乙型肝炎病毒e抗原(磁微粒化学发光法)试剂盒评价

目的本公司旨在建立乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)磁微粒化学发光免疫检测方法,为乙型肝炎疾病的治疗提供可靠的性能指标。方法本公司采用夹心法,固相顺磁微粒包被技术,样本中的HBeAg和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Anti-HBe与包被在磁微粒上的AntiHBe形成夹心复合物,通过与参比试剂盒进行临床比对,保证其有同等的临床诊断价值。结果本试剂盒的线性范围为0.1-200 PEI U/mL;空白限(LOB)为0.02 PEI U/mL,检出限(LOD)为0.04 PEI U/mL,功能灵敏度(FS)为0.05 PEI U/mL;分析内精密度8%,天间精密度10%;总不精密度15%;样品的回收率在85-115%之间。与血红蛋白、胆红素、甘油三脂无交叉。结论建立的乙型肝炎病毒e抗原磁微粒化学发光定量免疫分析方法灵敏度高、测定速度快、准确度高及特异性强,利于临床研究的开展,应用和推广前景巨大。     

磁微粒化学发光检测HBsAg试剂盒的研制及其临床应用

目的研制HBsAg磁微粒化学发光酶免疫分析试剂盒。方法以磁微粒为载体采用双抗体夹心法建立HBsAg的定量分析试剂盒,对反应条件进行优化并对试剂盒的各项指标进行评价。结果磁微粒粒径确立为5μm,试剂盒的线性范围为0.5~200ng/mL,相关系数r>0.99灵敏度adr、adw、ay均为0.5ng/mL,准确度高,批内变异系数6.3%,批间变异系数9.7%,热稳定性实验表明试剂在37℃条件下可稳定7d,本试剂盒与板式载体化学发光试剂盒比较其总符率达99.6%。结论试剂盒各项指标达到规定要求,可用于临床血清HBsAg定量检测。     

免疫PCR检测HIV-1 p24的实验研究

目的 以HIV-1 p24为检测对象,建立以金磁微粒为固相载体的免疫PCR检测技术.方法 以鼠抗HIV-1 p24单克隆抗体作为捕获抗体,包被金磁微粒,以生物素化的羊抗p24多克隆抗体作为检测抗体.报告DNA为甘蓝型油菜肉桂酰辅酶A还原酶基因的一个片段,用生物素标记的引物通过PCR扩增预先制备,通过链亲和素的桥联标记生物素化的多抗,被两抗体夹心捕获的人重组HIV-1 p24抗原通过PCR扩增报告DNA的方式予以检测.并且优化了免疫PCR的检测条件,对检测灵敏度进行了分析.结果 为降低非特异性扩增,链亲和素和用于标记的DNA的浓度分别控制在0.1mg/L和10ng/L.免疫PCR检测的灵敏度为0.1ng/L,比ELISA法检测的灵敏度高1.5×104倍.结论 金磁微粒为载体的免疫PCR检测HIV-1 p24抗原是一种灵敏度较高的检测方法.     

乙型肝炎表面抗体化学发光免疫分析法的建立

目的建立乙型肝炎表面抗体(HBsAb)化学发光免疫分析(CLIA)检测试剂盒。方法采用两株乙型肝炎表面抗原(HBsAg)分别包被磁微球和标记吖啶酯(AE),建立双抗原夹心化学发光免疫检测试剂盒,优化反应体系并对试剂盒的各项性能指标进行评价。结果 HBsAb-CLIA检测试剂的灵敏度为0.03 mIU/ml,测量范围为0.03~960 mIU/ml;分析内和分析间精密度分别为2.94%~5.14%和3.03%~6.33%;与乙型肝炎E抗体(HBeAb)、乙型肝炎核心抗体(HBcAb)等无交叉反应;673名正常人血清测试结果表明该检测试剂的正常参考范围为0~10 mIU/ml;用本试剂与进口雅培同类试剂同时检测1 411例临床样本,其相关方程为y=0.944x+4.056,相关系数为0.947。结论已成功制备操作简单,成本低,各项性能指标均能达到临床检测要求的HBsAb-CLIA试剂盒,可用于临床血清样本HBsAb浓度的测定。     

