兔眼结膜上皮细胞体外培养治疗结膜缺损实验研究

目的探讨体外分离培养结膜上皮细胞治疗结膜缺损的方法。方法新西兰大白兔10只,右眼(10眼)为实验组,左眼(10眼)为对照组。术前2周取右眼穹隆部结膜1mm×1mm剪成0.5mm×0.5mm后种植于羊膜上体外培养;术中切除鼻侧结膜组织,实验组将结膜上皮植片移植于结膜创口,对照组结膜创口暴露。观察结膜上皮细胞的生长特性。结果接种在羊膜上的结膜组织,6天左右融合成膜状,细胞为复层上皮细胞。术后实验组角膜透明,结膜移植片与周围组织完全融合,未发生排斥反应;对照组为瘢痕性愈合。结论体外分离培养结膜上皮细胞是治疗结膜缺损的一种理想的好方法。     

人眼结膜上皮细胞体外培养治疗翼状胬肉

目的 探讨体外分离培养结膜上皮细胞治疗翼状胬肉的方法.方法 将126例翼状胬肉患者(均为单眼患者)随机分为2组.治疗组58例,术前2周取其穹隆部结膜(1mm×1mm)剪成0．5mm×O．5mm大小后种植于羊膜上体外培养,术中逆行切除胬肉组织,再将培养好的结膜上皮植片移植于结膜创口,缝合固定.对照组68例,单纯切除翼状胬肉,暴露角巩膜缘.两组术后均行妥布霉素眼膏及滴眼液治疗,预防感染.结果 接种在羊膜上的结膜组织,8d左右融合成膜状,细胞为复层上皮细胞.植片3d后开始呈透明或半透明状,1周时可见新生血管长入,植片与周围结膜逐渐融合,2周左右植片与周围结膜完全融合.术后随访1～2年.治疗组复发2例(3．45％),对照组复发23例(33．82％),两组问复发率差异显著,有统计学意义(x2=16．3．P<0．01).所有患者眼球活动自如,未发生睑球粘连、疤痕增生等并发症.结论 体外分离培养结膜上皮细胞治疗翼状胬肉是一种理想的方法.     

人、兔结膜上皮细胞的原代培养

目的探索结膜上皮细胞体外培养的最佳方法，研究其生长特性，为毒理实验及体外结膜上皮移植提供基础。方法分别用3种培养方法：(1)组织块培养法；(2)混合肖化法；(3)组织块消化后贴壁法来培养人、兔的结膜上皮细胞，观察细胞状态、不同部位的长生特性等，并尝试在羊膜、饲细胞层上培养建系。结果3种培养方法中，组织块培养法能获得较纯的结膜上皮细胞但生长缓慢，消化法能获得大量细胞，生长较快，但常常混有其它杂细胞，组织块消化后贴壁法获得细胞量较少。观察到来自兔、睑结膜及穹隆部结膜上皮的细胞生长速度较快，细胞量多，来自球结膜的细胞生长较慢。应用间接免疫荧光染色，人结膜上皮细胞K13染色阳性。结论组织块培养法及混合消化法皆能培养结膜上皮细胞，各有利弊。     

兔口腔黏膜上皮细胞羊膜种植及生物学特性研究

目的研究羊膜作为载体种植兔口腔黏膜上皮细胞的可行性及生物学特征，探索眼表重建良好和来源丰富的移植材料和方法。方法将兔口腔黏膜上皮细胞种植于去上皮羊膜基底膜进行体外培养扩增。倒置显微镜观察细胞在羊膜上的动态生长过程，将培养获得的复合上皮片作常规病理切片HE染色和透射电镜观察。采用AE5单克隆抗体鉴定培养组织中有无角蛋白3表达。结果免口腔黏膜上皮细胞在去上皮羊膜基底膜面能黏附生长并增殖，体外培养3周左右即可在羊膜上汇合成片并分层。形成的复合组织由羊膜基底膜和较扁平的2～3层上皮细胞组成，基底层细胞与羊膜之间有半桥粒连接，细胞之间可见桥粒连接，细胞表达角蛋白3。结论兔口腔黏膜上皮细胞在去上皮羊膜上体外培养扩增能获得类似于角膜上皮的复层组织，为解决眼表重建供体来源不足的现状带来了新的希望。     

