HSP90β干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在骨肉瘤细胞Saos-2中的表达

目的:获得热休克蛋白90β(HSP90β)基因干扰和过表达慢病毒表达系统，并检测其在人骨肉瘤细胞株Saos-2中的表达水平。方法:设计合成shRNA，以慢病毒表达质粒构建HSP90β干扰和过表达载体，酶切电泳、测序技术鉴定载体构建是否成功。重组病毒转染H1299细胞，以嘌呤霉素筛选稳定转染的Saos-2细胞，通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为干扰NC组（NEG-shRNA）、干扰组（shRNA-HSP90β）、过表达NC对照组（NEG-pEZ）及过表达组（pEZ-HSP90β）。通过qRT-PCR 与Western blotting 分别从mRNA 和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果:插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。病毒包装成功后，嘌呤霉素最小致死浓度1 μg/ml，感染复数200，感染人Saos-2的感染效率达80%，其中shRNA-HSP90β组干扰效率为86.35%，pEZ-HSP90β组的mRNA相对表达量增加2.8倍。进一步研究发现，shRNA-HSP90β组较NEG-shRNA组中HSP90β蛋白表达明显降低，pEZ-HSP90β组较NEG-pEZ组HSP90β蛋白表达增加。结论:HSP90β基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功，并能够在Saos-2中稳定表达。     

骨桥蛋白与心血管系统疾病

骨桥蛋白是一种内分泌性非胶原型糖基化磷蛋白,可由破骨细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞等多种细胞表达,其表达受多种因素的影响.正常动脉壁及主动脉瓣膜中骨桥蛋白几乎不表达,动脉粥样硬化、血管及主动脉瓣膜钙化和新生内膜形成时,其水平显著升高.     

脱钙骨基质与生物蛋白胶复合载体修复兔关节软骨缺损

背景:应用组织工程学方法修复软骨组织缺损,需要有合适的载体,在发挥承载作用的同时对软骨细胞起到良好的固定作用.目的:观察利用脱钙骨基质与生物蛋白胶的复合载体修复实验性兔关节软骨缺损的可行性及有效性.方法:制备脱钙骨基质与生物蛋白胶的复合载体.建立兔关节软骨缺损模型,编号后,将42只新西兰大白兔随机分为3组:载体复合细胞组(n=15):兔膝关节软骨缺损区植入含有软骨细胞的脱钙骨基质与生物蛋白胶的复合载体;单纯载体组(n=15):植入不含细胞的复合载体;空白对照组(n=12):不进行任何植入处理.依照分组,分别于术后4,8,12周取材,进行大体、组织学、甲苯胺蓝染色观察,并做Wakitani评分,观察各组动物关节缺损修复效果.结果与结论:载体复合细胞组12周时可以修复膝关节软骨的缺损,并且以透明软骨组织为主,修复效果明显强于单纯载体组与空白对照组;Wakitani评分在各个时间均优于其他两组(P < 0.05).提示脱钙骨基质与生物蛋白胶的复合载体负载软骨细胞可以作为软骨组织工程支架材料,能够用于再生修复软骨的缺损.     

兔软骨细胞与骨髓基质细胞的平面共培养：两者培养比例筛选

背景：骨髓基质细胞一定条件下可以分化为软骨细胞,但目前还缺少将软骨与骨髓基质细胞平面共培养的深入探讨。 目的：拟明确骨髓基质细胞与软骨细胞共培养时比例的选择、细胞增殖活性、软骨特异性蛋白表达的规律,用于细胞移植的最佳时间和传代次数。 方法：软骨细胞与骨髓基质细胞的分离培养,传代后分为5组：单纯软骨细胞组;共培养组,软骨细胞与骨髓基质细胞7∶3,5∶5,3∶7组;以及单纯骨髓基质细胞组。传代至第4代(G4),倒置相差显微镜观察各组细胞在不同传代时期的细胞形态,MTT实验检测细胞增殖活性,甲苯胺蓝与阿利新蓝染色,细胞免疫化学法检测Ⅱ型胶原的表达。 结果与结论：共培养各组在各个时期细胞表型正常。G1~G3代细胞增殖活跃,G4代细胞增殖能力下降。共培养各组甲苯胺蓝与阿利新蓝染色以及Ⅱ型胶原表达在G2和G3代均较高。综合各指标认为,以软骨细胞与骨髓基质细胞的比例为5∶5,3∶7组为最佳。软骨细胞与骨髓基质细胞平面共培养,保持了软骨细胞的形态和蛋白表达特性,如进行细胞移植,选取软骨细胞与骨髓基质细胞5∶5或3∶7的比例为最佳。     

