人EIF2B4基因一个新的可变剪接产物及其鉴定

目的对人EIF2B4基因新的可变剪接产物进行鉴定。方法应用长链RT-PCR技术扩增人外周血EIF2B4基因编码区全长序列并进行T克隆及序列测定,用常规RT-PCR对新型可变剪接产物进行验证。结果在EIF2B4基因转录产物中检测出正常变异体2和3(两者只相差3个碱基),同时发现一个外显子7缺失26bp的转录产物。结论利用长链RT-PCR结合T克隆-测序的方法,发现人EIF2B4基因的一个新型可变剪接产物。     

肝癌相关基因的分子克隆和可变剪切分析

目的: 获取肝癌相关基因(hepatoma associated gene,HTA)的mRNA分子全长序列并对其可变剪接进行分析,检测其转录本在各肝癌细胞系中的表达,为进一步研究该基因在肝癌发生、发展中的作用奠定基础。方法: 用3'RACE 和5'RACE方法扩增HTA基因的全长序列并对其序列信息和可变剪接进行扩增和测序分析,用Northern印迹检测该基因转录本在不同肝癌和正常肝细胞系中的表达。结果: HTA基因全长序列为1414 bp,经分析该序列包含3个外显子,2个内含子,其中2号内含子在可变剪接中被作为外显子表达。Northern印迹显示HTA基因1.7 kb转录本和1.4 kb转录本均表达于恶性肝癌细胞系,而不表达于正常细胞系。结论: 成功获得了HTA基因的全长序列并对其可变剪接进行了分析,2个大小不同的转录本均在肝癌细胞系中特异性表达,作为一个肝癌相关基因值得进一步深入研究。     

外显子组测序在抗肌萎缩蛋白基因检测到一个新的剪接供体位点突变

目的应用外显子组捕获和第2代测序技术检测抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin)中的微小突变。方法通过外显子组捕获和第2代测序技术对1例具有典型杜氏肌营养不良症(DMD)临床表现但没有外显子缺失或重复的患者进行dtstriogub基因突变检测,并用Sanger测序证实检测结果。以生物信息学预测基因突变所致该基因编码情况的改变。以患者母亲和100名体检正常者作为对照。结果在患者dystrophin基因内含子50的第1个碱基检测到1个碱基改变:G>C,其母亲在相同的位置发生了杂合改变。生物信息学预测此改变将使内含子50原有的5’剪接位点消失,导致其相应肽链C端氨基酸序列改变、终止密码提前出现。Sanger测序进一步证实了该突变的存在,且在正常对照未检测到该突变。这是在dystrophin基因上新发现的致病性剪接供体位点突变。结论外显子组测序技术可有效检测dystrophin基因微小突变,其应用可进一步完善DMD分子诊断体系。     

复杂性疾病遗传研究中Tag SNP的筛选及其潜在功能预测

利用公共数据库筛选与复杂性疾病相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP).运用FastSNP、SNP Function Prediction、F-SNP等多种SNP功能预测软件筛选有潜在功能的SNPs;通过HapMap等数据库筛选Tag SNP;综合比较各软件结果.以IGFBP 7基因为例,筛选转录因子结合位点SNPs 11个,内含子增强子31个,内含子增强子和转录因子结合位点4个,剪接位点1个,共47个SNPs.     

帕金森病中的GSK3B多态性改变转录和剪接

帕金森病（PD）是一种神经变性疾病，以出现多重运动症状为特征。在糖原合成激酶-3B基因（GSK3B）中证实有两种功能的单核苷酸多态性，1个单核苷酸多态性启动子（rs334558）与体外转录强度相关，在这一启动子中T等位基因更有活性，1个单核苷酸多态性内含子（rs6438552）在体外调节剪接受体位点的选择。T等位基因与淋巴细胞改变的剪接有关，也与GSK3B转录产物的浓度增加有关，后者缺乏外显子9和外显子11（GSKA外显子94-11）。GSK△外显子9-4-11浓度的增加与其自身底物tau的磷酸化增强有关。对PD患者和正常受试者的大脑进行对比分析，PD患者大脑中发现T等位基因（rs6438552）的频率增加，与之相应的是GSKA外显子9＋11和tau磷酸化增加。条件Logistic回归显示，rs334558的T／T基因型与微管相关蛋白tau（MAPT）基因H1／HI单体型之间的基因-基因相互作用（P=0．009），对tau单体型进行分层后，单体型（两种GSK3B的T等位基因多态性）与发病风险之间相关（H1／H2＋H2／H2受试者：OR1．64，P=0．007；H1／H1受试者：OR0．68，P〈0．001）。本试验结果提示，GSK3B多态性改变转录和剪接，并且与tau单体型相互作用以改变PD的发病风险。     

