCs组脊髓注入GFP-BMSCs,PBS组注入同体积0.9%氯化钠溶液。术后1、2、3、4、7 d检测损伤脊髓组织超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;分别于7、14、21、28 d检测损伤脊髓组织神经元特异性核蛋白(NeuN)和神经生长因子(NGF)表达,BBB评分法进行后肢运动功能评分。结果:红花黄素组BBB评分、脊髓损伤局部SOD活性及NeuN和NGF的表达均明显高于单纯BMSCs组和PBS组(P<0.05),而MDA含量较低(P<0.05)。结论:红花黄素通过抑制脊髓自由基生成、减轻脂质过氧化、上调NeuN和NGF表达而增强骨髓间充质干细胞移植修复大鼠脊髓损伤的效果。     

经静脉移植骨髓基质干细胞治疗脊髓损伤后碱性成纤维生长因子表达变化

目的:通过观察骨髓基质干细胞(BMSCs)移植治疗脊髓损伤后对bFGF表达的影响,探讨经静脉移植骨髓基质干细胞治疗脊髓损伤的可行性。方法:用改良的Allen’s WD法建立脊髓(T12节段)损伤模型,免疫组织化学方法检测bFGF的表达。结果:bFGF在各组大鼠脊髓中均呈阳性表达,损伤后对照组与BMSCs移植组各个时点的表达量仍高于正常组(P<0.05),7d最高,后渐下降,但21d表达仍高于正常。其中BMSCs移植组与对照组各个时点的bFGF表达量均有显著差异(P<0.05)。结论:BMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤模型有助于脊髓功能的恢复。