金盏花苷E通过ROS介导的JAK1-stat3信号途径抑制LPS诱发的炎症反应

目的探讨金盏花苷E对脂多糖（LPS）诱导炎症反应的抑制作用及可能的分子机制。方法CCK-8实验检测不同浓度（0、 2、4、6、8、10、20、25、30 μg/mL）的金盏花苷E对RAW264.7 细胞活力的影响;不同浓度的金盏花苷E（0、6、8、10 μg/mL）预处理 RAW264.7细胞2 h,然后用LPS（100 ng/mL）刺激细胞特定的时间,ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-1β释放;Western blotting检 测iNOS、COX-2的表达水平及JAK-stats、MAPKs及NF-кB信号途径的磷酸化;ROS检测试剂盒检测RAW264.7 细胞内ROS含 量;激光共聚焦实验检测转录因子stat3的核转位。结果CCK-8结果显示,金盏花苷E浓度在低于20 μg/mL时对RAW264.7细 胞无明显毒性作用;金盏花苷E浓度依赖性地下调LPS诱导的iNOS和COX-2的表达（P<0.01 vs LPS组）;抑制LPS诱导的促炎 细胞因子TNF-α及IL-1β的释放,且1 0 μg/mL组抑制作用尤为显著（P<0.01 vs LPS组）;抑制LPS诱导的JAK1-stat3信号途径激 活及stat3的核转位;降低LPS诱发的ROS产生（P<0.01 vs LPS组）。结论金盏花苷E通过抑制ROS介导的JAK1-stat3信号途 径,抑制LPS诱导的炎症反应。     

芹菜素激活c-Src/NADPH氧化酶/ROS通路诱导HO-1

目的 观察芹菜素对脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞分泌细胞因子的影响,并探讨其分子机制。 方法 体外培养小鼠巨噬细胞RAW 264.7,用不同浓度的芹菜素处理后,加入LPS刺激0～16 h。Western blot检测血红素氧合酶-1（HO-1）的表达以及c-Src和NADPH氧化酶p47^phox亚基的磷酸化;荧光探针H₂DCFDA检测活性氧（ROS）的产生;ELISA检测TNF-α和IL-6的产生。 结果 芹菜素作用RAW 264.7细胞30 min即可诱导c-Src和NADPH氧化酶亚基p47^phox磷酸化。采用50 μmol/L c-Src抑制剂PP1预处理细胞后,p47^phox磷酸化水平明显降低。同时,芹菜素能上调RAW264.7细胞内ROS的含量,而NADPH氧化酶抑制剂DPI可抑制其产生。芹菜素也能诱导RAW264.7细胞表达HO-1,而采用PP1、DPI或ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理细胞后,HO-1表达水平明显降低。此外,芹菜素处理能下调LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6,而采用siRNA沉默HO-1表达后,能在一定程度上降低芹菜素对细胞因子的抑制效应。 结论 芹菜素可能通过激活c-Src/NADPH氧化酶/ROS通路诱导HO-1表达,从而抑制小鼠巨噬细胞过度分泌细胞因子。     

白杨素通过JAK-STATs 信号通路抑制内毒素诱导的巨噬细胞炎症反应

目的探讨白杨素对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的调控机制。方法分别用不同浓度（0、5、10、20、40、60、80、100、150、 200 μg/mL）白杨素作用RAW264.7 细胞24 h 后,采用CCK-8 检测细胞活力值;分别用（10、30、60 μg/mL）白杨素预处理 RAW264.7细胞2 h后,用LPS刺激RAW264.7细胞18 h后,采用ELISA法检测炎症因子TNF-α、IL-6和MCP-1的释放水平;分 别用（10、30、60 μg/mL）白杨素预处理RAW264.7 细胞2 h 后,用LPS刺激RAW264.7 细胞4 h 后,运用Western blotting 法检测 JAK-1、JAK-2、STAT-1、STAT-3 的磷酸化水平;分别用（10、30、60 μg/mL）白杨素预处理RAW264.7 细胞2 h 后,用LPS 刺激 RAW264.7 细胞15 min 后,运用CM-H2DCFDA荧光探针检测RAW264.7 细胞内活性氧簇水平;运用ROS清除剂NAC处理 RAW264.7细胞,检测ROS对LPS诱导RAW264.7细胞JAK-STATs信号和炎症反应的影响;运用激光共聚焦显微镜观察转录因 子STAT-1和STAT-3核转位情况。结果在白杨素浓度低于60 μg/mL时,对RAW264.7细胞活力没有显著影响,因此我们选择 10、30、60 μg/mL白杨素作为抑制炎症作用的低、中、高剂量组;白杨素剂量依赖性地抑制LPS诱导的炎症蛋白iNOS的表达;白 杨素剂量依赖性的下调LPS诱导的RAW264.7细胞中促炎因子TNF-α、IL-6和MCP-1的释放（P<0.01）;白杨素抑制RAW264.7 细胞中JAK-STATs信号活化并抑制STAT-1和STAT-3核转位;白杨素抑制RAW264.7细胞内ROS的产生;ROS作为上游信号介 导JAK-STATs信号通路的活化。结论白杨素能有效阻断ROS介导的JAK-STATs信号活化,从而抑制LPS诱导的RAW264.7 细胞炎症反应。     

