新生兔与成兔角膜缘上皮移植于纤维蛋白胶载体的实验研究

目的：利用组织工程技术体外重建角膜上皮组织，为重建角膜表面提供良好的移植材料和方法．方法：以等量凝血酶和纤维蛋白原作用生成的纤维蛋白胶为载体，分别种植新生兔和成兔角膜缘组织块．体外培养重建角膜上皮层．观察两组细胞的生长覆盖面积，t检验比较两组细胞的生长差异，并从生长特性、形态学特点及免疫细胞化学方面进行观察检测和比较。结果：两组兔角膜缘上皮细胞在纤维蛋白胶上黏附生长增殖，生长覆盖面积差异无统计学意义。体外培养7天左右即能较好地形成单层上皮细胞，2周左右形成的复层上皮细胞与纤维蛋白胶构成角膜上皮组织经检测与生理状态下的角膜上皮组织相近．结论：以纤维蛋白胶为载体、新生兔和成兔体外培养的角膜上皮组织片有些可作为眼表重建角膜上皮移植良好的来源之一。     

以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养角膜缘上皮细胞的实验研究

目的 建立以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养兔角膜缘上皮细胞的培养方法 ,观察细胞生物学特性。方法 用含5%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养液对兔角膜缘上皮细胞进行体外组织块法原代培养,待细胞形成单层后,传代种植于去上皮浅层角膜载体上。每天用倒置显微镜观察培养细胞的形态及生长情况,电镜观察培育细胞的超微结构并采用HE染色和抗增殖细胞核抗原（anti-proliferating cell nuclear antigen,PCNA）单克隆抗体免疫细胞化学染色对生长于去上皮浅层角膜载体上的细胞进行检测。结果 原代培养时,48小时后可见组织块边缘有细胞生长游出,10天左右,细胞汇合成单层。传代种植于载体上,细胞24小时贴壁伸展,第5天可见部分区域细胞逐渐融合成片,11天左右细胞形成良好单层。细胞呈卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接;免疫细胞化学染色显示部分细胞PCNA单克隆抗体呈阳性反应。结论 含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液适合角膜缘干细胞的体外培养,并能成功地在去上皮角膜浅层载体上培养出类似生理状态下的角膜上皮细胞。     

去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的实验研究

目的探讨去上皮羊膜上培养兔角膜缘干细胞的可行性。方法取小块兔角膜缘组织,采用组织块 细胞悬液共培养,待细胞长至对数生长期,分别传代于去上皮羊膜和完整羊膜,甲基偶氮蓝比色(MTT)法对比两组细胞增殖率,并行AE_5免疫鉴定。结果原代细胞接种7d左右,生长至对数生长期,细胞融合成单层。去上皮羊膜组细胞传代培养效果明显优于完整羊膜组。AE_5单克隆抗体染色强阳性。结论去上皮羊膜上培养出的兔角膜缘组织既有角膜上皮特性,又具有强的增殖潜力。     

以纤维蛋白为基质网架的组织工程角膜上皮的构建

目的：应用组织工程技术以纤维蛋白为基质网架、角膜缘干细胞为种子细胞构建组织工程角膜上皮，为角膜上皮移植提供新的移植材料。方法：将20 g•L^-1的纤维蛋白原溶液和含有10 U•mL^-1凝血酶的催化剂溶液混合构成纤维蛋白基质网架，检测支架材料的一般结构和超微结构；取2 mm×2 mm角膜缘组织，胰蛋白酶消化后移至纤维蛋白胶上培养，观察角膜上皮干细胞的生长情况，2周后进行形态学、超微结构和免疫组织化学观察。结果：纤维蛋白基质网架柔软有伸拉性，孔径70～108 μm，平均三维空孔率为70.4%；扫描电镜下呈多层次网络状；接种36 h后，细胞从组织块边缘迁移，7 d后细胞几乎铺满整个培养板孔底，14 d左右细胞与纤维蛋白胶体形成复合植片。透射电镜下观察仍维持上皮细胞特有的超微结构特征。抗细胞角蛋白K3单克隆抗体AE5和抗p63的单克隆抗体4A4免疫组织化学染色均为阳性。 结论：纤维蛋白可作为角膜上皮干细胞移植的良好支架材料，可为组织工程角膜上皮提供新的移植材料。     