蜂胶对高脂饲料诱导的动脉粥样硬化家兔的干预效应

目的：观察蜂胶对高脂诱导的动脉粥样硬化的干预作用.方法：实验于2003-05/11在泰山医学院动物室、诊断学实验室和形态学实验室完成.选择雄性新西兰家兔24只,随机分为4组,对照组、模型组、蜂胶组及卡托普利组各6只.①对照组：喂饲基础颗粒饲料.②模型组：喂饲高脂饲料（基础颗粒饲料＋100 g/L猪油＋10 g/L胆固醇）.③蜂胶组：在喂饲高脂饲料的基础上,灌胃蜂胶0.35 g/d.④卡托普利组：在喂饲高脂饲料的基础上,灌胃给予卡托普利15 mg/d.每只家兔约食饲料110～140 g/d,12周末处死,取血清及动脉标本待查.①测定血清总胆固醇,三酰甘油,高、低密度脂蛋白胆固醇水平采用酶法.②测定血清超氧化物歧化酶、丙二醛、一氧化氮水平测分别采用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法、硝酸还原酶法.③组织学观察：麻醉处死动物后立即解剖分离主动脉,记录主动脉壁粥样斑块大小.截取主动脉降部切片后光镜下观察主动脉壁及内膜损伤程度.④免疫组化法检测：增殖细胞核抗原染色、原位细胞凋亡染色均使用链酶亲和素-过氧化物酶法.把增殖细胞核抗原切片及原位细胞凋亡切片放在光镜下各取10个视野,计数每个视野斑块中的阳性细胞数均值作为阳性细胞数.把苏木精-伊红切片放在光镜下取与前面切片相同部位的10个视野,计数每个视野斑块中所有细胞数的均值作为细胞总数.增殖指数=增殖细胞核抗原染色阳性细胞数/细胞总数&;#215;100%;凋亡指数=原位细胞凋亡染色阳性细胞数/细胞总数&;#215;100%.结果：所有家兔全部进入结果分析,无脱落.①各组家兔动脉粥样硬化的病理改变：模型组出现典型动脉粥样硬化病理变化,全部动脉内皮下层明显增生、增厚,为多量泡沫细胞聚集形成,伴有纤维组织、无定型物质及钙盐沉积.蜂胶组也有病理改变,但内皮下仅轻、中度增生,泡沫细胞聚集,未见纤维组织和无定型物质.②各组家兔血脂水平的比较：蜂胶组、卡托普利组家兔的总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平均明显低于模型组（P＜0.01）,而蜂胶组显著低于卡托普利组（P＜0.01）.卡托普利组、蜂胶组家兔的三酰甘油水平显著低于模型组（P＜0.05～0.01）.③各组家兔血清超氧化物歧化酶、丙二醛及一氧化氮水平的影响：蜂胶组家兔超氧化物歧化酶水平明显高于模型组和卡托普利组（P＜0.01）.蜂胶组血清丙二醛含量显著低于模型组和卡托普利组（P＜0.05～0.01）.蜂胶组、卡托普利组血清NO2^-/NO3^-含量显著高于模型组（P＜0.05）.④各组家兔免疫组化法检测结果：蜂胶组、卡托普利组家兔的增殖指数、凋亡指数均显著低于模型组（P＜0.01）.结论：蜂胶能有效地预防实验性动脉粥样硬化的形成,其作用途径可能和其降低斑块细胞的增殖和凋亡以及降脂、抗氧化、保护内皮作用有关.     

人脐动脉平滑肌细胞原代培养方法的比较

目的比较人脐动脉平滑肌细胞（HUASMC）两种原代培养方法的优劣。方法分离脐动脉，剥离中膜，将其剪成小块，贴块法将小块直接接种于培养瓶中；酶解法①单用胶原酶Ⅰ（0．2％）分别消化5小时、8小时、24小时后接种于培养瓶，②分别用胶原酶Ⅰ（0．2％）消化3小时和胰蛋白酶（0．25％）消化2小时，接种于培养瓶。结果贴块法6天可以见到细胞从组织块周围游出，20～30天后可以进行传代；单用胶原酶Ⅰ消化24小时可以见到少量细胞，但由于细胞数少，无法进行传代；单用胶原酶Ⅰ消化5小时和8小时以及用胶原酶Ⅰ和胰蛋白酶联合消化均未见到贴壁生长的细胞。结论HUASMC原代培养贴块法较酶解法简便经济且成功率较高。     

基质金属蛋白酶与椎间盘退变研究的新进展

<正>基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是结构中含有金属离子Zn2+、Ca2+的蛋白水解酶,是分解细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的蛋白酶中最重要的一类,可以降解除多糖外几乎所有ECM成分。从40多年前     