脂氧素对巨噬细胞RAW264.7的抗炎实验研究

目的 研究脂氧素(LX) A4和叔丁氧羟基-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(BOC-2)对LPS作用巨噬细胞RAW264.7存活的影响.方法 取对数生长期的巨噬细胞RAW264.7为研究载体,实验用不同浓度的脂多糖(LPS)在不同时间点处理细胞,观察LX A4和BOC-2对LPS作用巨噬细胞RAW264.7后的存活率.CCK-8法观察LPS对各组巨噬细胞RAW264.7的不良反应,Western blot法检测LX A4和BOC-2对LPS处理后巨噬细胞RAW264.7的Toll样受体4(TLR4)和pNF-κB p65蛋白水平,酶联免疫吸附(ELISA)法检测LX A4和BOC-2对LPS处理后巨噬细胞RAW264.7培养上清液中白细胞介素6(IL-6)水平.结果 在1 000 ng/mL浓度LPS组,作用时间6h,巨噬细胞RAW264.7内TLR4蛋白水平和pNF-κB p65蛋白水平显著高于其余各组(P＜0.05).在LPS作用下,LX A4组细胞存活率显著高于对照组(P＜0.05);BOC-2组在LPS作用后巨噬细胞RAW264.7的存活率显著低于无LPS作用(P＜0.05).在LPS作用下,LX A4组pNF-κB p65蛋白水平低于对照组及BOC-2组(P＜0.05),BOC-2组pNF-κB p65蛋白水平高于其余各组(P＜0.05).在LPS作用下,LX A4组IL-6的水平低于对照组及BOC-2组(P＜0.05).结论 LX A4能够抑制LPS对巨噬细胞RAW264.7的作用及TLR4/NF-κB信号通路的激活,有助减轻炎性反应.     

灯盏乙素对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症介质分泌的影响

[目的] 研究灯盏乙素对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞炎症的影响,初步探讨其抗炎作用机制。[方法] 用噻唑蓝（MTT）法检测灯盏乙素对RAW264.7细胞活力的影响;用Griess法检测灯盏乙素对LPS诱导的RAW264.7细胞中一氧化氮（NO）生成的影响;用荧光素酶报告质粒法检测灯盏乙素对LPS诱导的核转录因子（NF-κB）转录活性的影响;用实时定量聚合酶链反应（PCR）法检测灯盏乙素对LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κB靶基因肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）mRNA表达的影响。[结果] 0.01～10 μmol/L的灯盏乙素处理24 h后对RAW264.7活力无显著影响;1、10 μmol/L的灯盏乙素可以显著抑制LPS诱导的NO的生成及NF-κB转录活性;灯盏乙素可以不同程度的抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB靶基因TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的上调作用。[结论] 灯盏乙素可能通过抑制NF-κB的活化及炎症因子的表达发挥一定的抗炎作用。     

COX/5-LOX双重抑制剂ZLJ-6对脂多糖诱导下巨噬细胞炎症因子表达的影响

研究COX/5-LOX双重抑制剂ZLJ-6对脂多糖(LPS)诱导下RAW 264.7细胞炎症模型的抗炎作用。采用LPS (1μg/mL)刺激生长良好的RAW 264.7巨噬细胞建立细胞炎症模型,在不同浓度的ZLJ-6( 3,10,30 μmol/L)作用下,用Griess法检测细胞培养液中NO的含量,用ELISA法检测TNF-α、IL-6含量,并用Western blotting检测各组细胞中环加氧酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮激酶(iNOS) 的表达。ZLJ-6能剂量依赖性地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的释放以及TNF-α、IL-6等炎症因子的生成,同时抑制COX-2和iNOS的表达。结果表明,ZLJ-6具有抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症反应的作用,其抗炎机制可能通过抑制COX-2、iNOS的表达以及炎症介质NO以及TNF-α、IL-6的产生。     