成骨不全家系Ⅰ型胶原COL1A1基因一个新RNA剪接突变位点的发现

目的:成骨不全(OI)又称脆骨病,是一种少见的遗传性骨病,临床表现主要包括骨密度降低、骨脆病增加、蓝巩膜、牙本质发育不全等,发病率约为1 : 10000报告1个成骨不全(OI)家系并检测Ⅰ型胶原基因(COL1A1和COL1A2)的突变位点.方法:家系患者均具有易骨折和蓝巩膜等特点,诊断为OI.提取外周血基因组DNA,对COL1A1和COL1A2基因的所有启动子、外显子以及外显子-内含子进行DNA测序.基因突变位点的杂合状态通过序列特异引物PCR(PCR-SSP)进行证实.结果:DNA测序显示, 2例OI患者COL1A1基因内含子27的5′端RNA剪接位点发生突变(c.1875+1G>A, 即 IVS 27+1 G>A),该突变与OI临床诊断一致.而家系中9名正常成员和50名健康对照者均未检测到该剪接位点突变.c.1875+1G>A在文献及胶原基因突变数据库均未见,为 OI患者COL1A1基因的新突变位点,PCR-SSP证实了内含子27的杂合性.结论:本研究在一OI中国家系发现了致病基因COL1A1新的RNA剪接位点突变(c.1875+1G>A),详细的分子及临床特征对认识OI患者遗传和表型异质性、进一步研究OI基因型-表型关系有作用.     

家族性慢性良性天疱疮一家系致病基因新突变的发现

目的对家族性慢性良性天疱疮一家系的ATP2C1基因突变进行检测。方法采用聚合酶链反应扩增该家系患者和健康对照个体ATP2C1基因的全部外显子,直接测序法进行DNA测序,100例无亲缘关系的正常人作为对照。结果该家系患者ATP2C1基因内含子3的末端235-2碱基发生了1个腺嘌呤（A）→鸟嘌呤（G）的杂合性剪接位点突变。家系中健康对照个体及无亲缘关系的正常对照均未发现该突变。结论该剪接位点突变可影响基因转录和翻译产物,是ATP2C1基因新的特异性突变。     

中国人群中C6orf37第二外显子VNTR多态性的研究

目的：证实C6orf37编码区VNTR位点，检测其多态性在中国人群中的分布特点，并寻找VNTR多态性检测的理想方法。方法：用RT—PCR及测序证实C6orf37编码区的VNTR位点，并用SSLP和DHPLC两种方法对166例中国人进行VNTR基因分型。结果：C6orf37基因的第二外显子区存在一个新的VNTR多态性位点，其核心序列为GGCGGCGACTTCGGC，编码5个氨基酸（G—G—D—F—G），重复3到5次。该位点存在3种等位基因：a（3次重复），b（4次重复），c（5次重复），6种基因型：a／a，b／b，c／c，a／b，a／c，b／c。在中国人群中的a、b、c等位基因频率分别为0．145，0．304，0．551。杂和度为0．583，多态信息含量为0．510。DHPLC与SSLP检测VNTR多态性的结果一致，但DHPLC具有快速、经济、高通量的特点。结论：C6orf37编码区存在一个高度多态性VNTR位点，DHPLC是大规模筛选VNTR多态性的理想方法。     

人生长激素基因组DNA在家蚕BmN细胞中的瞬时表达

目的 :探讨内含子对外源基因在真核细胞中表达的作用。 方法 :直接将含有 4个内含子和自身信号肽的 1.5 kb全长人生长激素基因直接克隆至真核表达载体 pc DNA3.0 ,然后利用脂质体转染家蚕 Bm N细胞 ,收取细胞上清 ,PAGE电泳和Western印迹分析鉴定表达产物 ;将全长基因序列、缺失第 1内含子基因序列和 c DNA序列的表达载体 ,分别转染细胞后检测各片段表达产物之间的差异。结果 :测序结果表明人生长激素基因组 DNA在细胞内正确转录、剪接。蛋白质电泳分析和免疫学检测证明转染细胞能够有效合成并分泌蛋白质。 EL ISA检测发现 3种基因片段中 ,全长的基因序列在表达效果上要高于后两者 (P<0 .0 5 ) ,其中缺失第 1内含子的序列表达效率较 c DNA序列明显降低 (P<0 .0 5 )。结论 :在家蚕细胞中能够正确表达带有自身内含子和信号肽的人源蛋白基因 ;推测基因的内含子在成体的外源基因表达过程中起着更为重要的作用     