复式滋养层培养法构建组织工程化小鼠角膜上皮的实验研究

目的 探讨构建组织工程化小鼠角膜上皮的理想方法.方法 在Transwell气液界面培养系统中,利用复式滋养层培养法构建组织工程化小鼠角膜上皮,HE染色进行组织学观察,分别利用RT-PCR、Western blot以及免疫荧光法检测上皮祖细胞标记p63、角蛋白19(K19)以及分化标记被膜素(involucrin)的表达.结果 复式滋养层培养法构建可成功小鼠角膜上皮,上皮层数达5～7层.与RT-PCR和Western blot结果一致,免疫荧光结果显示上皮基底细胞层和基底细胞上层表达p63和K19,角膜上皮全层均表达involucrin.结论 复式滋养层培养法可保持培养细胞的干细胞性质,是构建组织工程化小鼠角膜上皮的理想方法.     

兔关节软骨细胞在纤维蛋白胶中体外培养

目的：研究关节软骨细胞在纤维蛋白胶中三维培养时的表现。方法：（１）通过硫酸铵沉淀法从兔血液中提取纤维蛋白原并制备纤维蛋白胶;（２）在纤维蛋白胶凝成的纤维蛋白中立体培养关节软骨细胞,观察其表现并测定生长曲线、倍增时间;（３）通过透射电镜、ＡＢ－ＰＡＳ染色、Ⅱ型胶原免疫组化检查等,了解细胞生长及软骨基质的分泌情况。结果：（１）关节软骨细胞在纤维蛋白中大部分保持卵圆形、小部分如贴壁细胞状;（２）细胞倍增     

新鲜人羊膜负载构建兔角膜上皮

目的新鲜人羊膜负载构建兔角膜上皮,为全角膜组织工程作基础。方法采用组织块法培养兔角膜缘干细胞,以新鲜人羊膜为载体,形成单层细胞膜片后用于传代;采用相差显微镜进行形态观察及AE5、p63免疫荧光鉴定。结果培养24h,兔角膜缘组织块边缘可见有细胞长出,之后形成“沙滩样”移形带,培养至7～8d细胞在羊膜上形成单层膜状,细胞透明,边缘整齐,形态呈多样化,以卵圆形和多边形为主;AE5抗体、p63抗体染色阳性细胞比例分别为（41．72±11．35）％、（21．57±6．36）％;2代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较,无显著性差异（P〉0．05）;3代AE5和p63阳性细胞比例与原代比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;但4代AE5阳性细胞比例又明显升高。结论以新鲜羊膜为载体、采用组织块法培养角膜缘干细胞可获得较好的角膜上皮片,在传代细胞中,3代细胞分化程度最低、增殖能力最强,最适合移植。     

兔角膜上皮体外培养及其生物学特性的研究

应用组织培养技术对兔角膜上皮进行了研究,观察了其形态、生物学特性及超微结构,对影响上皮生长的某些因素进行了讨沦。结果表明:组织块培养及角膜基质对上皮的生长有促进作用。细胞群体平均倍增时间17.60±4.51h((?)±s),细胞平均直径24.20±3.85μm((?)±s),平均密度2174.10个/mm~2。光镜及电镜显示培养的细胞与正常活体内的细胞相似,可代替活体内的细胞用于多方面的研究。     

角膜上皮损伤引起复发性角膜上皮糜烂12例分析

目的 分析角膜上皮损伤引起复发性角膜上皮糜烂的临床特点.方法 回顾分析2010年9月13日-2012年4月23日我院眼科门诊就诊12例角膜上皮损伤引起复发性角膜上皮糜烂病例的临床资料.结果 12例患者中,男5例,女7例,年龄25～59岁,角膜损伤距离首次角膜上皮糜烂发作时间4～18个月.患者主要症状表现为无原因突然发病,无特定时间,患眼出现刺痛、异物感、畏光流泪等,裂隙灯检查可见角膜上皮缺损,角膜上皮糜烂复发1～5次.本组病例均通过保守治疗治愈,愈合时间3～7天,角膜未遗留瘢痕.结论 外伤性角膜上皮损伤可引起复发性角膜上皮糜烂,虽然病情反复发作,但可通过药物治疗治愈,预后良好.     