丙型肝炎病毒高变区1模拟表位7肽对LPS刺激RAW264.7细胞炎症因子影响的研究

目的观察丙型肝炎病毒（HCV）高变区1（HVR1）模拟表位7肽（7P）对内毒素/脂多糖（LPS）诱导的小鼠单核/巨噬细胞株（RAW264.7）细胞释放细胞因子的影响。方法体外培养小鼠RAW264.7细胞,用LPS刺激小鼠RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-6,用不同浓度（5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0μg/mL）的7P进行干预,应用单溶液细胞增殖（MTS）法检测7P对细胞活力的影响,应用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测细胞培养上清中促炎细胞因子的含量。结果 7P可抑制LPS刺激小鼠RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6,并呈一定的量效关系,其影响细胞因子释放作用与细胞毒作用无关。结论 7P呈浓度依赖性地抑制LPS刺激小鼠RAW264.7细胞释放TNF-α和IL-6。     

枫叶黄酮抑制脂多糖诱导破骨前体细胞Raw264.7细胞激活的作用

目的 探讨枫叶黄酮对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导破骨前体细胞Raw264.7细胞炎性因子释放的抑制作用.方法 用LPS(5 mg/mL刺激Raw264.7细胞构建炎症模型,采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测Raw264.7细胞的活力影响;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测一氧化氮(N0)和前列腺素E2,PGE2表达;运用免疫荧光染色方法 检测诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2,COX-2、子肿瘤坏死因子-αTNF-α和白介素-1β,IL-1β、核因子-κB,NF-κB蛋白与mRNA的表达变化.结果 不同浓度的枫叶黄酮明显抑制了LPS诱导的Row246.7细胞NO、PGE2,iNOS和COX-2,TNF-α和IL-1β与NF-κB的上调,并且.NO、PGE2、iNOS、COX-2和NF-κB蛋白的表达呈剂量依赖性.结论 枫叶黄酮可抑制LPS诱导的破骨前体细胞Raw264.7细胞iNOS、COX-2和NF-κB/P65蛋白表达和炎性因子释放从而抑制破骨细胞的激活.     

日本血吸虫可溶性虫卵抗原诱导小鼠巨噬细胞增殖及TNF-α、TGF-β1的表达

目的探讨日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）对小鼠巨噬细胞株RAW264.7增殖及TNF-α、TGF-β1表达的影响。方法实验分三组：RAW264.7对照组、SEA组和细菌脂多糖（LPS）对照组。培养巨噬细胞株RAW264.7,用20μg/ml SEA分别作用巨噬细胞3、6、9、12和15 h后,荧光定量PCR检测炎症因子TNF-αmRNA和TGF-β1 mRNA的表达;倒置显微镜观察SEA作用12 h后巨噬细胞的形态;Western blot检测炎症相关蛋白TNF-α和TGF-β1的表达;MTT比色法检测SEA对细胞增殖的影响。结果 SEA作用RAW264.7细胞3 h起,TNF-αmR-NA和TGF-β1 mRNA的表达逐渐增高,在第12 h时,其相对表达倍数分别达23.07±3.172和9.83±1.45,与其他各时间点比较差异均有统计学意义（均P〈0.05）;SEA作用12 h巨噬细胞体积明显增大,细胞拉长且形态不规则;SEA作用巨噬细胞24、48、72 h时,A_（490）值分别与RAW264.7对照组相比,差异均有高度统计学意义（均P〈0.01）,而与LPS组的差异无统计学意义（P〉0.05）;在SEA作用RAW264.7细胞12 h时,TNF-α和TGF-β1蛋白表达均高于RAW264.7对照组（均P〈0.05）。结论 SEA能促进巨噬细胞的增殖并诱导TNF-α和TGF-ββ1的表达。     