C-反应蛋白与血栓形成的研究进展

1 C-反应蛋白的结构及生物学特性 1.1 CRP的基因结构：其人的编码基因位于1号染色体长臂上（1q21-1q23）,长约2.3kb,有2个外显子和1个内含子。第一个外显子编码一个信号肽,第二个外显子是编码成熟蛋白质的氨基酸。内含子为278个核苷酸的GT重复序列。而该内含子使编码区的信号肽（第一个外显子）与编码区的成熟蛋白（第二外个显子）隔开。CRP基因表达主要在转录水平调控,主要由IL6,IL1,TNF-α及其它细胞因子调控。     

由ALK1基因内含子突变引起的遗传性出血性毛细血管扩张症

目的 探讨遗传性出血性毛细血管扩张症发病的分子机制。方法（1）用聚合酶链式反应-单链构像多态性分析（PCR-SSCP）寻找异常突变的外显子及其相邻剪接位点。（2）通过DNA测序确定突变的类型。（3）使用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法确定剪接方式。结果 用PCRSSCP方法发现扩增ALK1基因第4外显子及相邻的部分内含子片段有突变位点。对有突该片段,用DNA测序检测,发现第4外显子的给位剪接点相邻碱基A＞T（ⅣS4＋3a＞t）的突变,并用反向测序确认。用RT-PCR方法检测ALK1基因表达mRNA情况,电泳和测序发现第4外显子的丢失。结论 ALK1基因的ⅣS4＋3a＞1突变,导致ALK1基因表达异常,形成无功能截短蛋白,引起HHT2。     

大鼠磷脂酶C-γ1前体mRNA剪接的初步鉴定

目的 探讨在大鼠中是否存在磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)选择性剪接变异体的表达及其可能意义.方法 针对在人中已发现的选择性剪接位点(即第30内含子的3'末端与第31外显子交界处)自行设计引物,将大鼠RNA逆转录为cDNA后,再用该对引物进行PCR扩增及序列测定.用此方法初步筛查了大鼠包括胚胎时期、出生早期、成年时期6种脏器组织心、肝、肺、肾、脑和眼球样品共21份.结果 在大鼠中未发现与人相似的第一种剪接方式PLC-γ1aNM 002660).结论 (1)由于不同物种之间的差异,在大鼠中可能不存在与在人类中已发现的PLC-γ1前体mRNA相似的选择性剪接方式,在大鼠中PLC-γ1转录后的剪接主要以与人类相似的第二种剪接方式(PLC-γ1b)为主.(2)在大鼠中PLC-γ1的选择性剪接位点可能与人不同而位于其他位点.     

DNA重新甲基化酶3b在成年及新生小鼠部分组织中的选择性？…

目的 探讨哺乳动物ＤＮＡ重新甲基转移酶３ｂ（Ｄｎｍｔ３ｂ）在新生及成年小鼠多种组织中的选择性剪接表达。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ结合毛细管电泳分析新生及成年小鼠主要器官中Ｄｎｍｔ３ｂ的选择性剪接表达产物,并通过计算机分析Ｄｎｍｔ３ｂ外显子１０和外显子２１、２２选择性剪接对该基因功能可能产生的影响。结果 成年小鼠肝组织中大部分Ｄｎｈｍｔ３ｂ转录本保留外显子１０,而其它组织的大部分转录本中此序列被剪切掉。     

