肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素的基因克隆、表达及功能研究

目的 获得高纯度的eae基因表达蛋白紧密黏附素(Intimin),研究其黏附作用.方法 从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7全基因组中扩增出eae基因,T-A克隆后,将eae插入载体pET28a(+),并转化至E.coli BL21(DE3)中表达;用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出重组蛋白;SDS-PAGE检测目的 蛋白相对分子质量,免疫印记分析其免疫反应性,免疫荧光检测其黏附性.结果 获得了大小约2805 bp的eae片段;构建r重组载体pET28a(+)-eae,并在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达Intimin,Mr约97 000;Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化出Intimin;大肠杆菌O157:H7多抗血清在Mr约97 000处检测出一条特异性Intimin带;Intimin可黏附在HEp-2细胞表面.结论 高纯度的重组蛋白Intimin具有一定的免疫反应性,能与HEp-2细胞黏附,为进一步研究Intimin蛋白与宿主受体蛋白的相互作用奠定基础.     

大鼠ANT1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：表达和纯化大鼠腺苷酸转运体（ANT1）蛋白并制备其多克隆抗体.方法：通过PCR扩增大鼠脑组织中ANT1的编码区序列,构建ANT基因重组载pET28a-ANT1,转化至E. coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,Ni2＋-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化的ANT1蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并亲和纯化,并通过Western Blot法鉴定其特异性.结果：成功构建重组质粒pET28a-ANT1,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了Mr约为32×10^3的目的蛋白;亲和层析纯化后免疫的新西兰大白兔获得其多克隆抗体;曝光后胶片上均可见Mr32×10^3的阳性条带,与纯化的大鼠ANT1重组蛋白处于同一水平,表明纯化的抗ANT多克隆抗体具有高度的特异性.结论：利用基因重组技术,在大肠杆菌中成功表达了大鼠ANT1融合蛋白并制备了其多克隆抗体,为研究腺苷酸转运体蛋白在癫痫发病过程中的作用机制奠定了基础.     

模式抗原破伤风毒素C蛋白的克隆、表达条件优化及免疫原性初步分析

目的 获得高纯度、高免疫原性的破伤风毒素C片段(TTC)蛋白.方法 以PCR从破伤风杆菌质粒DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pET43.1a( )并导入大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达.用Ni2 NTA琼脂糖柱纯化融合蛋白,经凝血酶酶切,再用Ni2 -NTA琼脂糖柱分离目的 蛋白.SDS-PAGE和免疫印迹分析目的 蛋白的相对分子质量和抗原性,动物免疫实验鉴定其免疫原性.结果 获得1373 bp的TrC基因片段,构建成重组表达载体pET43.1a( )-TTC并在大肠杆菌中表达.TTC-Nus融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的22％,酶切后TTC蛋白可与载体蛋白有效分离,获得纯度为95.5％的TTC蛋白,该蛋白可被破伤风抗毒素识别;将TTC蛋白免疫小鼠后,免疫血清可与破伤风毒素特异性结合,三次免疫后其抗体效价可达1:25 600.结论 所获TTC蛋白纯度高,免疫原性好,为研究体内外抗原提呈、免疫应答提供了良好的模式抗原.     

幽门螺杆菌双价亚单位分子内佐剂疫苗的构建表达与纯化

目的 克隆表达幽门螺杆菌外膜蛋白烷基过氧化氢还原酶ahpC、ureB414功能片段基因,与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位构建融合基因ahpC-ureB414-ltB(aul).方法 采用重叠延伸PCR的方法,以AhpC做为融合蛋白前端,与UreB414功能片段及黏膜佐剂ltB依次串联,在片段间引入5个氨基酸的柔性Linker GGGGS进行连接;将融合基因构建在原核表达载体pET-22b( )中,经酶切及测序鉴定后转化宿主菌E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白ahpC-UreB414.ltB(AUL).融合蛋白经AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白.结果 PCR扩增出1 350 bp的目的 基因片段aul,工程菌pET22b-aul/BL21经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,相对分子质量约为50×103,与预期值一致,目的 蛋白约占菌体总蛋白的28.7%,重组蛋白用Ni2 -NTA树脂提纯.纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图像软件分析表明纯度可达85%以上.Western blot显示重组蛋白质具有良好的免疫反应性.结论 成功构建、表达融合蛋白rAUL,纯化后的融合蛋白保持各亚单位组分及佐剂的独立免疫反应性.     