兔眼结膜上皮细胞和成纤维细胞的培养及冻存

目的 探讨体外培养兔眼结膜上皮细胞和成纤维细胞的最佳方法,为进一步研究结膜的生物学特性和结膜重建提供基础。 方法 分别用组织块法培养结膜上皮细胞和混合消化法培养结膜基质细胞,用倒置显微镜观察其生长方式和形态特征;收集第2代细胞,-80℃冻存。结果 兔眼结膜上皮细胞和上皮下成纤维细胞可以在体外成功培养,结膜上皮细胞呈圆形或多角形,成纤维细胞呈长梭形;冻存细胞1个月后复苏成功率达80%。结论 组织块法和混合消化法培养可成功获得结膜上皮细胞和上皮下成纤维细胞。     

兔眼晶体上皮细胞体外培养的研究

目的：建立兔晶体上皮细胞体外培养模型,方法：采用组织块培养法,对兔眼晶体前囊膜进行培养,并利用形态学检查方法和兔疫组化技术鉴定。结果：组织块接种24h后即可见细胞生长,且保持上皮细胞形态,1周左右细胞融合,在体外可传到7例,5代以后细胞呈成纤维细胞状,α-晶体蛋白间接免疫荧光试验呈阳性反应,结论：成功地建立晶体上皮细胞体外培养模型,可用于后发 白内障发病机制的研究。     

不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的比较研究

目的比较不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的效率，确定体外培养兔结膜上皮细胞的最佳方法，建立兔结膜上皮细胞系，为进一步研究结膜上皮干细胞的鉴别、定位及其增殖分化提供基础。方法分别采用DispaseⅡ消化法、组织块培养法、胰酶／EDTA混合消化法获得兔结膜上皮细胞后进行体外培养，在不同时间观察细胞的形态，并应用免疫组化的方法进行细胞鉴定。结果组织块培养法细胞生长较慢，胰酶／EDTA混合消化法容易有成纤维细胞等污染，DispaseⅡ化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞，细胞生长增殖快，免疫荧光pan-cytoeratin染色阳性．部分细胞MUC5AC染色阳性。结论DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的最佳方法。     

纤维蛋白胶体外重建兔角膜上皮的实验研究

目的利用组织工程技术体外重建角膜上皮组织,为重建角膜表面提供良好的移植材料和方法。方法以等量凝血酶和纤维蛋白原作用生成的纤维蛋白胶为载体(实验组),种植兔角膜缘组织块,体外培养重建角膜上皮层,每天记录细胞生长覆盖面积,从生长特性、光镜特征、超微结构特点以及免疫细胞化学方面进行观察检测。结果角膜缘上皮细胞在纤维蛋白胶上黏附生长增殖,体外培养7d左右即形成单层上皮细胞,2周左右形成的复层上皮细胞与纤维蛋白胶构成角膜上皮组织经检测与生理状态下的角膜上皮组织相近。实验组与对照组(置盖玻片为载体)比较细胞生长覆盖面积第4天至第7天差异有显著性(P<0.05)。结论以纤维蛋白胶为载体,体外培养的角膜上皮组织片可作为眼表重建角膜上皮移植良好的来源。     

兔包皮来源的上皮细胞与人来源脱细胞羊膜基质(HAAM)组织工程共同培养细胞层片的体外研究

 目的  探讨兔包皮来源的上皮细胞与人来源脱细胞羊膜基质(human acellular amniotic membrane matrix,HAAM)组织工程共同培养细胞层片的效果。方法  将兔包皮来源的上皮细胞接种于实验组(脱细胞羊膜基质)和对照组(未脱细胞的羊膜上基质)上,待细胞在两种羊膜基质上生长至铺满表面,用活细胞示踪剂标记细胞,然后通过组织学观察上皮细胞在两种羊膜基质上的黏附及生长情况。结果  包皮来源的上皮细胞在两组羊膜基质上均能增殖生长,细胞呈单层生长,活细胞示踪剂显示细胞生长良好,并具有活细胞功能。结论  包皮来源的上皮细胞是良好的实验室组织工程化的种子细胞,脱细胞羊膜基质是良好的组织工程化尿道支架材料,该方法可成功培养上皮细胞层片,有望用于尿道重建。     

