肿瘤抑制因子PTEN与心肌肥大关系的研究

[摘要]目的：观察肿瘤抑制因子PTEN在心肌肥厚大鼠心肌组织以及在血管紧张素诱导的肥大心肌细胞中的表达，探讨PTEN在心肌肥大发生发展中的作用以及相关机制。方法：采用腹主动脉狭窄术制备压力超负荷心肌肥厚动物模型，及血管紧张素诱导新生大鼠心肌细胞肥大模型，应用逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）方法、Westernblot及免疫组化等方法，分别检测各组PTEN mRNA和蛋白表达的变化，     

血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后缝隙连接蛋白Cx43表达的变化

 [目的]研究血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后连接蛋白43（Cx43）表达的变化及与细胞周期分布的关系。[方法]分离培养大鼠心肌细胞,用血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大,72h后用RT-PCR和免疫荧光方法观察心肌细胞Cx43基因和蛋白表达,用流式细胞仪测定法观察心肌细胞周期分布变化以及Cx43表达量的关系。[结果]血管紧张素Ⅱ处理后的心肌细胞表现细胞肥大且细胞活力增强,S期、G2-M期细胞百分比增加,细胞内G2-M（二倍体）DNA含量降低,Cx43蛋白表达低于对照组,Cx43mRNA表达水平也较对照组明显下调,Cx43蛋白表达下调与细胞周期分布的改变相关。[结论]血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后Cx43基因表达明显下调,导致Cx43蛋白表达亦出现下调,这一改变可能与心肌肥大过程中的细胞周期变化有关,提示血管紧张素Ⅱ可能通过调控Cx43基因的表达而参与缝隙连接重构过程,而Cx43表达的变化可能与心肌肥大的机制有关。     

血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后缝隙连接蛋白Cx43表达的变化

[目的]研究血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后连接蛋白43（Cx43）表达的变化及与细胞周期分布的关系。[方法]分离培养大鼠心肌细胞,用血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大,72h后用RT-PCR和免疫荧光方法观察心肌细胞Cx43基因和蛋白表达,用流式细胞仪测定法观察心肌细胞周期分布变化以及Cx43表达量的关系。[结果]血管紧张素Ⅱ处理后的心肌细胞表现细胞肥大且细胞活力增强,S期、G2-M期细胞百分比增加,细胞内G2-M（二倍体）DNA含量降低,Cx43蛋白表达低于对照组,Cx43mRNA表达水平也较对照组明显下调,Cx43蛋白表达下调与细胞周期分布的改变相关。[结论]血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大后Cx43基因表达明显下调,导致Cx43蛋白表达亦出现下调,这一改变可能与心肌肥大过程中的细胞周期变化有关,提示血管紧张素Ⅱ可能通过调控Cx43基因的表达而参与缝隙连接重构过程,而Cx43表达的变化可能与心肌肥大的机制有关。     

环孢素A对血管紧张素Ⅱ诱导的新生大鼠心肌细胞肥大及c-fos表达的影响

目的 在培养的新生大鼠心肌细胞上观察环孢素A(CsA)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大和c-fos表达增加的作用，借以探讨CsA抑制血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥厚的机制。方法 用Bradford比色法测量心肌细胞总蛋白的含量；用Western Blot方法定量测定心肌细胞c-fos蛋白含量。结果 ①AngⅡ可明显增加心肌细胞的蛋白总量，CsA可以浓度依赖地抑制AngⅡ诱导的心肌蛋白含量的增加；②AngⅡ可诱导rfos蛋白表达增加，CsA可浓度依赖性抑制AngⅡ的这一作用。结论 CsA可以抑制AngⅡ诱导的培养新生大鼠心肌细胞肥大，抑制AngⅡ引起的心肌细胞c-fos蛋白表达增加可能是其作用机制之一。     

肾上腺素和血管紧张素Ⅱ促心肌细胞肥大的协同作用

目的：探讨肾上腺素和血管紧张素Ⅱ在诱导心肌细胞肥大反应中的协同作用。方法：在培养新生大鼠心肌细胞上,通过测量心肌细胞表面积和[3H]－Leu的掺入量来判断心肌细胞肥大。结果：肾上腺素和血管紧张素Ⅱ均能明显增加心肌细胞表面积和[3H]－Leu的掺入量,两者合用比它们任一单独使用的效果更显著。结论：肾上腺素和血管紧张素Ⅱ在诱导心肌肥大作用中具有协同作用。     