重组人SMAC及SMAC-PTD的制备

目的制备重组人SMAC及SMAC-PTD.方法经RT-PCR从人HeLa细胞中扩增人野生型SMAC及SMAC-PTD cDNA,分别构建于原核表达质粒pET28a( ),测序正确后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,Ni2 -NTA层析纯化,SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白.结果RT-PCR扩增分别得到编码人SMAC及SMAC-PTD cDNA片断,测序结果正确,重组蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达.结论成功制备了高纯度的人野生型SMAC及SMAC-PTD融合蛋白,为进一步研究奠定了基础.     

HIV-1基质蛋白P17的原核表达与纯化

目的：HIV-1p17基因在大肠杆菌中高效表达并纯化目的蛋白。方法：①PCR法扩增的HIV-1p17基因片段克隆至pET28c质粒;②重组质粒分别在大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS及HMS174(DE3)中表达;③用Ni—NTA金属树脂层析法纯化目的蛋白;④用酶联免疫法和免疫印迹法检测纯化蛋白的特异性。结果：重组质粒在BL(DE3)中表达量最高,目的蛋白表达量占全菌体裂解物的32％,纯化后其纯度达95％,纯化蛋白可与p17McAb和HIV-1阳性血清发生特异反应。结论：带有HIV-1p17片段的重组质粒pET28c在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,蛋白表达量可满足其免疫、生物活性的进一步研究;用Ni—NTA金属树脂层析法纯化蛋白,方法简便,蛋白丢失少,纯度高;纯化的重组蛋白HIV-1p17可用来临床早期诊断HIV-1感染者,同时可预测患者的临床进程。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7的紧密黏附素基因eae的测序及生物信息学分析

目的 克隆编码肠出血型大肠杆菌O157:H7的紧密黏附素eae基因,并对其进行测序及生物信息学分析,为研究EHEC与宿主细胞相互作用奠定基础.方法 利用PCR技术扩增eae基因,经过纯化,将其定向插入克隆载体PMD19-T simple vector并进行测序,应用生物信息学软件分析其生物学特性.结果 用PCR方法扩增eae基因,大小为2802 bp,编码934个氨基酸,用DNAstar5.0软件分析紧密黏附素(Intimin)蛋白的生物活性,在202～210、510～520、716～735个氨基酸残基的肽链上,显示该蛋白具有良好的亲水性,在175～220、300～315、550～610、710～780、825～880个氨基酸残基的肽链上具有良好的柔韧性,在220～300、615～710个氨基酸残基的肽链上,显示该蛋白具有良好的抗原性.结论 本研究用PCR法扩增出了O157:H7的eae基因,成功构建了肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密黏附素eae基因的重组质粒,并分析了黏附素蛋白的亲水性、柔韧性、抗原性,为进一步研究大肠杆菌O157:H7黏附素的致病机制奠定了基础,为下一步表达出Intimin蛋白,进一步研究该蛋白与宿主细胞的粘附、免疫原性、抗原抗体反应提供了理论依据.     