Luminex液相芯片同时检测tPSA和fPSA方法的建立与评价

 目的 建立用Luminex液相芯片技术同时测定前列腺特异性抗原（total prostate specific antigen,tPSA）和游离前列腺特异性抗原（free prostate specific antigen,fPSA）的方法,并对该方法进行评价。方法 制备抗体交联微球及藻红蛋白标记二抗,用双抗体夹心法对临床血清标本进行测定,并与ELISA方法进行比较。结果 Luminex液相芯片技术同时测定tPSA、fPSA与ELISA测定结果高度相关。Luninex方法测定tPSA的灵敏度为0.03 ng/L,批内精密度为4.38%~5.86%,批间精密度为3.40%~6.73%;测定fPSA的灵敏度为0.013 ng/L,批内精密度为5.08%~7.94%,批间精密度为3.77%~5.74%。结论 Luminex方法同时测定tPSA、fPSA具有灵敏度高、重复性好、系统误差小等优点,具有广泛的临床应用前景。     

液相芯片技术一步反应法联合定量测定人血清CEA、AFP和tPSA

目的 建立用液相芯片技术同时定量测定人血清中癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和总前列腺特异性抗原(tPSA)水平的一步反应法,并对该方法进行评价.方法 制备抗体交联微球及生物素标记抗体,用双抗体夹心法测定临床血清标本.结果 联合测定CEA、AFP和tPSA的线性范围分别为0.063～200 ng/ml、0.052～66.6 ng/ml、0.016～20 ng/ml;最低检测限分别为31.3 pg/ml、26.0 pg/ml、7.8 pg/ml;批内精密度<10 %,批间精密度<14 %;血清标本CEA、AFP和tPSA检测值与化学发光免疫分析法(CLIA)测值的相关系数为0.920～0.940,与液相芯片两步反应法测值的相关系数为0.952～0.979.该方法仅需1 μl标本,2 h即可完成检测.结论 液相芯片一步反应法具有高通量、检测范围广、灵敏度高、重复性好、节省样品和时间等优点,具有较大临床应用潜力.     

疟原虫胶体碳试纸条的研制

目的建立一种简单、灵敏的疟疾诊断方法,并能对疟原虫感染进行定量分析。方法运用双抗体夹心免疫层析法,胶体碳标记间日疟原虫乳酸脱氢酶(Pv-LDH)和恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ(Pf-HRP2)特异抗体,与疟原虫相应抗原结合,胶体碳抗原抗体复合物被NC膜上包被的疟原虫特异性抗体捕获并显色。曲线拟合疟原虫抗原浓度与对应的检测带灰度值,选取相关系数最高的拟合方程式。检测不同贮存条件的试纸条灵敏度稳定性,确定最佳保存条件。检测疟疾病人及健康人全血,判断试纸条与镜检法相比较的特异性、敏感性、符合率。结果成功制作了间日疟原虫和恶性疟原虫胶体碳标记特异抗体试纸条,灵敏度分别为5、2.5 ng/ml;检测线性范围分别为5~500 ng/ml、2.5~500 ng/ml。检测带灰度值与疟原虫抗原浓度呈正相关,可对疟原虫感染定量分析。4℃保存6个月后,灵敏度基本不变。与镜检法比较,试纸条的敏感性、特异性、符合率在95%以上。结论疟原虫胶体碳试条操作简便、快速,敏感性和特异性高,适合疟疾的快速定量诊断。     