κ阿片受体激动对血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大的抑制作用

目的 通过观察κ阿片受体激动对血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大的作用,研究κ阿片受体激动剂对血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大的抑制作用.方法 以体外培养的乳大鼠心肌细胞为模型,应用血管紧张素Ⅱ1 μM诱导心肌肥大,观察U50488H1 μM对它的作用,并和洛沙坦(los)1 μM组做对比观察κ阿片受体的激活对心肌肥大的作用.用Lowry法检测心肌细胞蛋白含量;用消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积;用[3H]-leueine掺入法测定心肌细胞蛋白的合成.结果 AngⅡ1 μM使心肌细胞总蛋白含量,蛋白表迭及细胞体积明显增加;U50488H1 μM能够降低由AngⅡ引起的心肌细胞蛋白含量,蛋白表达,以及体积的增加,从而抑制心肌肥大,并且抑制程度与los1 μM相似.结论 κ阿片受体激动剂U50488H能够抑制由AngⅡ诱导的心肌细胞肥大.     

橙皮素对血管紧张素Ⅱ诱导H9C2心肌细胞肥大的影响

目的 探讨橙皮素对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导H9C2心肌细胞肥大的影响.方法 使用不同浓度橙皮素（0.125、0.25、0.5、1μmol/L）和AngⅡ（1μmol/L）共同孵育H9C2心肌细胞12h,心肌细胞骨架骨骼α肌动蛋白（α-actinin）荧光染色评估H9C2细胞面积改变以及real-time PCR方法检测心肌肥厚标志物BNP、β-MHC的mRNA表达变化,以观察不同浓度橙皮素对AngⅡ诱导H9C2心肌细胞肥大的影响,选择0.25 μmol/L橙皮素和AngⅡ（1μmol/L）共同孵育H9C2心肌细胞6、12、24h,观察橙皮素对AngⅡ诱导H9C2心肌细胞肥大抑制作用的时间相关性.结果 橙皮素干预可以缓解AngⅡ诱导H9C2心肌细胞的细胞面积增大;橙皮素抑制了AngⅡ诱导的H9C2心肌细胞BNP、β-MHC的mRNA表达水平升高.结论 橙皮素能够抑制AngⅡ诱导H9C2心肌细胞肥大,其有可能成为治疗心肌重构新的潜在药物.     

多胺在血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大中的作用

目的探讨多胺在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的心肌细胞肥大中的作用。方法乳鼠心肌细胞原代培养,AngⅡ诱导心肌细胞肥大复制心肌肥大细胞模型。检测心肌细胞表面积、心肌细胞蛋白含量,RT-PCR检测ANP mRNA水平作为心肌肥大评价指标;高效液相色谱测定心肌细胞多胺含量。结果AngⅡ100nmol/L作用48h,显著增加心肌细胞表面积,细胞蛋白含量和ANP mRNA表达增加,同时,AngⅡ诱导细胞内腐胺含量明显增加。DFMO干预后,减少细胞内腐胺和总多胺水平,下调AngⅡ诱导的心肌细胞表面积、心肌细胞蛋白含量,ANP mRNA水平的增加。结论DFMO预处理耗竭细胞内腐胺,减少多胺含量可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。     

血管紧张素Ⅱ对心肌细胞内皮型一氧化氮合酶基因表达的影响

【目的】观察血管紧张素Ⅱ对心肌细胞内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)表达的影响。【方法】用逆转录聚合酶链式反应 (RT -PCR)检测新生大鼠心肌细胞eNOSmRNA(以GAPDH为内标 )水平。【结果】在培养新生大鼠心肌细胞和非心肌细胞中均能检测到eNOSmRNA ,其中心肌细胞的表达高于非心肌细胞 ;血管紧张素Ⅱ作用 6、12和 2 4h ,心肌细胞eNOSmRNA水平明显减少。【结论】在大鼠心肌细胞和非心肌细胞皆有eNOS基因表达 ;血管紧张素Ⅱ可抑制心肌细胞eNOS基因的表达。     