结核分支杆菌重组蛋白rCFP-10的表达、纯化及免疫反应性分析

目的表达、纯化结核分支杆菌H37Rv株重组蛋白rCFP—10,评价其免疫反应性,为结核病血清学诊断价值研究及亚单位疫苗研制提供物质基础。方法重组质粒pET23b—CFP-10转化E．coli表达菌株BL21（DE3）pLysE,IPTG诱导重组蛋白rCFP-10表达。经SDS—PAGE电泳和Westernblotting鉴定后,优化表达条件用镍离子鳌合亲和层析柱HisTrap^TMHP纯化重组蛋白,最后用斑点金免疫渗滤法初步评价纯化蛋白的免疫反应性。结果成功构建了重组质粒pET23b—CFP-10并且重组蛋白rCFP-10以可溶性形式高效表达,表达量约占菌体总蛋白的10％。经亲和层析后得到高纯度有免疫反应性的重组蛋白（纯度约为98．5％）。结论高纯度有免疫反应性的重组蛋白rGFP-10为新型亚单位疫苗的研发及其结核病血清学诊断价值研究奠定了基础。     

HtsA表达质粒克隆和蛋白质的纯化

目的克隆HtsA重组表达质粒以获得HtsA表达蛋白。方法通过PCR方法扩增获得A组链球菌HtsA基因完整的序列,将此片段定向克隆到表达载体pET21d质粒中,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白,并运用离子交换层析和疏水层析分离纯化HtsA蛋白。结果经琼脂糖电泳证实成功克隆了重组表达质粒pET21d-HtsA,pET21d-HtsA融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达,SDS-PAGE分析表明纯化的HtsA纯度较高。结论成功构建了A族链球菌HtsA基因重组表达质粒,并纯化获得了目的蛋白HtsA。     

结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达纯化与鉴定

目的:表达和纯化RpfA融合蛋白.方法:将含有RpfA基因片段的质粒用NdeI与BamHⅠ双酶切,然后将目的基因片段克隆入pcDNA3.1 载体构建重组载体pcDNA3.1 -RpfA,测序正确后再将目的基因片段亚克隆入pET19b原核表达载体并转化E.coli DE3,IPTG诱导表达融合蛋白,Western blot鉴定融合蛋白.在变性条件下Ni2 -NTA 亲和色谱柱纯化目的融合蛋白.结果:目的基因片段测序与Genbank报道一致(切去了5'端99 bp).SDS-PAGE显示,在Mr约为80 ku处有表达条带,Western blot鉴定为(His)6融合蛋白,并与小鼠抗Rv1884和抗Rv2389免疫血清有交叉反应.可溶性分析发现融合蛋白主要以包涵体形式存在.经Ni2 -NTA亲和色谱柱纯化得到了融合有6个组氨酸残基的RpfA融合蛋白.结论:成功构建了pET19b-RpfA表达载体,并在E.coli DE3中高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白.     

羊布鲁氏菌M5株P39基因的克隆与分析鉴定

目的:从羊布鲁氏菌M5株全基因组中扩增P39基因,并对扩增产物进行序列测定与分析鉴定。方法:试剂盒法提取羊布鲁氏菌全基因组,设计特异性引物通过PCR方法扩增P39基因,将扩增产物连接到T载体(pMD19-T)的多克隆位点(MCS)中,构建成重组体(pMD19-T-P39)。将该重组体转化感受态大肠杆菌DH5(,经克隆筛选并扩增后,采用试剂盒法提取重组质粒,对该重组质粒进行酶切鉴定、序列测定并与GenBank数据库进行比对分析。结果:经PCR方法成功地从羊布鲁氏菌基因组中扩增得到了目的基因片段;酶切鉴定、序列测定与比对结果表明,该目的基因片段即是羊布鲁氏菌P39基因。结论:成功地从羊布鲁氏菌M5菌株全基因组中通过PCR扩增获得了P39基因,为后续的研究提供了可靠的基础。     