旋转反应器胶原支架的制备及复合软骨细胞修复骨软骨损伤的初步研究

目的以胶原为原料开发一种小型胶原支架材料,尝试是否适合旋转反应器来复合软骨细胞,并探讨复合细胞后修复软骨损伤的效果。方法成年猪跟腱中提取胶原,制备胶原支架,进行细胞毒性检测和生物相容性分析。将其切成1 mm~3小块,置于旋转培养器中与软骨细胞共培养,倒置相差显微镜观察细胞贴附效果。建立兔关节软骨缺损模型,编号后,将14只新西兰大白兔随机分为2组:支架材料组(n=8),兔膝关节软骨缺损区植入胶原支架材料和软骨细胞;空白对照组(n=6),不进行任何植入处理。进行HE染色后观察。结果胶原支架呈瓷白色,表面空隙均匀,无细胞毒性,生物相容性良好,但在体内降解较快。在旋转反应器中,支架可以与软骨细胞良好结合。胶原支架植入动物体内12周,虽未完全修复缺损,但已有少量软骨细胞在缺损处出现,修复效果优于对照组。结论制备的胶原支架复合软骨细胞短期内有一定的修复软骨缺损的能力,长期效果欠佳,可能与胶原支架在体内过快降解有关,尚需对制备方法进行改进。     

两种交联剂制备软骨细胞移植支架的比较

目的：试用两种交联剂对小牛真皮基质来源的支架材料进行交联,比较支架的细胞毒性、结构、生物相容性和细胞贴附的差异,为在体动物试验提供实验依据。方法将脱细胞真皮基质分为两组,分别浸入0.05%戊二醛溶液和0.2%水溶性交联剂进行交联,MTT 法检测细胞毒性和溶血率。将交联后的支架分别植入大鼠皮下,评价生物相容性。以排液法粗测孔隙率,并在电镜下观察支架的结构和孔隙大小。培养间充质干细胞并贴附于两种方法处理的材料表面,电镜下观察贴附情况。结果以戊二醛溶液和水溶性交联剂两种方法处理的支架细胞毒性检测均合格,溶血率分别为4.61%与2.97%,均符合国家标准。经戊二醛交联的支架生物相容性差,炎症反应始终存在,水溶性交联剂处理的真皮基质组织相容性较好,仅有轻微的炎症反应。水溶性交联剂制备的支架材料孔隙率为84.3%±5.0%,戊二醛制备的支架材料孔隙率为79.7%±10.8%,差异不具有统计学意义（P >0.05）。戊二醛交联的支架细胞贴附差,而水溶性交联剂制备的支架细胞贴附良好。结论应用水溶性交联剂处理的支架细胞毒性和溶血率检测均合格,具有良好的生物相容性、孔隙率和细胞贴附性,该法可以作为后期制备软骨细胞移植支架的交联方法。     

联合应用软骨再生支架与突变型HIF-1α修饰BMSCs分泌的外泌体对晚期软骨缺损修复的促进作用

目的：探讨突变型低氧诱导因子1α（HIF-1α）修饰骨髓间充质干细胞（BMSCs）分泌的外泌体对软骨细胞的保护作用,阐明其联合软骨再生支架促进晚期软骨缺损修复的可能机制。方法：采用超速离心法从野生型HIF-1α和突变型HIF-1α修饰的BMSCs中分别提取外泌体（BMSCs-Exo^WT与BMSCs-Exo^MU）,同时对其进行鉴定。在体外,采用白细胞介素1β（IL-1β）诱导软骨细胞发生炎症反应,分别将等量PBS、BMSCs-Exo^WT（80 mg·L^-1）和BMSCs-Exo^MU（80 mg·L^-1）分别与炎症反应下的软骨细胞共培养,实验分为空白组、炎症组、BMSCs-Exo^WT组和BMSCs-Exo^MU组,利用Hoechst33342染色检测各组软骨细胞凋亡小体数目;应用Western blotting法检测各组软骨细胞中AKT/p-AKT、ERK/p-ERK和p38/p-p38表达水平。12只新西兰兔随机分为4组,建立兔膝关节软骨缺损模型,分别将等量的生理盐水、支架+生理盐水、支架+BMSCs-Exo^WT和支架+BMSCs-Exo^MU作用于4组兔软骨缺损处。术后6周取材,通过大体观察、苏木素-伊红（HE）染色和蕃红O-固绿染色观察和比较各组软骨缺损的修复效果。结果：成功提取并鉴定BMSCs-Exo^WT与BMSCs-Exo^MU,电镜观察外泌体形态为近圆形,直径为40~100nm;Western blotting法显示两者分别表达特异性蛋白CD63和CD81。在体外实验中,炎症环境下BMSCs-Exo^MU组软骨细胞凋亡小体数目低于炎症组和BMSCs-Exo^WT组（P<0.01）;Western blotting法,BMSCs-Exo^MU组和BMSCs-Exo^WT组软骨细胞中p-ERK1和p-ERK2水平低于炎症组（P<0.05）,p-AKT和p-p38水平高于炎症组（P<0.05）;且BMSCs-Exo^MU的作用强于BMSCs-Exo^WT（P<0.05）。在兔膝关节晚期软骨缺损模型中,支架+BMSCs-Exo^MU组缺损处修复效果优于空白组、支架组和支架+BMSCs-Exo^WT组。结论：软骨支架与BMSCs-Exo^MU共同作用于软骨缺损处可促进缺损修复。