Notch1信号参与脂多糖诱导的巨噬细胞活化

[目的]探讨Notch1对脂多糖(LPS)介导巨噬细胞活化的影响.[方法]体外培养RAW264.7细胞,给予LPS 100μg/L处理8h后利用RT-PCR方法检测RAW264.7细胞Notch1和Hes1 mRNA表达水平;给予Notch1信号抑制剂DAPT10μmol/L预处理1 h后利用ELISA法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)及白细胞介素(IL)-6水平,采用Western blot法检测细胞TNF-α和IL-6蛋白表达水平.[结果]给予LPS刺激RAW264.7细胞后可明显提高Notch1和Hes1 mRNA表达(P<0.05),LPS提高RAW264.7细胞TNF-α和IL-6的表达和释放作用可明显被DAPT抑制(P<0.05),但TNF-α和IL-6表达水平仍显著高于对照组(P<0.05).[结论]巨噬细胞中Notch1信号参与LPS诱导细胞因子TNF-α和IL-6的表达和释放过程.     

氧化苦参碱对脂多糖诱导的RAW264.7细胞一氧化氮及其诱导型合酶表达的影响

目的：观察氧化苦参碱（OMT））对脂多糖（LPS）诱导的RAW 264.7细胞一氧化氮（NO）释放量及诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。方法：采用LPS诱导RAW 264.7细胞建立细胞炎症反应模型。实验分组：空白对照组、LPS组（1μg/mL）、OMT组（100μmol/L）、LPS＋OMT小剂量组（20μmol/L）、LPS＋OMT中剂量组（50μmol/L）、LPS＋OMT大剂量组（100μmol/L）。采用Griess试剂法测定细胞培养液中NO释放量。采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法测定RAW 264.7细胞iNOS mRNA的表达。结果：OMT显著减少LPS诱导的RAW 264.7细胞NO的释放（P〈0.05,P〈0.01）;同时减少LPS诱导的RAW 264.7细胞iNOS mRNA的表达（P〈0.05,P〈0.01）。结论：OMT可能通过抑制LPS诱导的巨噬细胞iNOS mRNA表达,减少NO的释放量而发挥抗炎作用。     

NLRP3、IL-33在LPS诱导的巨噬细胞中的表达及格列本脲对其表达的影响

目的研究NLRP3、IL．33在脂多糖（LPS）诱导的RAW264．7巨噬细胞炎症模型中的表达及格列本脲对其表达的影响。方法培养RAW264．7巨噬细胞,将其分为空白对照（A）组、NLRP3抑制剂格列本脲预处理＋LPS（B）组,LPS模型（C）组;B、C组采用LPS刺激RAW264．7巨噬细胞建立炎症模型,B组在LPS刺激前30rain给予格列本脲处理．空白对照组只给予培养基培养。采用蛋白免疫印迹法（Western．Mot）检测细胞中NLRP3蛋白的表达;酶联免疫吸附试验（EUSA）检测细胞培养上清中1L．33的含量;四氮唑盐（MYr）法测定各组细胞的增殖能力。结果C组中NLRP3蛋白表达均高于A组、B组（均P〈0．05）,B组NLRP3蛋白表达高于A组（P〈O．05）。C组IL-33含量比A、B组高（P〈0．05）,A组和B组之间差异无统计学意义。M1T试验中C组细胞增殖率高于A组、B组（P〈0．05）,而A、B组差异无统计学意义。结论NLRP3、IL．33在LPS诱导RAW264．7的巨噬细胞中表达升高,而格列本脲干预后可抑制NLRP3的表达及IL-33的分泌。     

下瘀血汤含药血清对脂多糖诱导活化的RAW264.7细胞表达MMP2,9/TIMP1,2的调控作用

目的:观察下瘀血汤药物血清对脂多糖(LPS)诱导活化后RAW 264.7细胞表达基质金属蛋白酶(MMP-2,9)及基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1,2)的影响,以探讨其抗肝纤维化的作用机制。方法:100 g/L LPS刺激RAW264.7细胞,ELISA法分别测定0.5 h,1 h,2 h,4 h,6 h,12 h细胞培养上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,选择模型时间点;生化法测定RAW264.7细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量,分析10%和20%的正常大鼠血清和下瘀血汤药物血清的细胞毒性;Western blot法检测RAW 264.7细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的蛋白表达。结果:与10%浓度的正常大鼠血清相比,10%下瘀血汤药物血清对RAW264.7细胞的无毒性作用。LPS刺激细胞培养1 h时,细胞培养上清中TNF-α含量开始增加;4 h时达到最高;6 h时开始下降。与相应时间点正常组相比,4 h、6 h模型组RAW 264.7细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白表达均显著升高(P0.01);与相应时间点模型组相比,4 h、6 h下瘀血汤药物血清组上述指标均降低,其中6 h组RAW 264.7细胞MMP-2蛋白表达、4 h与6 h细胞MMP-9、TIMP-1和TIMP-2蛋白表达显著降低(P0.01)。结论:下瘀血汤可能通过抑制枯否细胞(KCs)活化,抑制其MMP2,9/TIMP1,2的表达而发挥抗肝纤维化的作用。     