小鼠IL-35基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-35（IL-35）基因并在大肠杆菌中表达和纯化。方法用RT-PCR方法从小鼠脾脏扩增出IL-35的两个亚基Ebi3和p35的成熟肽基因片段,采用重叠PCR法将Ebi3基因和p35基因通过（Gly4Ser）3接头连接,得到的融合基因片段先克隆于pMD19-T载体,再亚克隆到表达载体pET-30b（＋）,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,Western blot检测目的蛋白,用Ni螯合层析方法纯化表达产物。结果从小鼠脾细胞总RNA中扩增出Ebi3和p35的基因片段,重叠PCR法得到的融合基因经鉴定含预期序列;构建的重组表达载体pET-30b（＋）-IL-35在BL21（DE3）中经IPTG诱导后表达出约50kd的融合蛋白;West-ern blot检测结果显示,该融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应;经Ni螯合层析方法纯化获得单一蛋白条带。结论小鼠IL-35在大肠杆菌中表达并纯化,为进一步研究其功能及应用价值奠定了良好的基础。     

羊布鲁氏菌omp25基因原核表达载体的构建与鉴定

目的:利用PCR反应从羊布鲁氏菌基因组DNA中克隆omp25基因,并将其构建到原核表达载体pET-32a中。方法:试剂盒法提取羊布鲁氏菌基因组DNA,设计合适的引物,通过PCR反应从基因组中扩增外膜蛋白OMP25的编码基因(omp25)。将得到的基因片段连接到克隆载体pMD19-T的多克隆位点(MCS)中,将连接体pMD19-T-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析与序列测定。利用酶切与连接反应将目的基因(omp25)插入载体pET-32a的多克隆位点中,将连接体pET-32a-omp25转化感受态大肠杆菌DH5(并进行筛选和克隆扩增,提取质粒并进行酶切分析。结果:PCR扩增得到的基因片段与GenBank中已公布的羊布鲁氏菌omp25基因同源性为99%。酶切分析结果表明,omp25基因成功地插入载体pET-32a中。结论:成功地扩增得到了羊布鲁氏菌omp25基因并构建了携带该基因的重组原核表达载体pET-32a-omp25,为后续的研究提供了可靠的基础。     

人可溶性TRAIL cDNA的设计、合成与克隆

目的:合成可溶性的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的cDNA,并构建其原核表达载体.方法:根据大肠杆菌密码子偏好性和表达载体多克隆位点限制性内切酶要求,设计基因拼接引物,合成TRAIL基因胞膜外段双链cDNA序列,将其连接于克隆载体pMD18-T中;将酶切、纯化的TRAIL基因与经相同处理的载体PSC相连接,转化感受态大肠杆菌JM109,筛选阳性重组子.结果:成功获得了包含TRAIL基因胞膜外段的双链cDNA序列,并成功构建了TRAIL胞膜外段原核表达载体PSC/TRAIL 111-281.结论:采用PCR的方法,实现合成寡核苷酸片段的一次性组装,方便了进一步的克隆.     

猪囊尾蚴期特异性抗原cC1的克隆与高效可溶性原核表达

目的克隆猪囊尾蚴期特异性抗原cC1基因,并进行高效可溶性原核表达。方法利用PT-PCR从猪囊尾蚴中获得cC1编码基因,T-A克隆后,将cC1插入原核表达载体pET28a中,经酶切、测序鉴定后将其转入宿主菌E.coli BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达并优化表达条件,表达的融合蛋白Ni+-亲和层析柱纯化后经快速液相蛋白层析分离系统检测其纯度。采用SDS-PAGE和Western-blotting对目的蛋白进行分析和鉴定。结果RT-PCR扩增出的片段长度为1056bp,构建的重组表达质粒经PCR、酶切验证,和预期的结果一致,测序鉴定与Genbank中cC1基因相比于423位存在1个同义突变。转化有重组质粒的E. coli BL21(DE3)经过0.05mmol/LIPTG 37℃诱导6h高效表达了占菌体蛋白总量60%的可为囊虫病患者血清识别的相对分子质量约为40000的可溶性融合蛋白,经Ni+-亲和层析柱纯化后纯度达94%。结论成功克隆并高效可溶性原核表达了猪囊尾蚴期特异性抗原cC1,为其进一步研究和应用奠定了基础。     