钙调蛋白激酶Ⅱ信号转导途径在血管紧张素Ⅱ致心肌肥大反应中的调控作用

目的 研究钙调蛋白激酶Ⅱ(CAMKⅡ)途径在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导乳鼠心肌细胞肥大反应中的作用.方法 原代培养乳鼠心肌细胞,分为对照组(不加任何干预因素),肥厚组(Ang Ⅱ刺激心肌细胞肥大),缬沙坦组(缬沙坦直接作用于心肌细胞)和预处理组(缬沙坦进行干预30 min后,加入AngⅡ刺激心肌细胞).测定心肌细胞3H-亮氨酸掺入作为心肌细胞肥大的指标;用RT-PCR和Western blot法检测心肌细胞CAMK Ⅱδ的mRNA和蛋白质表达的水平.结果 ①AngⅡ在10-9～10-6 mol/L范围内剂量依赖性地增加乳鼠心肌细胞的3H-亮氨酸掺入.选择10-7 mol/L AngⅡ作用心肌细胞48 h为成功的心肌细胞肥厚模型.② AngⅡ(10-7 mol/L)处理心肌细胞48 h,可使3H-亮氨酸掺入明显增加,该作用可被缬沙坦明显抑制.③与对照组相比,肥厚组心肌的CAMKⅡδ mRNA水平显著增加;而缬沙坦预处理组较之肥厚组则显著下降.④与对照组相比,肥厚组心肌的CAMK Ⅱδ的蛋白质表达显著增加;而缬沙坦预处理组的CAMKⅡδ蛋白质表达水平较之肥厚组则显著下降.结论 ①CAMKⅡ信号转导通路激活是AngⅡ介导的心肌肥大反应重要环节之一.②缬沙坦抑制Ang Ⅱ介导心肌肥大反应的机制可能部分是通过抑制CAMKⅡδ的表达而实现的.     

Effect of Atorvastatin on Expression of Peroxisome Proliferator-activated Receptor Beta/delta in AngiotensinⅡ-induced Hypertrophic Myocardial CellsIn Vitro

Objective To explore the effect of atorvastatin on cardiac hypertrophy and to determine the potential mechanism involved. Methods Anin vitro cardiomyocyte hypertrophy from neonatal rats was induced with angiotensinⅡ (AngⅡ) stimulation. Before AngⅡ stimulation, the cultured rat cardiac myocytes were pretreated with atorvastatin at different concentrations (0.1, 1, and 10μmol/L). The following parameters were evaluated: the myocyte surface area,3H-leucine incorporation into myocytes, mRNA expressions of atrial natriuretic peptide, brain natriuretic peptide, matrix metalloproteinase 9, matrix metalloproteinase 2, and interleukin-1β, mRNA and protein expressions of theδ/β peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) subtypes. Results It was shown that atorvastatin could ameliorate AngⅡ-induced neonatal cardiomyocyte hypertrophy in the area of cardiomyocytes,3H-leucine incorporation, and the expression of atrial natriuretic peptide and brain natriuretic peptide markedly. Meanwhile, atorvastatin also inhibited the augmented mRNA level of several cytokines in hypertrophic myocytes. Furthermore, the down-regulated expression of PPAR-δ/β at both the mRNA and protein levels in hypertrophic myocytes could be significantly reversed by atorvastatin treatment. Conclusions Atorvastatin could improve AngⅡ-induced cardiac hypertrophy and inhibit the expression of cytokines. Such effect might be partly achieved through activation of the PPAR-δ/β pathway.     

自噬在血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大中的作用

【目的】探讨自噬在血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导心肌细胞肥大中的作用.【方法】原代培养的乳鼠心肌细胞,采用Ang Ⅱ干预建立心肌肥大的模型;在光学显微镜下观察心肌细胞的形态,采用Real time PCR技术检测心肌细胞肥大标志物心房利钠多肽(ANP)的表达,Western blot法检测LC3蛋白的表达.【结果】 Ang Ⅱ可抑制自噬相关基因LC3蛋白的表达,自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤(3MA)会促进AngⅡ诱导的心肌细胞肥大.【结论】AngⅡ可能通过抑制自噬来诱导心肌细胞肥大.     

阿托伐他汀对心肌肥大的抑制作用及FoxO1表达的影响

目的探讨阿托伐他汀(atorvastatin)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肥大心肌细胞的抑制作用及对转录因子FoxO1表达的影响。方法将H9C2细胞分为3组,对照组:未给予任何干预;心肌肥大组:给予AngⅡ(10-7 mol/L)刺激细胞;阿托伐他汀组:预先给予atorvastatin(10-5 mol/L),30min后AngⅡ(10-7 mol/L)刺激细胞。western-blotand real time PCR检测H9C2细胞FoxO1蛋白及mRNA含量,脑钠肽(brain natriuretic pepide,BNP)作为判断心肌肥大的指标。结果 AngⅡ诱导心肌细胞肥大后FoxO1表达较正常心肌细胞明显降低(P<0.05),而给予阿托伐他汀干预的肥大心肌细胞其FoxO1表达较肥大心肌明显升高(P<0.05)。结论阿托伐他汀可能通过上调FoxO1表达,从而抑制心肌肥大。     

