兔膀胱移行上皮细胞构建组织工程尿道的初步研究

目的 探索以膀胱移行上皮细胞为种子细胞构建组织工程尿道的可行性。方法 取兔膀胱移行上皮细胞，体外培养传代后作为种子细胞与自制胶原膜体外联合培养并行裸鼠体内移植，通过对复合物扫描电镜、HE染色及角蛋白免疫组化检测，了解细胞在材料上的生长情况。结果 2h后移行上皮细胞在胶原膜上贴附生长，复合物移植体内20d后，移行上皮细胞分化成层，层厚1～5层。结论 该方法获取的膀胱移行上皮细胞是构建组织工程尿道的良好种子细胞，与胶原膜构建的复合物在体内形成了尿道类似物，有望成为替代尿道的组织工程材料。     

丝素蛋白膜与小鼠胚胎成纤维细胞的体外生物相容性研究

目的探讨不同结构的丝素蛋白支架材料对小鼠胚胎成纤维细胞（NIH-3T3）生长繁殖性能的影响。方法将NIH-3T3接种在丝素蛋白纳米纤维膜和浇铸膜上进行体外培养,并设空白对照组。通过MTT法、HE染色、扫描电镜来分析不同结构丝素蛋白膜的生物相容性。结果增殖培养4天时实验组的OD值与对照组相比,有显著性差异（P〈0．05）;增殖培养7天时实验组与空白组相比无显著性差异（P〉0．05）,而对照组与空白组相比有显著性差异（P〈0．05）。HE染色、扫描电镜显示NIH-3T3细胞在纳米纤维膜上比在浇铸膜上有更好的生长和连接状态。结论与丝素蛋白浇铸膜相比,NIH-3T3细胞在纳米纤维膜上表现出更好的增殖能力,无明显细胞毒性表现;丝素蛋白纳米纤维膜具有良好的生物相容性,是皮肤组织工程的良好载体。     

丝素蛋白膜修复兔尿道缺损的实验研究

目的 探索丝素蛋白膜修复尿道缺损的效果.方法 24只雄性新西兰白兔随机分成3组,实验组、对照组Ⅰ及对照组Ⅱ.实验组12只兔切除尿道中段1.5 cm建立尿道缺损模型,应用丝素蛋白膜修复,术后2、4、8、16周每次3只行逆行尿道造影、组织学及免疫组织化学检测;对照组16只兔行尿道海绵体游离后即缝合切口,对照组Ⅱ6只兔切除尿道中段1.5cm建立尿道缺损模型后缝合切口依靠尿道自体再生修复缺损,术后8周、16周对照组Ⅰ及对照组Ⅱ每次3只行逆行尿道造影、组织学及免疫组织化学检测.结果 实验组12只兔应用丝素蛋白膜修复尿道缺损未见尿道狭窄,尿道粘膜细胞及平滑肌细胞修复缺损区,未见纤维化形成,16周时丝素蛋白膜完全降解,粘膜细胞及平滑肌细胞排列有序,免疫组织化学染色证实修复区腔面覆盖细胞为尿道移行细胞.结论 丝素蛋白膜能够诱导尿道粘膜上皮细胞及尿道平滑肌的生长,具有促进尿道缺损修复的能力.     

ABCG2在膀胱移行细胞癌中的表达及意义

目的 探讨干细胞标志物ABCG2在膀胱移行细胞癌中的表达及意义.方法 对40例膀胱移行细胞癌组织(其中Ⅰ级12例,Ⅱ级18例,Ⅲ级10例)和15例正常膀胱组织采用免疫组织化学法检测,对人膀胱癌细胞株BIU-87采用免疫荧光法检测ABCG2蛋白的表达,显微镜观察并对相关图片进行光密度分析.结果 ABCG2阳性表达定位于癌细胞的胞浆和胞膜,在膀胱移行细胞癌组织和人膀胱癌细胞株BIU-87中均检测到ABCG2蛋白的表达,而在15例正常膀胱组织中表达全为阴性,光密度分析提示其表达强度与肿瘤病理分级呈正相关(P<0.05). 结论膀胱移行细胞癌中干细胞标志物ABCG2的表达提示,肿瘤的恶性程度与膀胱移行细胞癌的发生、发展可能存在关联.     