人肥胖基因的克隆与原核表达载体的构建

目的：克隆人肥胖基因瘦素蛋白（leptin）编码区cDNA序列，并构建其原核表达载体。 方法：在人体脂肪组织中提取mRNA，利用RT-PCR扩增人肥胖基因，将其插入pMD18-T载体，经双酶切、鉴定后将肥胖基因片段亚克隆入pET-28a表达载体，提取质粒。将阳性重组质粒转化表达受体菌E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导肥胖基因表达产物,以聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测产物蛋白。 结果：经测序证实获得的肥胖基因序列与相关文献报道一致，其表达产物的相对分子质量约为20 000。 结论：利用pMD18-T克隆载体和pET-28a表达载体可以有效地在原核生物中表达重组人类瘦素蛋白。     

人I型谷丙氨酸氨基转移酶的原核表达及抗血清的制备

目的：构建人谷丙氨酸氨基转移酶（ALT1）的原核表达载体,并用纯化的ALT1重组蛋白免疫家兔,制备ALT1抗血清．方法：从HepG2细胞中提取总RNA,RT—PCR扩增alt1基因,并将其克隆人pMD19-T载体中测序,将测序正确的目的基因克隆至PET-32a（＋）表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21（DE3）中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、WesternBlot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA,WesternBlot进行检测．结果：测序证实克隆的基因序列与GenBank中的ALT1序列相符;SDS—PAGE,Westernblot结果证实获得Mr为75×10^3的ALT1融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni^2＋亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1：100000,WesternBlot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合．结论：获得了ALT1重组蛋白及特异性多克隆抗体．     

噬菌体展示EpCAM单链抗体及免疫原性初步研究

目的利用噬菌体展示技术进行鼠抗人EpCAM单链抗体表达并鉴定其免疫活性,构建特异靶向上皮来源肿瘤细胞及癌干细胞的单链抗体。方法采用全基因合成的方法合成VL+Linker+VH的EpCAM的单链抗体(ScFv)基因,克隆到pMD19-T简易载体中,将ScFv基因酶切并纯化后克隆到噬菌体载体pCANTAB-5E,热休克法转化至感受态的大肠杆菌TG1,随机挑取5个克隆,经辅助噬菌体超感染,形成鼠抗人EpCAM噬菌体单链抗体,用ELISA(以P/N>2判定为阳性)和免疫细胞化学法测定其抗原结合活性。结果成功获得pCANTAB-5E/EpCAM ScFv重组克隆,经ELISA和免疫细胞化学测定,噬菌体展示阳性率为20%,展示的单链抗体能与EpCAM抗原和A549细胞特异性结合。结论噬菌体展示技术制备EpCAM单链抗体方法简便、省时、高效。     

TRAIL蛋白原核表达载体的构建及表达研究

目的 利用蛋白自剪切功能原核表达系统构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）胞膜外段融合蛋白表达载体，并进行表达条件优化和初步纯化。方法 设计基因拼接引物，合成TRAIL基因胞膜外段双链cDNA序列，将其连接于克隆载体pMD18-T中；将酶切、纯化的TRAIL基因与经相同处理的载体pTWIN1相连接，转化感受态大肠杆菌JM109，筛选阳性重组子。将鉴定（酶切及序列分析）阳性的重组子质粒转人大肠埃希菌ER2566表达菌中，采用蛋白质SDS—PAGE电泳方法分析不同浓度诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、不同诱导温度、不同诱导时间下目的蛋白表达情况。结果 成功获得了包含TRAIL基因胞膜外段的双链cDNA序列，酶切及序列分析证实成功构建了TRAIL胞膜外段蛋白自剪切功能原核表达载体。采用0．3mmol／LIPTG、15℃诱导过夜（14～16h），目的蛋白获得较高表达量，且大部分为可溶性蛋白。结论 采用大肠埃希氏菌ER2566，TRAIL胞膜外段融合蛋白获得高表达，经简单后续处理即可获得不含任何额外氨基酸的可溶性目的蛋白。