人参皂苷Rb1抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大

目的观察人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1,Rb1)对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)所致心肌细胞肥大的影响。方法利用培养的新生大鼠心肌细胞,以细胞直径、蛋白含量为心肌肥大标志,观察药物的抗心肌肥大效应。ANFmRNA的表达用Real-timePCR检测;用Fura-2/AM负载的培养心肌细胞检测细胞内游离钙浓度([Ca2+]i)以探讨Rb1可能的作用机制。结果AngⅡ1×10-7mol.L-1使心肌细胞细胞直径明显增大,蛋白含量明显增加,心房利钠因子(atrial natriuretic factor,ANF)mRNA表达明显上调,并使细胞[Ca2+]i明显升高。Rb150、100和200μg/ml使经AngⅡ处理的心肌细胞直径分别缩短18.4%,32.7%和43.8%;心肌细胞蛋白含量分别减少8.4%、13.6%和17.2%;降低ANFmRNA的表达;Rb150、100和200μg/ml呈剂量依赖地抑制AngⅡ所致的[Ca2+]i升高,NO前体L-精氨酸L-arg10-3molμL-1具有相似的作用,NO合酶抑制剂L-NAME对Rb1的效应无明显影响。结论Rb1可抑制Ang...     

心肌细胞肥大中番茄红素对自噬的作用

目的 探讨在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的心肌肥大中,番茄红素对自噬的影响.方法 原代培养的乳鼠心肌细胞,采用AngⅡ干预建立心肌肥大的模型;用番茄红素和自噬的阻断剂3-甲基腺嘌呤（3MA）干预.在光学显微镜下观察心肌细胞的形态;采用Western blot法检测自噬相关基因6（Atg6）Beclin1及自噬相关基因8（Atg8）LC3蛋白的表达;Real time PCR技术检测心肌细胞肥大标志物心房利钠多肽（ANP）的mRNA表达.结果 在AngⅡ诱导的心肌肥大中[细胞面积（517.19±52.31）;ANP相对含量（17.83±2.07）],番茄红素[细胞面积（355.82±40.45）;ANP相对含量（12.16±1.41）]缓解了心肌细胞面积的增加（F=56.518,P＜0.05）,下调了ANP的mRNA表达水平（F=157.048,P＜ 0.05）.番茄红素增加了心肌肥大时自噬相关基因Beclin1[蛋白相对含量（0.685±0.058）,F=202.873,P＜0.05]和LC3蛋白相对含量[（0.608±0.045）,F=177.114,P＜0.05]蛋白的表达.自噬阻断剂3MA降低了番茄红素对心肌细胞肥大的抑制作用（P＜0.01）.结论 番茄红素可能通过激活自噬来抑制心肌细胞肥大.     

Role of cytoskeleton in the mechanisms of stretch-induced cardiomyocytical hypertrophy in vitro

Objective: To study in vitro the role of cyt0skcleton in the mechanisms of stretch-induced cardiomyocyte hypertrophy. Methods: After cultured on a deformable membrane, the myocardial cells were incorporated with ^3H-leucine(SH-leu) to determine the hypertrophic rate. The contents of angiotensin II and endothelin in the supcrnatant of the culture medium were measured with mdioimmunoassay. Results: Colchicine at 4μmol/L partially inhibited ^3Hleu incorporation rate of the stretch-induced cardiomyocytcs but cytochalasin B showed no such effect. The radioactivity of ^3H-leu incorporation in the supematant of the culture medium was significantly lower in the cardiomyocyte culture treated with colchicines (4μmol/L) or cytochalasin (0.4μmol/L) than in simple myocardial cell culture. In addition, the 2 a-gents markedly inhibited the myocardial cells fi‘om secreting angiotensin Ⅱ and endothin. Conclusion: The cytoskclcton plays a role in the stretch-induced mycardiocyte hypertrophy by mediating the secretion of the cell growth factors by the cells themselves.     