连翘对LPS作用的巨噬细胞TLR4蛋白表达的影响

目的观察连翘对LPS诱导巨噬细胞（RAW264．7）16h后TLR4蛋白表达的影响,探讨连翘对抗内毒素作用及其可能机制。方法体外实验共分6组,分别为control组,LPS组,连翘高、中、低剂量组及多黏菌素B组;连翘高、中、低剂量组及多黏菌素B组分别加入连翘水煎液50mg／ml、25mg／ml、12．5mg／ml及多黏菌素B10ug／ml培养0．5h后,再加入10ng／ml LPS,培养16h;Western blot法测各组细胞TLR4蛋白表达变化。结果control组RAW264．7细胞只表达少量TLR4,给予LPS刺激16h,TLR4表达明显升高（P〈0．01）,连翘高、中、低剂量组预处理均可明显降低TLR4的表达（P〈0．01）,并呈剂量依赖关系;连翘高剂量组与多黏菌素B组比较无显著性差异（P〉0．05）。结论连翘预处理能抑制LPS诱导的巨噬细胞TLR4的表达可能是其抗内毒素作用的重要机制。     

伊马替尼抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症表型

【目的】探讨伊马替尼（Ima）在体外对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症表型的影响。【方法】RAW264.7细胞在LPS（0.1μg/mL）或/和Ima（1μmol/L,5μmol/L）处理后,通过Q-PCR方法检测细胞因子IL-1β、IL-10、CCL2、iNOS、TNF-α和Arg1的mRNA表达变化;采用Western Blot检测iNOS蛋白表达变化以及NF-κB和MAPK信号通路活化情况;利用ELISA法检测细胞上清IL-1β、CCL2、IL-10和TNFα的蛋白表达情况。【结果】与对照组相比较,LPS刺激8h后,RAW264.7细胞内的炎症指标IL-1β、CCL2、iNOS和TNF-α的mRNA水平显著升高（P<0.001）以及抗炎指标IL-10的mRNA水平也明显升高（P<0.001）;LPS刺激24h后,细胞上清中IL-1β、IL-10、CCL2和TNF-α的蛋白水平显著上升（P<0.001）,细胞内iNOS蛋白表达以及p65,p38,ERK和AKT的磷酸化水平显著增加。和LPS组相比,Ima提前处理后,IL-1β、CCL2、iNOS和TNF-α的mRNA及蛋白水平显著下降（P<0.01,P<0.001）而IL-10的mRNA及蛋白水平显著升高（P<0.001）,这种抑制作用具有剂量依赖性。Ima的预处理抑制了LPS诱导的p65,p38,ERK和AKT磷酸化。单独用Ima处理RAW264.7细胞后,细胞的功能状态未见明显的改变。【结论】伊马替尼可抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症表型,这种作用与抑制NF-κB和MAPK信号通路的过度激活有关。     

槐定碱对小鼠巨噬细胞TLR4及JNK/c-jun mRNA表达的影响

目的观察槐定碱预处理对LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞表达TLR4、JNK和c-jun mRNA及分泌TNF-α的影响,探讨槐定碱抗内毒素机制。方法培养RAW 264.7巨噬细胞,实验分为4组：空白对照组、槐定碱对照组、LPS组、槐定碱预处理组,用RT-PCR技术检测RAW 264.7细胞TLR4、JNK和c-jun的mR-NA表达量,放免法检测细胞培养液TNF-α分泌量。结果槐定碱对RAW 264.7巨噬细胞TLR4、JNK、c-jun的mRNA及细胞培养液中TNF-α基础表达无影响,但对经LPS激活的巨噬细胞的TLR4、JNK mRNA表达有显著抑制作用（均P〈0.01）,c-jun mRNA表达亦降低,但与LPS模型组比较差异尚无统计学意义。槐定碱预处理组细胞液中TNF-α含量显著低于LPS模型组（P〈0.01）。结论槐定碱抗内毒素机制与其抑制LPS引起的TLR4、JNK的mRNA高表达,并减少TNF-α分泌有关。