酶消化组织块法培养人牙髓细胞

目的建立用酶消化组织块培养人牙髓细胞的方法。方法用酶消化组织块进行人牙髓细胞体外培养,倒置显微镜和透射电镜分别观察牙髓细胞形态、生长情况和超微结构,取第5代牙髓细胞测定生长曲线、免疫组化法鉴定组织来源,并检测其矿化能力。结果用酶消化组织块培养的人牙髓细胞成纤维细胞样,接种4天大部分组织块能有效贴附于培养瓶壁,第7天可见组织块边缘有细胞延展生长,第14天复层生长,呈网状,可顺利传代;牙髓细胞抗波形蛋白染色阳性,抗角蛋白染色阴性;细胞I型胶原染色阳性,连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节,符合牙髓细胞的形态学特征和生物学特性。结论酶消化组织块培养人牙髓细胞方法简单可行,具有较高的成功率。     

大鼠Tenon''''s囊成纤维细胞体外培养及生长特性的研究

目的 探讨建立体外大鼠Tenon’s囊成纤维细胞的培养方法，并对体外培养的Tenon’s囊成纤维细胞的生长特性进行观察。方法 选用健康年幼的SD大鼠40只，采用断颈法将其处死，摘除眼球，无菌条件下，分离剪下Tenon’s囊组织，采用植块法对Tenon’s囊成纤维细胞进行体外培养；通过细胞形态学观察和细胞免疫组化染色技术对其细胞性质进行鉴定；通过细胞记数和MTT法对其生长特性进行研究。结果 原代培养的大鼠Tenon’s囊组织块接种后，约48h即可见细胞由组织块中爬出，培养8～10d，细胞汇合程度大约可达70％左右；培养14～16d，细胞完全汇合；在细胞汇合程度达到70％-80％时，可以进行细胞传代，传代细胞接种后4—5h大部分细胞贴壁，10-12d左右传代细胞完全汇合。光镜下观察，可见Tenon’s囊成纤维细胞，在汇合程度低时细胞呈细长梭形外观，汇合程度高时细胞可呈多边形改变。免疫组化染色可见Tenon’s囊成纤维细胞角蛋白染色阴性，波蛋白染色阳性。细胞生长曲线显示，在2—8d细胞处于对数生长期。结论 体外成功地培养了大鼠Tenon’S囊成纤维细胞，这不仅为青光眼滤过泡瘢痕化防治的基础研究提供了一种新的细胞来源，同时为抗结膜瘢痕化药物的研究和开发提供了一种新的简便实用的细胞来源途径。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。     

新生大鼠上丘脑组织培养研究

目的探讨新生大鼠上丘脑组织培养方法,并对其在培养过程中的变化进行观察。方法取出生4 d的SD乳鼠上丘脑组织,分别在鼠尾胶原玻片、多聚赖氨酸玻片和B iocoat培养小室上进行组织培养,使用相差显微镜动态观察组织块生长情况。48 h后观察组织块贴壁率,在培养5 d时使用图像分析仪观察细胞迁移情况,测量最大迁移距离。使用乳酸脱氢酶试剂盒,测量组织培养液中乳酸脱氢酶活性的动态变化。常规HE染色形态学观察,并使用透射电镜观察组织块超微结构。结果与传统的培养载体相比,上丘脑组织在B iocoat培养小室上进行培养可以获得较高的组织贴壁率和细胞迁移距离。上丘脑组织在接种后31~5 d,其培养液中乳酸脱氢酶活性保持在较低水平。培养早期上丘脑组织块边缘出现细胞突起,胶质细胞迁移,随着培养时间延长,细胞出现凋亡,组织结构破坏。结论B iocoat培养小室是进行新生大鼠上丘脑组织培养的理想载体,接种3 d后组织生长趋于旺盛,而在2周后多数组织的生长逐渐衰退。     

兔膀胱移行上皮细胞构建组织工程尿道的初步研究

目的 探索以膀胱移行上皮细胞为种子细胞构建组织工程尿道的可行性。方法 取兔膀胱移行上皮细胞，体外培养传代后作为种子细胞与自制胶原膜体外联合培养并行裸鼠体内移植，通过对复合物扫描电镜、HE染色及角蛋白免疫组化检测，了解细胞在材料上的生长情况。结果 2h后移行上皮细胞在胶原膜上贴附生长，复合物移植体内20d后，移行上皮细胞分化成层，层厚1～5层。结论 该方法获取的膀胱移行上皮细胞是构建组织工程尿道的良好种子细胞，与胶原膜构建的复合物在体内形成了尿道类似物，有望成为替代尿道的组织工程材料。     