兔晶状体上皮细胞的体外培养

目的：建立兔晶状体上皮细胞（RLEC）体外培养的模型。方法：采用组织块培养法，对兔晶状体前囊膜进行培养，并利用形态学检查方法鉴定。流式细胞仪检测细胞周期。结果：组织块接种72小时后可见细胞生长。且保持上皮细胞形态，12-14天细胞融合，体外传代5代以后，细胞呈纤维化生长，细胞周期分析提示体外培养的RLEC保持正常的增殖能力。结论：组织块培养法能在体外成功培养兔晶状体上皮细胞，可用于白内障术后前囊膜及后囊膜混浊发生机制的研究。     

兔眼结膜上皮细胞体外培养

目的 探讨体外分离培养结膜上皮细胞的方法。方法 兔眼结膜上皮组织,用组织块培养法,分别种植于培养皿及处理过的羊膜上,培养2周,观察结膜上皮细胞的生长特性。结果 接种在培养皿的结膜上皮8天左右组织块之间可融合成膜状,细胞为单层上皮细胞。接种在羊膜上的结膜组织,生长较快,6天左右组织块之间可互相连接,融合成膜状,细胞为复层上皮细胞。免疫组化鉴定,结膜上皮细胞CK13染色阳性。结论 组织块培养法是结膜上皮细胞培养的较好方法,种植在羊膜上可获得复层上皮细胞。     

表皮生长因子对培养的兔角膜上皮细胞的影响

目的 :探讨表皮生长因子 (epiderm al growth factor,EGF)对兔角膜上皮细胞的影响 ,观察活体细胞生长状况和细胞内超微结构的变化。方法 :兔角膜上皮体外培养技术及组织学检查方法。结果 :接种后 2 40 h角膜上皮细胞总数实验组 (培养液中加 EGF)为 (8.96± 0 .5 6 )× 10 5 ,对照组为 (7.44± 0 .6 4)× 10 5 ,二者差异显著 ,P <0 .0 1。结论 :EGF对角膜上皮细胞有显著的促进增殖的作用     

Biocompatibility Studies on Fibrin Glue Cultured with Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Vitro

By culturing bone marrow mesenchymal stem cells of rabbits with fibrin glue in vitro,the biocompatibility of fibrin glue was investigated to study whether this material can be used as scaffolds in bone tissue engineering. After 2-months old New Zealand rabbits had been anesthetized, about 4--6 ml of bone marrow were aspirated from rabbit femoral trochanter. The monocytes suspension was aspirated after bone marrow was centrifuged with lymphocyte separating medium and cultured primarily. Then the cells were divided into two groups: one was cultured with complete medium and the other with induced medium. The cells of the two groups were collected and inoculated to the culture plate containing fibrin glue. In the control group, cells were inoculated without fibrin glue. The implanted cells and materials were observed at different stages under a phase-contrast microscope and scanning electron microscope. MTT and alkaline phosphatase (ALP) were measured. Bone marrow mesenchymal stem cells grew on the surface of fibrin glue and adhered to it gradually. Cells light absorption value (A value) and the ALP content showed no significant difference. Fibrin glue had no inhibitory effect on cell morphology, growth, proliferation and differentiation. It has good biocompatibility and can be used as scaffold materials for bone marrow mesenchvmal stem cells in bone tissue engineering.     

兔角膜缘上皮细胞体外培养及其生物学特性的初步研究

目的：建立体外培养兔角膜缘上皮细胞的方法,观察其体外生长的生物学特性。方法：应用组织培养的方法,对兔角膜缘上皮细胞进行体外原代和传代培养,用倒置显微镜观察培养的兔角膜缘上皮细胞体外生长的特征,用苏木精-伊红染色、糖原（PAS）染色,细胞角蛋白免疫组化染色和电镜检查的方法对培养细胞进行形态学检查和鉴定。结果：兔角膜缘上皮细胞可以在体外成功的培养传代,原代培养细胞大多48h贴壁,5天后旺盛生长,15天形成单层,传代培养细胞次日贴壁10天形成单层。细胞角蛋白AE1单克隆抗体染色阳性,PAS染色阴性,培养细胞呈多角形,细胞表面具有丰富的微绒毛,细胞之间有桥粒连接,结论：应用组织培养的方法可以成功获得原代和传代培养的兔角膜缘上皮细胞,培养的细胞具有与正常兔角膜上皮细胞相一致的生物学特性。     