PI3K/Akt-NO信号通路在Ang Ⅳ诱导大鼠心肌肥大中的作用

目的研究PI3K/Akt-NO信号通路在血管紧张素Ⅳ(AngⅣ)诱导大鼠心肌细胞肥大中的作用。方法用乳鼠心肌细胞培养,以细胞表面积和心房利钠因子mRNA表达为心肌肥大指标,观察不同浓度AngⅣ对心肌细胞的作用,并观察PI3K阻断剂LY294002和NO合成酶(NOS)抑制剂L-NAME对AngⅣ作用的影响;利用Real-time PCR和Western blot方法检测mR-NA及蛋白水平的表达;硝酸还原法和ELISA法分别检测NO和内皮型NOS(eNOS)含量。结果 AngⅣ浓度依赖地(0.01、0.1及1nmol/L)诱导心肌细胞肥大;使Akt mRNA和蛋白表达明显降低,eNOS mRNA表达以及细胞培养液中eNOS的含量减少,NO的释放下降(P<0.05);LY294002和L-NAME均使AngⅣ的作用加强(P<0.05)。结论 AngⅣ诱导的心肌肥大作用至少部分地与PI3K/Akt-NO信号通路被抑制有关。     

水温改变对斑马鱼脊髓损伤修复的影响

目的 探讨成纤维细胞生长因子21 (FGF21)siRNA对链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病(T1DM)小、鼠心脏功能的影响机制.方法 16只8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组(n=6),FGF21siRNA对照组(n=10),16只T1DM模型小鼠分为T1DM组(n=6),T1DM+FGF21 siRNA组(n=10).T1DM模型由单次腹腔注射STZ(150 mg/kg)建立.8周后行FGF21siRNA给药.实验到达终点时采用小动物高分辨超声仪测量小鼠心脏功能;光学显微镜下HE染色观察心肌细胞形态,Masson染色观察纤维化程度,利用实时PCR技术检测心肌组织α-肌球蛋白重链(α-MHC),β-肌球蛋白重链(β-MHC),心厉钠尿肽(ANP)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)和Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)及FGF 21 mRNA的表达含量.结果 与正常对照组小鼠相比,T1DM小鼠的心脏功能减低,心肌细胞肥大,胶原纤维增生,伴随小鼠心肌组织ANP、α-MHC、β-MHC、Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA表达增加,T1DM小鼠经FGF 21siRNA处理后上述表现进一步加重.结论 FGF21siRNA能降低1型糖尿病小鼠的心脏功能,其机制可能与心肌肥大和心肌纤维化有关.     

吡格列酮对高糖高胰岛素诱导的肥大心肌细胞中CT-1的影响

目的：观察心肌营养素 1(CT 1)在高糖高胰岛素诱导的肥大心肌细胞中的表达，以及吡格列酮对其表达的影响。方法：体外培养乳鼠心肌细胞，分组给药后，检测心肌细胞肥大的指标：心肌细胞的表面积(图像分析法)、蛋白含量(考马斯亮蓝法)、心房利钠因子(ANF) mRNA的表达(RT PCR法)；同时用半定量RT PCR检测CT 1 mRNA的表达。结果：高糖高胰岛素组心肌细胞表面积、蛋白含量、ANF mRNA表达以及CT 1 mRNA水平均升高(P<0.01)，而吡格列酮治疗组降低(P<0.05)。结论：高糖高胰岛素诱导的肥大心肌中CT 1表达上升，而吡格列酮能抑制其表达，推测CT 1可能参与了高糖高胰岛素所引起的心肌肥大的发生，而吡格列酮抑制心肌肥大的作用可能是通过抑制CT 1介导的。     

AngⅡ对心肌细胞Kv4．2钾通道蛋白表达的影响及机制

【目的】体外培养新生大鼠心肌细胞,观察AngⅡ在诱导细胞肥厚过程中对Kv4．2蛋白表达的影响,及钙离子在其细胞内信号传导通路中的作用。【方法】AngⅡ心肌细胞肥大模型,用激光共聚焦显微镜检测AngⅡ对心肌细胞胞浆钙离子浓度的影响,用流式细胞仪检测AngⅡ诱导心肌细胞肥厚过程中细胞Kv4．2表达的变化。【结果】AngⅡ明显增加细胞的蛋白总量,诱导心肌细胞肥大,AngⅡ能增加心肌细胞胞浆钙离字浓度,下调Kv4.2编码的通道蛋白的表达含量。【结论】AngⅡ在诱导心肌细胞肥大过程中,可能通过细胞内钙离子以外的信号通路下调Ito通道蛋白Kv4．2。