原代人视网膜色素上皮细胞的冻存和复苏培养

目的 :观察对原代人视网膜色素上皮 (retinalpig mentepithelium ,RPE )细胞进行冻存和复苏培养的效果 .方法 :将 6只尸供眼 ,常规酶消化法分离、纯化的人原代RPE细胞 ,分为两组 ,实验组为即刻进行常规梯度降温液氮冷冻保存 ,1wk后行常规复苏培养 ;对照组为细胞直接进行后续实验 .台盼蓝拒染观察细胞存活率及生长状态 ;计算细胞贴壁率 ;初步计算克隆形成率 .结果 :RPE细胞存活率分别为试验组 (90± 7) % ,对照组 (87± 1 5 ) % ,两组相比无显著性差异(P >0 .0 5 ) ;两组接种细胞贴壁率从 2 4h开始分别为 (5 .0±3.1 ) %～ (6 1 .0± 7.3) %和 (1 5 .0± 6 .3) %～ (6 0 .0± 3.3) % ;培养 4 8h之前 ,两组之间存在统计学差异 (P <0 .0 5 ) ,4 8h之后组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ) ;培养 5 ,7和 1 0d初步克隆形成率两组分别为 (1± 0 ) % ,(1± 1 ) % ,(3± 1 ) %和 (1±0 ) % ,(3± 1 ) % ,(2± 1 ) % ,组间无显著性差异 (P >0 .0 5 ,n=3) .冻存后复苏培养的RPE细胞生长状态良好 ,增生活跃 ,与对照组类似 .结论 :对原代人RPE细胞进行冻存 ,复苏培养的RPE细胞活性、存活能力、单细胞分裂增生能力不受影响 .     

兔眼角膜、结膜成纤维细胞的培养

目的 建立眼角膜、结膜细胞体外培养的方法。方法 采用组织块培养法培养兔眼角膜基质及结膜成纤维细胞。结果 结膜成纤维细胞在培养10天以后可以形成单层细胞。眼角膜成纤维细胞在培养瓶中培养2周后可形成单层；24孔板培养3d后细胞贴壁生长旺盛，10d形成单层。结论 眼角膜、结膜成纤维细胞组织块培养法是可行的，但在24孔培养板上眼角膜成纤维细胞比在培养瓶中贴壁快而且容易生长。     

兔眼结膜上皮细胞体外培养

目的 探讨体外分离培养结膜上皮细胞的方法。方法 兔眼结膜上皮组织,用组织块培养法,分别种植于培养皿及处理过的羊膜上,培养2周,观察结膜上皮细胞的生长特性。结果 接种在培养皿的结膜上皮8天左右组织块之间可融合成膜状,细胞为单层上皮细胞。接种在羊膜上的结膜组织,生长较快,6天左右组织块之间可互相连接,融合成膜状,细胞为复层上皮细胞。免疫组化鉴定,结膜上皮细胞CK13染色阳性。结论 组织块培养法是结膜上皮细胞培养的较好方法,种植在羊膜上可获得复层上皮细胞。     

鼓膜上皮细胞和成纤维细胞的培养与鉴定

目的:探讨如何以简便快速的方法获得可以用于组织工程鼓膜构建的高纯度的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞.方法:分离新生豚鼠的鼓膜组织,利用本实验建立的两步组织块培养法获得纯化的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞,倒置显微镜观察细胞生长状态,免疫组织化学染色鉴定细胞来源.结果:用该方法可以获得纯化的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞,细胞产量大,纯度高,鼓膜上皮细胞细胞具有典型的铺路石样形态,成纤维细胞呈梭形生长.结论:本实验所建立的两步组织块培养法可以获得大量高纯度的鼓膜上皮细胞和成纤维细胞以用于组织工程鼓膜的构建.     