兔膀胱移行上皮细胞的体外培养及鉴定

目的:探索并建立兔膀胱移行上皮细胞的体外培养及扩增方法,为泌尿系器官的组织工程研究提供种子细胞。方法:采用刮削法取得移行细胞单细胞悬液,在加入了10%胎牛血清、表皮生长因子等营养物质的DMEM/F12培养基中进行原代及传代培养,并观察细胞形态变化和进行Giemsa染色和免疫组化染色证实细胞来源。结果:原代培养细胞3 d开始贴壁生长,10-14 d细胞融合成单层,可进行传代培养,传至第7代后细胞开始出现衰退现象,经Giemsa染色、免疫组化染色证实为移行上皮细胞。结论:该培养方法能在较短时间内获得大量的移行上皮细胞,具有细胞纯度高、成功率高及扩增迅速的特点。     

p27和Cyclin E在膀胱移行细胞癌组织中的表达及意义

目的探讨p27和Cyclin E蛋白在膀胱移行细胞癌组织中的表达及其意义.方法采用免疫组化方法(S-P法)检测45例膀胱移行细胞癌组织和8例正常膀胱组织石蜡切片中p27和Cyclin E蛋白的表达.结果膀胱移行细胞癌组织中p27阳性表达率明显低于正常膀胱组织(P＜0.01);膀胱移行细胞癌组织中Cyclin E阳性表达率明显高于正常膀胱组织(P＜0.05).p27与Cyclin E呈负相关(r=-0.207,P＜0.05).结论提示p27和Cyclin E可以作为判别膀胱癌分化程度的标志物,并作为判断预后的指标.     

丝素蛋白-丹参多功能生物敷料的制备及其组织相容性研究

目的:以丝素蛋白?丹参为主要原料研制一种新型的创伤敷料,评价其作为医用生物材料的安全性?方法:制备丝素蛋白三维材料,载入丹参,制得丝素蛋白-丹参多功能生物敷料,进行组织相容性试验,包括细胞毒性试验?刺激性试验?过敏性试验和遗传毒性试验?结果:制备的丝素蛋白-丹参多功能生物敷料的细胞毒性试验?刺激性试验?过敏性试验和遗传毒性试验结果呈阴性?结论:丝素蛋白-丹参多功能生物敷料具有良好的生物相容性,无不良反应,是可以安全使用的医用生物材料?     

丝素蛋白与丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料体外细胞相容性的比较

目的探讨丝素蛋白（SF）与丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料（SF/HA）的体外细胞相容性,为组织工程提供理想的生物支架材料。方法将小鼠的骨髓间充质干细胞（C3H10T1/2）接种于上述两种生物材料上,运用四唑盐比色试验（MTT法）检测细胞的增殖能力,利用倒置显微镜和扫描电镜观察细胞在材料上的生长形态。结果 C3H10T1/2在SF与SF/HA上都能很好地黏附、生长和增殖。SF、SF/HA和C3H10T1/2都有良好的细胞相容性。结论 3%SF、6%SF、600%SF/HA3组多孔材料的体外细胞相容性最好。     

抑癌基因PLCδ1在膀胱移行细胞癌中的表达及意义

目的 探讨抑癌基因磷脂酶C-δ1(PLCδ1)在膀胱移行上皮细胞癌(BTCC)中的表达及临床意义.方法 采用RT-PCR法检测56例膀胱移行上皮细胞癌组织和15例非肿瘤膀胱组织中基因PLCδ1的表达情况.结果 56例膀胱移行细胞癌组织中PLCδ1的表达缺失率是58.9%(33/56),15例非肿瘤膀胱组织全部表达PLCδ1(P<0.05);其表达异常与BTCC组织淋巴结转移有关(P<0.05),而与年龄、性别、病理分级、临床分期和肿瘤数目无关.结论 PLCδ1基因的表达异常可能在膀胱移行细胞癌的发生、发展及预后中起重要作用,PLCδ1可作为反映膀胱移行细胞癌生物学行为的指标之一.     