双抗体夹心ELISA定量检测IL-2-HSA融合蛋白

以抗人IL-2多克隆抗体为包被抗体,以IL-2-HSA融合蛋白为夹心抗原,以辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗HSA单克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定完整的IL-2-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法。包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度分别为为2 μg/mL和0.5 μg/mL,方法的线性检测范围39.06~1250 ng/mL,标准曲线回归方程为y=0.442 9 x-1.143 3,r=0.996 6,灵敏度可达10.25 ng/mL,批内、批间变异系数分别为6.40%和7.81%,发酵上清液中回收率为98.13%~102.94 %,与IL-2、HSA基本无交叉反应,健全性分析表明发酵液及小鼠血清组分及稀释倍数对该方法无影响。该方法可用于该融合蛋白的发酵过程优化、分离纯化工艺、后期药动学、临床研究等的定量检测。     

液相芯片技术定量检测人血清PSA反应模式的建立

目的 建立利用液相芯片技术定量检测人血清中前列腺特异性抗原的反应模式,并对该方法进行评价.方法 应用液相芯片技术检测50例前列腺增生患者血清中的前列腺特异性抗原(PSA),评价该方法的线性范围、最低检测限、精密度等指标,并将结果与化学发光免疫分析法(CLLA)进行相关性分析.结果 液相芯片技术检测PSA标准曲线的线性范围为0.022～129.6ng/mL,PSA的最低检测限为0.018ng/mL,检测PSA的批内CV为2.18%～2.28%,批间CV为1.61%～4.18%.用液相芯片技术和化学发光法分别对受检血清标本进行PSA定量分析,结果表明两法差异无显著性(P>0.05),r=0.9984,相关性良好.结论 液相芯片技术具有线性范围广、灵敏度高、重复性好、节省样品和时间等优点,具有临床应用潜力.     

胱抑素C的IgG-和IgY-ELISA检测体系的建立与评价

目的建立适用于检测人胱抑素C（Cystatin C）的IgG与IgY双抗体夹心ELISA检测体系。方法以人Cystatin C作为抗原免疫产蛋的罗曼鸡和新西兰兔,纯化抗Cystatin C的鸡抗体IgY和兔抗体IgG,并分别建立三种ELISA夹心检测体系,I：捕捉抗体IgG＋检测抗体IgY＋抗鸡IgY酶标抗体;Ⅱ：捕捉抗体IgG＋检测抗体IgY＋兔F（ab＇）2抗鸡酶标抗体;Ⅲ：捕捉抗体IgY＋检测抗体IgG＋抗兔IgG酶标抗体。通过比较Cystatin C的最低检测浓度和阴性对照的OD值评价三种夹心法的灵敏度和特异性。结果体系I的Cystatin C最低检测浓度为7.5ng/mL（阴性对照OD值为0.737）,体系Ⅱ的Cystatin C最低检测浓度为13ng/mL（阴性对照OD值为0.313）,体系Ⅲ的Cystatin C最低检测浓度为10ng/mL（阴性对照OD值为0.31）。结论成功建立了Cystatin C的双抗体夹心ELISA检测体系,体系I的灵敏度最高但其特异性差,体系Ⅱ和Ⅲ的检测灵敏度和特异性均较好,可以用于Cystatin C的检测。     

透明质酸单克隆抗体的制备及免疫分析方法的建立

将1-氰基-4-二甲胺吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化后的透明质酸(HA)与牛血清白蛋白(BSA)共价偶联制备完全抗原BSA-HA,纯化后免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备HA特异性单克隆抗体,考察单抗的生物学特性,并建立HA定量免疫分析方法——间接竞争ELISA法。研究表明,完全抗原BSA-HA免疫BALB/c小鼠后,能诱导HA特异性抗体的分泌;经细胞融合、选择性培养、筛选和亚克隆,获得一株稳定分泌HA特异性抗体的杂交瘤细胞8B6,其腹水抗体效价达1∶256 000以上,亲和常数为6.71×10⁹ mol^-1,独特型为IgG1;以10.0 ng/mL HA包被酶标板,1.0% BSA为封闭剂,建立HA间接竞争ELISA法,其线性范围介于0.01~10.0 μg/mL,特异性好、灵敏度高。     