HL60细胞冻存复苏生物学特性对比分析

目的探讨不同冻存复苏条件对白血病细胞株HL60生物学特性的影响,并优化培养方法与条件。方法对比不同浓度DMSO冻存条件、不同复苏方法对复苏后细胞生物学特性的影响,并确定培养液血清最佳浓度。结果采用5%DMSO冻存防护效果好于其他组,改良后细胞的复苏存活率明显高于传统复苏方法。结论以5%DMSO作为HL60细胞冻存保护剂并采用改良复苏方法,可使细胞保持最佳生物学特性,12%血清为HL60细胞常规培养的最适浓度。     

兔外周血间充质干细胞的分离培养及冻存

目的建立兔外周血间充质干细胞（MSCs）体外分离培养及冻存的方法。方法用密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化兔外周血MSCs，MSCs经液氮冻存半年复苏，观察细胞冻存前后的生长状况，并用台盼蓝法测定其存活率。结果MSCs于体外培养2h开始贴壁生长，细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等。传代MSCs变为形态均一、排列有序的长梭形细胞，增殖活跃；MSCs经6mo冻存后复苏培养，台盼蓝法计数存活率达95％以上，细胞形态及生长状况与冻存前无明显差别，均呈长梭形，细胞生长增殖旺盛。结论采用密度梯度离心法和贴壁法可以有效获得应用G-CSF动员后的外周血MSCs，且细胞纯度高，生长增殖活性好，采用液氮冻存MSCs的方法十分有效可行。     

小鼠睾丸间质细胞培养及冻存与复苏的初步研究

目的优化睾丸间质细胞培养条件与方法,观察不同冻存复苏条件对细胞生物学特性的影响。方法选用昆明雄性小鼠,处死取出睾丸,采用0.25%胰蛋白酶、0.05%胶原酶二步酶消化法结合低速离心分离间质细胞,置于34℃,5%CO2的培养箱培养,用3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-HSD)染色对所培养的间质细胞进行鉴定。原代培养细胞经传代、冻存与复苏,倒置显微镜观察细胞的形态特征和存活率。结果分离培养的间质细胞纯度达90%,采用逐步降温法和使用DMSO为冻存剂细胞复苏率较高。结论采用二步酶消化法与低速离心法分离培养的间质细胞纯度高,为研究和建立睾丸间质细胞体外培养体系提供技术方法和实验依据。     

HEK-293细胞复苏培养及冻存

目的通过对人胚肾293细胞的复苏培养及其冻存的研究,为进一步行干细胞标记实验奠定基础。方法复苏培养人胚肾293细胞,倒置显微镜观察人胚肾293细胞的生长状况,计算细胞贴壁率,绘制细胞生长曲线,冻存保留细胞。结果人胚肾293细胞在普通培养条件下生长良好,6h后大部分细胞已经贴壁,8h细胞已完全贴壁。结论人胚肾293细胞采用改进方法复苏培养及冻存是简便可行的,为进一步行干细胞标记实验奠定了坚实的前期基础。     

正常人关节软骨细胞的培养及冻存复苏的影响

目的观察正常人关节软骨细胞的体外培养及冻存后再复苏对人体关节软骨细胞活性所产生的影响。方法在无菌条件下取因创伤所致离断且无再植条件残肢的关节软骨组织,采用Ⅱ型胶原酶一次消化的方法获取原代软骨细胞后进行体外培养,并经10%DMSO冻存液冻存及常规复苏,过程中均用倒置显微镜定期观察软骨细胞的形态生长变化以及复苏后细胞的存活率。结果常规消化传代后的第2～4代间贴壁时间无明显差别,但较原代明显变短,生长速度加快,在形态上仍以三角或多角形为主,传代在5代以内的软骨细胞仍能保持正常的组织学形态,且复苏后软骨细胞的存活率能达95%。结论原代培养获得的正常人体关节软骨细胞在5代以内者可以较好地保留软骨细胞的特性和活性。     