纤维蛋白胶在乳腺癌根治术中的作用

目的 :探讨纤维蛋白胶在乳腺癌根治术中的应用价值。方法 :将乳腺癌患者 4 3例 ,随机分为两组。一组 (2 3例 )行常规乳腺癌根治术 ,另一组 (2 0例 )行常规乳腺癌根治术同时在手术创面应用纤维蛋白胶 ,通过观察术后第 1天负压吸引的引流量及术后总引流量、皮下积液情况来确定纤维蛋白胶在乳腺癌根治术中的有效性。结果 :应用纤维蛋白胶组术后第 1天引流量及术后总引流量分别为 (4 5 .5± 2 1.3) ml和 (2 2 4 .8± 87.3) ml,对照组术后第 1天引流量及术后总引流量分别为 (10 2 .6± 4 3.7) ml和 (4 83.2± 14 3.5 ) ml,具有非常显著性差异 (P<0 .0 1)。应用纤维蛋白胶组术后皮下积液有 2例 ,而对照组有 10例 ,两组间也具有显著性差异 (P<0 .0 5 )。结论 :乳腺癌根治术中应用纤维蛋白胶可以有效减少术后引流量 ,降低皮下积液发生率 ,有利于切口愈合     

生物胶治疗复发性气胸的临床效果观察

目的:了解生物胶对复发性气胸的治疗效果.方法:2003年1月-2008年1月对我院住院就诊的58例复发性气胸患者为研究对象,分为观察组与对照组.观察组接受生物胶治疗,对照组接受胸腔闭式引流治疗.结果:观察组的总有效率为90%,对照组的为67.86%,二者比较,差别具有统计学意义.观察组胸穿次数、总抽气量均低于对照组(P<0.05),观察组肺复张时间比对照组短(P<0.05).结论:生物胶治疗复发性气胸效果好,值得在临床上推广.     

纤维蛋白胶预防腹腔术后粘连的实验研究

目的探讨新型粘合剂纤维蛋白胶预防腹腔术后粘连的效果。方法对100只成年家兔实施腹腔手术,实验组用纤维蛋白胶处理创面,对照组用生理盐水处理创面。结果实验组的腹腔术后粘连发生率明显低于对照组。结论纤维蛋白胶可有效降低腹腔术后粘连发生率。     

成年兔雪旺细胞体外培养增殖和纯化的实验研究

目的探讨从成年大白兔周围神经体外分离、纯化、培养的条件，观察雪旺细胞在体外存活、生长情况，目的在于改进雪旺细胞的体外培养条件，寻找一种较好的获取雪旺细胞的方法。方法利用成年兔发生Wallerian变性的双侧坐骨神经，剪碎至1mm的植块，经改良后反复差速贴附法进行培养，应用b-FGF刺激SC增殖；采用相差显微镜下观察雪旺细胞状态计数和S-100细胞免疫组化染色相结合鉴定；绘制生长曲线，按照细胞倍增时间公式计算其倍增时间。结果采用发生Wallerian变性后的兔双侧坐骨神经，经改良后差速贴壁培养方法能够明显抑制成纤维细胞的生长，但对雪旺细胞的生长影响较小，可获得大量高纯度的雪旺细胞，经S-100蛋白免疫组化鉴定，雪旺细胞纯度达94％以上，细胞数量达1×10^6／mL以上；绘制其生长曲线，并计算得出体外培养的第三代雪旺细胞体外倍增时间为3d；一定浓度的b-FGF和NGF可促进雪旺细胞的增殖。结论①联合采用发生Wallerian变性后的神经、改良差速贴壁培养、b-FGF和NGF促进雪旺细胞增殖是一种较经济、简便、实用的方法，可获得较高纯度的雪旺细胞。②本培养方法能够获得大量高纯度的雪旺细胞，可作为周围神经组织工程实验研究的细胞来源。