成人前脂肪细胞的原代培养

目的 探索人前脂肪细胞的原代培养方法。方法 取成人的腹部纯脂肪颗粒,采用原代消化细胞培养法培养出梭形细胞,对培养细胞进行形态学研究,测定生长曲线并用油红O脂肪染色法进行染色及定性。结果 培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高,经动态形态学观察、生长曲线测定及油红O脂肪染色法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞。结论 在成熟的脂肪组织中存在着可以增殖并分化成熟、形成脂肪组织的前脂肪细胞。组织工程化的脂肪组织是修复软组织缺损的最佳填充材料,该实验为脂肪组织工程的发展和应用打下了一定的基础。     

成人前脂肪细胞的原代培养

目的探索人前脂肪细胞的原代培养方法.方法取成人的腹部纯脂肪颗粒,采用原代消化细胞培养法培养出梭形细胞,对培养细胞进行形态学研究,测定生长曲线并用油红O脂肪染色法进行染色及定性.结果培养出的梭形细胞成分均一,增殖旺盛,分化率高,经动态形态学观察、生长曲线测定及油红O脂肪染色法测定,证明是功能活跃的前脂肪细胞.结论在成熟的脂肪组织中存在着可以增殖并分化成熟、形成脂肪组织的前脂肪细胞.组织工程化的脂肪组织是修复软组织缺损的最佳填充材料,该实验为脂肪组织工程的发展和应用打下了一定的基础.     

兔结膜基质诱导人骨髓间质干细胞分化的初步研究

 【目的】观察人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在保存人羊膜及兔眼表结膜基质上分化的情况。【方法】24只新西兰兔随机分为2组。实验组：培养有人MSCs的羊膜移植组，将人MSCs接种在保存人羊膜上培养4d，用5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）标记后移植到兔眼表结膜缺损区；对照组，单纯羊膜移植组。分别于移植后1，2，3，4，6和8周，摘取各组实验眼行组织学和免疫组织化学检查，组织学检查移植到兔结膜基质的MSCs的存活、形态变化以及移植局部的反应等情况；免疫组织化学检测移植到结膜基质的带有BrdU标记的细胞角蛋白3／12（CK3／CKl2）和角蛋白13（CK13）的表达。【结果】MSCs接种到羊膜后能在羊膜上生长，与羊膜共培养4d后，MSCs贴附羊膜生长迅速，组织学特征无明显改变。用羊膜负载MSCs移植到兔结膜缺损区，术后免疫组织化学检测结膜上皮层CK13表达阳性，CK3／CK12表达阴性，在重建的结膜上皮层可检测到BrdU核阳性细胞，未见异常增殖细胞。【结论】人羊膜可作为MSCs的载体，采用人羊膜负载MSCs行兔结膜移植，MSCs能在兔结膜上皮层存活并增殖。     

姜黄素抑制原代兔结膜上皮细胞增殖的实验研究

目的探讨姜黄素对原代培养的兔结膜上皮细胞增殖的影响,为预防翼状胬肉术后复发探讨新的策略。方法制备原代兔结膜上皮细胞,以不同浓度的姜黄素(0、10、20、40、60μmol/L)作用于体外培养的第3～5代结膜上皮细胞,分别于处理后24、48、72h后采用MTT法检测细胞增殖情况。此外,采用上述浓度姜黄素处理结膜上皮细胞24h后,采用流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 20μmol/L以上浓度的姜黄素可以显著抑制兔结膜上皮细胞增殖,且随浓度增加效果增强,随着时间增加抑制率显著增加(P<0.05)。此外,姜黄素作用24h后的细胞周期变化结果显示,G0/G1期细胞数量增加,细胞增殖受到显著抑制(P<0.05)。结论姜黄素能够抑制体外培养的原代兔结膜上皮增殖,姜黄素有可能作为抑制翼状胬肉术后复发的药物。