细胞组织冻存方法的改进

体外细胞培养作为重要的实验细胞学手段在生命科学研究的众多领域中已广泛应用。目前,选择液氮作制冷源深低温保存肿瘤细胞已得到普遍认同。我们在传统方法基础上改进了细胞冻存方法,在实际应用中取得了满意效果,现将体会介绍如下。1　细胞冻存方法的改进以膀胱癌EJ细胞为例,人膀胱癌EJ细胞培养在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中,取对数生长期的贴壁细胞,0.25%胰蛋白酶消化3～4min后,用上述培养液进行终止消化,计数细胞数,收集细胞悬液于10ml离心管内,1000r/min离心10min,弃上清,保留细胞。同时配制含10%的冻存保护剂二甲基亚砜(DMSO…     

不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的比较研究

目的比较不同方法体外培养兔结膜上皮细胞的效率,确定体外培养兔结膜上皮细胞的最佳方法,建立兔结膜上皮细胞系,为进一步研究结膜上皮干细胞的鉴别、定位及其增殖分化提供基础。方法分别采用DispaseⅡ消化法、组织块培养法、胰酶／EDTA混合消化法获得兔结膜上皮细胞后进行体外培养,在不同时间观察细胞的形态,并应用免疫组化的方法进行细胞鉴定。结果组织块培养法细胞生长较慢,胰酶／EDTA混合消化法容易有成纤维细胞等污染,DispaseⅡ化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞,细胞生长增殖快,免疫荧光pan-cytoeratin染色阳性．部分细胞MUC5AC染色阳性。结论DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的最佳方法。     

兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究

目的:建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法,并观察其体外生长的生物学特性。方法:采用消化法、组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养,分别测定细胞分裂指数及细胞贴壁率,MTT比色法测定细胞生长曲线。结果:两种方法培养的细胞在原代、第1代形态相似,消化法培养的细胞代数维持低于组织块法;对数生长期时,组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛(P<0.05);在16 h后,消化法培养的细胞贴壁率低于组织块培养法(P<0.05)。结论:选择组织块培养法培养兔角膜上皮细胞可获得状态良好的连续传代扩增的细胞,且具有经济实用性;角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。     

兔角膜上皮细胞体外原代培养方法的研究

目的：建立体外原代培养兔角膜上皮细胞简单经济实用的方法，并观察其体外生长的生物学特性。方法：采用消化法、组织块培养法培养兔角膜上皮细胞并进行传代培养，分别测定细胞分裂指数及细胞贴壁率，MTT比色法测定细胞生长曲线。结果：两种方法培养的细胞在原代、第1代形态相似，消化法培养的细胞代数维持低于组织块法；对数生长期时，组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛（P〈0．05）；在16h后，消化法培养的细胞贴壁率低于组织块培养法（P〈0．05）。结论：选择组织块培养法培养兔角膜上皮细胞可获得状态良好的连续传代扩增的细胞，且具有经济实用性；角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。     

腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因体外转染兔结膜上皮细胞

目的:研究2型重组腺相关病毒( recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP) 对体外培养兔结膜上皮细胞的转染和表达情况,为后续研究提供依据。方法:体外培养兔结膜上皮细胞,rAAV2-EGFP 按感染复数(multiplicity of infection ,MOI)为104、105、106 转染第2代兔结膜上皮细胞,转染后第1 、3 、5 、7日倒置荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况,计算转染率。MTT方法检测rAAV2-EGFP转染对细胞增殖的影响。结果:随着MOI值增大及转染时间延长,EGFP 表达效率逐渐增高,转染后第7～8日达到高峰并维持。MTT检测各MOI组与对照组差别无统计学意义。结论:rAAV2载体可以介导EGFP 基因高效稳定转染兔结膜上皮细胞,并且对细胞增殖无影响。     