组织工程膀胱细胞外基质生物相容性的实验研究

目的 制备兔膀胱细胞外基质材料,检测其生物相容性,探讨其作为组织工程泌尿道修复重建支架材料的可行性.方法 联合应用渗透溶液法-酶消化法-去垢剂洗涤法制备兔膀胱细胞外基质,将体外培养的兔膀胱移行上皮细胞与其复合培养,观察细胞在材料表面的黏附、生长、增殖情况;MTT法检测材料浸提液对膀胱移行上皮细胞的细胞毒性;将材料植入兔背部皮下检测其组织相容性.结果 兔膀胱细胞外基质冻干后呈白色半透明薄膜状,扫描电镜观察材料一面呈纤维网状结构,另一面呈平坦致密结构,两面均无细胞残留.膀胱移行上皮细胞能够在材料表面正常黏附、生长、增殖,细胞形态良好.MTT法检测材料细胞毒性分级为0级或1级.皮下植入实验中动物无异常反应,材料能在体内逐渐降解并引导新生组织长入.结论 本研究制备的兔膀胱细胞外基质已完全除去组织中的细胞成份,同时保留了细胞外基质的纤维网状结构,具有良好的细胞相容性和组织相容性,可以作为组织工程泌尿道修复重建的支架材料.     

兔正常膀胱移行上皮细胞的体外培养和鉴定

目的：摸索膀胱移行上皮细胞的合适培养条件，为建立满足组织工程需要的尿路上皮细胞体培养体系提供实验基础。方法：采用无血清培养系统，以组织块法原代培养兔正常膀胱移行上皮细胞并传代。动态观察细胞形态变化和生长增殖状况，进行免疫细胞化学染色鉴定细胞来源。结果：原代第4开始有上皮样细胞自组织块边缘长出，第10-14天汇合，呈典型铺路石样外观。2代超细胞生长4-7d后汇合，未发现成纤维样细胞混杂生长。细胞可传至6代以上。细胞角蛋白AE1/AE3单抗染色各代细胞均呈阳性反应。结论：分离培养的是单一的膀胱移行上皮细胞，细胞具有一定的增殖传代能力。     

兔膀胱移行上皮种子细胞的培养及扩增

目的 对膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养，探讨用于膀胱组织工程研究的移行上皮种子细胞的培养方法。方法 采用组织块培养法，将获取的移行上皮组织小块在添加附加成分的无血清F12培养基进行培养，观察培养细胞的形态及生长增殖情况，并对传代培养的细胞进行免疫组化染色鉴定。结果 原代移行上皮组织培养约9-10d时细胞可达90％的汇合，传代培养的移行上皮细胞生长稳定期较长，细胞至5—6代时生长状态仍然良好。免疫组化染色显示培养细胞为移行上皮细胞。结论 采用组织块培养法能成功地原代培养兔膀胱移行上皮细胞，在添加附加成分的F12培养基中移行上皮细胞能够稳定地传代培养，表明该法可为膀胱组织工程的研究提供一定数量活性良好的移行上皮细胞。     

兔脂肪间充质干细胞诱导成膀胱移行上皮细胞的研究

目的 探讨体外诱导兔脂肪间充质干细胞(rabbit adipose tissue-derived stromal cells,rASCs)向膀胱移行上皮细胞分化的可行性.方法 实验分混合共培养组、条件培养液组和空白对照组.混合共培养组是将兔脂肪间充质干细胞rASCs(GFP标记)与兔膀胱移行上皮细胞按1∶1比例混合培养；条件培养液组是将兔膀胱移行上皮细胞上清液与rASCs一起培养;空白对照组是rASCs与普通培养基常规培养.2周后,用免疫荧光法检测诱导分化的脂肪间充质干细胞中膀胱移行上皮细胞特异性蛋白尿斑素Ib、尿斑素Ⅱ、尿斑素Ⅲ和上皮细胞角蛋白CK18的表达.结果 2周后,免疫荧光检测显示,在混合共培养组中,诱导分化的脂肪间充质干细胞表达膀胱移行上皮细胞特异性蛋白尿斑素Ib和上皮细胞角蛋白18、尿斑素Ⅱ、尿斑素Ⅲ没有检测到.而在条件培养液组和空白对照组,上述膀胱移行上皮细胞特异性标记都没有检测到.结论 rASCs与兔膀胱移行上皮细胞混合培养可以诱导rASCs向膀胱移行上皮细胞分化.     