Fkbp51基因敲除对小鼠肝脏转录组基因可变剪接的影响

目的通过分析Fkbp51基因敲除(knock out,KO)与野生型(wild type,WT)小鼠肝脏表达谱,研究Fkbp51基因敲除对肝脏组织基因可变剪接的影响。方法利用二代测序对Fkbp51 KO与WT小鼠肝脏进行表达谱测序,用Top Hat对RNA测序结果进行可变剪接分析,筛选出KO与WT小鼠肝组织中差异的内含子保留(intron retetion,RI)和外显子跳跃(exon skipping,SE)。通过在线工具DAVID对这些差异可变剪接体进行基因功能(gene ontology,GO)和代谢通路(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析,同时用NCBI基因数据库对这些基因进行注释。结果 (1)Fkbp51缺失可导致小鼠肝脏mRNA可变剪接发生变化;(2)Fkbp51基因敲除造成小鼠肝脏mRNA可变剪接表达量的变化;(3)通过GO与KEGG分析,我们发现这些发生差异可变剪切的基因主要与脂肪相关衍生物的代谢、免疫、胆汁酸分泌等通路相关。(4)与差异内含子保留相关的基因主要与肌动蛋白细胞骨架调控,氨基酸及其衍生物代谢相关。结论 Fkbp51基因敲除能够改变基因组中mRNA的可变剪切,进而影响小鼠肝脏的代谢功能。     

未知人Na（＋）—K（＋）—Exchanging ATP aseα1亚基基因第一 …

目的 研究人Ｎａ（＋）－Ｋ（＋）－ＥｘｃｈａｎｇｉｎｇＡＴＰａｓｅα１亚单位基因外区约８０￣１３０位氨基酸编码序列的未知基因组结构。方法 采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）方法对人基因组ＤＮＡ及ｃＤＮＡ文库进行扩增,限制性酶切分析扩增产物,并进行荧光测序,对测序结果进行同源性分析及剪接位点的搜索并对得到的核苷酸序列进行分析。结果 人基因组ＤＮＡ和ｃＤＮＡ经扩增后分别得到８３３和１９５ｂｐ两种不同大小的片段     

FMR1基因在人胚胎组织中的选择剪接表达

本实验分析了6月龄胚胎心、肝、肾、脾4种组织中FMR1基因的选择剪接表达。在所分析的胚胎组织中，FMR1mRNA主要异构体与该胚胎大脑皮层的主要异构体相同，与成人大脑皮层的主要异构体完全不同。这一差异提示FMR1基因的选择剪接表达存在发育转换。FMR1基因的选择剪接表达在胚胎和成人组织中的主要差别表现在外显子12和外显子17编码多肽的去留上，对这两段多肽功能的研究将具有重要意义。     

Modification of Alternative Splicing of Bcl-x Pre-mRNA in Bladder Cancer Cells

The development , progression, and mainte-nance of cancer involve deregulation of apoptosis .Genetic and biochemical studies have revealed thatPCDis under complex and delicate regulation. Ani mportant level of such regulation may be pre-mR-NAsplicing. Many apoptotic regulatory genes un-dergo alternative splicing to control the gene ex-pressionlevel .Forinstance ,Bcl-x has two alterna-tive 5' splice sites and produces two distinct pro-teins :Bcl-xL and Bcl-xS.Bcl-xL,like Bcl-2 ,is a-ble t…     

人受精促进肽受体(TCP11c)基因的克隆、表达及选择性剪接

目的 分离、克隆人受精促进肽受体TCP11基因1个新的转录本TCP11c的全长cDNA,研究其表达的阶段性、组织特异性及TCP11c基因3种转录本的剪接方式。方法 运用BLAST方法获得与TCP11a同源的ESTs,以逆转录的人睾丸cDNA为模板进行PCR扩增,将PCR扩增片段克隆入p哪M—TeMy载体并516序;采用BLAST、ClustalW及RT—PCR方法分析各转录本的基因组结构及剪接方式;RT—PCR方法分析其组织表达的特异性和阶段性。结果 获得1个新的全长cDNA,它编码440个氨基酸的蛋白质,与TCP11a、b相比,在基因组的5′—端存在复杂的外显子剪接现象。RT—PCR结果显示该转录本在正常睾丸中表达,而其他组织、无精症患者及胎儿睾丸组织中未见该基因表达。结论 从人睾丸组织中分离到人受精促进肤受体TCP11基因1个新的转录本TCP1c,结合mTcp-11的功能提示,TCP11基因a、b、c这3种转录本对精于发生和人受精过程可能起重要作用。     

两例同一位点处的相同Rb1基因缺失

目的：检测Ｒｂ１基因的杂合性突变,探讨Ｒｂ１基因突变的分子生物学机理;方法：应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ－直接测序技术;结果：在检出有杂合性缺失的５０个病例中,一种相同序列的碱基、相同的突变形式（缺失）发生于毫无血缘关系的两个不同的病人的双眼视网膜母细胞瘤（ＲＢ）患者中;结论：“滑动错配”机理、“隐蔽拼接位点”的激活和利用可能促使此缺失发生。