Expression of Connexin43 in Rat Epithelial Cells and Fibroblasts

To explore the role of connexin43 (Cx43) in gap junctional intercellular communication (GJIC) and propagated sensation along meridians, the expression of Cx43 in the rat epithelial cellsand fibroblasts was studied both in vitro and in vivo. With the in vitro study, the rat epithelial cells and fibroblasts were cultured together, and the localization of Cx43 was detected by immunohistochemistry and indirect immunofluorescent cytochemistry and under confocal microscopy . And the expression of Cx43 on the surface of the cells was examined by flow cytometry. With the in vivo examination, 20 SD rats were randomized into control group (n=10) and electrical acupuncture group (EAgroup, n=10). EA ( 0.5-1.5 V, 4-16 Hz , 30 min) was applied to “Zusanli”acupoint for 30 min at rat‘s hind paw, the localization of Cx43 was immunohistochemically detected. The immunohistochemical staining and indirect immunfluoresce.nt cytochemistry showed that Cx43 was localized on the surface of the cells and in the cytoplasm. The relative expression level of Cx43 on the cellular membrane surfaces of the rat epithelial cells and fibroblasts, as determined by FACS, were 13.91 % and 29.53 % respectively. Our studied suggested that Cx43 might be involved in GJIC and propagated sensation along meridians.     

人尿路变移上皮种子细胞的体外培养与鉴定

目的对人尿路变移上皮细胞进行原代和传代培养,探讨并建立细胞的培养体系,用于泌尿系统组织工程种子细胞的相关研究。方法采集人。肾脏手术标本的。肾盂、输尿管正常上皮组织利用组织块法,使用添加附加表皮生长因子（EGF）及牛垂体提取物（BPE）成分的角朊细胞无血清培养液（KSFM）进行细胞原代培养,用含EGF及BPE的KSFM进行传代培养。观察培养细胞的形态和增殖情况,经HE染色和免疫细胞化学sP法染色进行鉴定。结果培养制备的人尿路上皮细胞呈现典型的变移上皮细胞形态特征,原代培养9—12d时细胞汇合可达80％。免疫细胞化学染色显示细胞角蛋白（CKAE1/AE3）阳性。分离培养的为单一的人尿路变移上皮细胞,无成纤维细胞混杂。结论采用组织块法分离培养的人尿路变移上皮细胞在添加EGF及BPE的KSFM培养液中可维持良好的生物学特性,并具有一定的增殖传代能力。该培养体系所获得的细胞可用于人泌尿系统的基础研究及组织工程的进一步研究。     

人正常食管黏膜上皮细胞的纯化分离和传代培养

目的:探讨新的食管黏膜细胞的培养方法,以便能够获得大量细胞.方法:采用中性蛋白酶(Dispase)和胰酶先后消化从食管黏膜上分离上皮细胞,比较细胞在无血清培养基(K-SFM)和含100 ml/L胎牛血清的培养基中的细胞生长曲线和贴壁性;采用细胞角蛋白14、13(CK14,CK13)和波形丝蛋白抗体三者共同鉴定细胞.结果:细胞倍增时间在KSFM中为(51.5±11.5)h(n=3),而在含100 ml/L血清培养基中不能计算;在K-SFM中,贴壁细胞明显为高(P＜0.01);CK14阳性细胞百分率K-SFM组在不同时段均高,但两组内均随生长时间增加而减少;CK13阳性细胞则恰与其相反;两组中均未见波形丝蛋白阳性表达.结论:Dispase消化分离细胞,K-SFM作为培养基是食管鳞状上皮可靠的新培养方法.     

乙酰胆碱对人表皮细胞冷存的影响

目的 探讨乙酰胆碱(Ach)对人表皮细胞冷存活力的影响。方法 应用人表皮细胞的分离、培养技术。并运用MTT检测、病理切片以及电镜检测等手段进行观察。结果 不同浓度的Ach对冷存的表皮细胞均有一定的保存活力作用。其中以10^-10～10^-8mol／L的浓度为最佳。结论 Ach对冷存中的人表皮细胞有一定的保护作用，它可提高表皮细胞的保存活力。