负载TGF-β1微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的研制负载转化生长因子β1（transforming growth factor—β1,TGF—B。）壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）体外构建组织工程软骨,观察将其移植修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法通过密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化MSCs,以抗兔CD14、CD44等单抗采用流式细胞仪进行MSCs表面抗原鉴定,获得纯化的MSCs。采用乳化交联法获得包裹TGF—B,壳聚糖缓释微球,并将该微球负载在冷冻干燥获得的壳聚糖一丝素支架上。将培养的MSCs种植到支架上,体外构建组织工程软骨,移植到兔关节软骨缺损处。移植空白支架的为实验对照组,移植体外构建的组织工程软骨为实验组。主要观察指标,流式检测的MSCs细胞表面标记情况,微球的形态,支架与细胞共培养后电镜下情况,支架移植后的兔关节修复情况及组织学检查。结果流式检测MSCs第4代及第9代细胞的CD14及CD44表面抗原的表达情况发现两代MSCsCD14表达基本呈阴性,CD44表达呈阳性,符合间充质干细胞的特性。扫描电镜观察所制备的微球基本呈球形,表面光滑,直径约为1μm,大小较均一,分散度好。细胞在壳聚糖-丝素三维支架上生长状态良好,电镜观察,可见支架孔隙内有细胞黏附生长。移植治疗后发现实验组修复明显好于对照组,实验组术后3个月实验组已经有较硬的类软骨组织填充修复,切片显示有软骨细胞规则排列,甲苯胺蓝染色为阳性,而对照组仅为纤维组织修复,切片显示为纤维组织或纤维软骨组织修复,软骨细胞排列紊乱,甲苯胺蓝染色阴性或弱阳性。结论负载TGF—β1壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞体外复合培养后移植治疗修复兔膝关节软骨缺损,具有较好的疗效。     

新生大鼠嗅鞘细胞在再生丝素膜上的生长

目的 观察新生大鼠嗅鞘细胞在再生丝素膜上的生长情况，探讨再生丝素膜在嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤中成为细胞培养基质的可能性。方法 采用静置贴壁培养法体外培养分离的新生大鼠嗅鞘细胞，免疫酶和免疫荧光方法染色鉴定，观察在再生丝素膜上嗅鞘细胞的生长，并用MTT法测定细胞生长曲线。结果 再生丝素膜对新生大鼠嗅鞘细胞的贴壁能力和形态未见明显改变，也未见明显毒性，并能支持细胞正常生长，呈现正常的生长繁殖曲线。结论 再生丝素膜对新生大鼠嗅鞘细咆具有良好的细胞相容性。     

体外分离培养的人尿道黏膜上皮细胞的生物学特性

目的 探讨体外分离培养的人尿道黏膜上皮细胞的生物学特性,为构建组织工程尿道提供种子细胞.方法 取尿道下裂患者尿道黏膜,经消化离心后,接种于培养基中连续培养,观察细胞形态变化及生长、增殖过程,并绘制生长曲线;对细胞进行常规冻存和复苏;应用免疫细胞化学技术进行角蛋白染色的鉴定.结论 体外培养的细胞呈铺路石样外观,可传至8代;可进行常规冻存和复苏;角蛋白免疫细胞化学染色呈阳性.结论人尿道黏膜上皮细胞的体外连续培养及扩增技术被建立,本实验培养的细胞可用于构建组织工程尿道.     

组织工程化尿路上皮结构体内外构建研究

目的探讨工程化尿路上皮结构的构建方法。方法机械分离获取膀胱黏膜层,胰蛋白酶消化法获取膀胱移行上皮细胞,用DKSFM培养基体外培养扩增。以自制的猪小肠黏膜下层(SIS)为支架材料,将培养的膀胱移行上皮细胞接种到支架材料表面,观察细胞在支架材料表面的生长增殖情况;并将体外构建的细胞-支架材料复合物植入裸鼠背部皮下,不同时间点取材进行组织学和免疫组织化学检测。结果膀胱移行上皮细胞在SIS表面能够黏附、生长和增殖。体外复合培养9d后,膀胱移行上皮细胞铺满SIS表面,呈单层细胞结构。裸鼠体内植入4周和8周后,SIS上种植的膀胱移行上皮细胞形成多层结构,抗细胞角蛋白免疫组化染色,细胞胞浆成棕黄色阳性反应。结论采用组织工程技术能够在体内外初步构建尿路上皮结构,为进一步组织工程泌尿道修复重建实验奠定了基础。