癌胚抗原化学发光免疫定量分析方法的建立

目的建立检测癌胚抗原化学发光免疫定量分析方法。方法采用双抗体异位点一步夹心法,以癌胚抗原单克隆抗体作为固相包被,采用改良过碘酸钠法进行癌胚抗原多克隆抗体与碱性磷酸酶偶联制备酶标抗体;以金刚烷胺衍生物CSPD作为底物,优化CSPD与SapphireⅡ发光体系;用国家标准品校定定量标准品,建立了人血清CEA的化学发光免疫定量分析法。用该法检测800份正常人血清,确定参考值范围,将临床血清标本100份与bayerAcs:180全自动发光系统进行比较。结果本方法的最低检出量为0.5 ng/mL,线性范围0.5~640.0ng/mL,批内和批间的变异率分别为8.6%和7.5%,回收率在97.4%~101.8%之间。与AFP(3μg/mL)的交叉≤0.015%;与铁蛋白(10μg/mL)≤0.034%;与人血清白蛋白(200 g/L)≤4.5×10-8,与人血清丙球蛋白(100 g/L)≤5.0×10-8,与bayerAcs:180比较相关系数r=0.968(P<0.001)。结论建立的癌胚抗原化学发光免疫分析法可常规用于临床检测。     

磁微粒化学发光免疫分析法检测肝纤四项的性能验证

目的对磁微粒化学发光免疫分析法检测透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原N端肽(PⅢNP)、Ⅳ型胶原(CⅣ)性能进行评价。方法按照美国临床实验室标准化委员会文件中的方法对批内精密度、日间精密度、线性范围、携带污染率、正确度进行方法学验证。结果批内精密度和日间精密度高,变异系数(CV)<15%;线性范围性能验证结果肝纤四项线性相关系数R~2均>0.99;携带污染率为0.839 2×10~(-5);肝纤四项低浓度的正确度在-0.66%~7.53%之间,高浓度在-0.93%~7.98%之间。结论磁微粒化学发光免疫分析法检测肝纤四项的五大性能指标均符合标准要求。     

低分子肝素对肾小球系膜细胞产生细胞外基质的影响

[目的]了解不同葡萄糖浓度环境下,低分子肝素对人系膜细胞表达纤维连接蛋白(FN)和IV型胶原作用。[方法]培养人肾小球系膜细胞,分为正常葡萄糖组、高葡萄糖组及加低分子肝素组,培养24、48 h收集细胞上清液,用酶联免疫法检测FN和IV型胶原。[结果]高糖组24和48 h FN分别为(1.552±0.546)ng/mL和(2.547±0.968)ng/mL明显高于正常糖组(0.777±0.076)ng/mL和(1.180±0.091)ng/mL(P<0.01);IV型胶原分别为(64.577±5.543)ng/mL和(80.140±6.605)ng/mL,明显高于正常糖组(42.468±5.615)ng/mL和(46.368±5.714)ng/mL(P<0.01)。在低分子肝素1 ng/mL的作用下,高糖组的FN24 h及FN48 h分别降低为(1.070±0.349)ng/mL及(1.918±0.074)ng/mL,IV型胶原24 h及IV型胶原48 h分别降低至(41.993±7.470)ng/mL及(40.490±4.377)ng/mL。低分子肝素提高至10 ng/mL时,高糖组的FN24 h及FN48 ...     

抗猪鼻支原体单克隆抗体的研制及双抗体夹心ELISA检测法的建立

目的 制备多种抗猪鼻支原体的单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA方法用于该病原体的检测.方法 用猪鼻支原体CVCC361免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术和酶联免疫吸附实验筛选出抗该病原体的单克隆抗体;运用免疫双向扩散试验、Westem blotting确定IgG亚类及针对抗原的相对分子质量;筛选出配对抗体,建立双抗体夹心ELISA的检测方法,并评价其灵敏度和特异性.结果 共筛选出17株单克隆抗体,抗体亚类分别为ISG1、IsG2、 IgG2b、IgG3,免疫印迹结果表明单抗ZBI、ZB2及ZB16与相对分子质量为35×103的抗原有特异性结合,而ZB3和ZBl0与相对分子质量为70 × 103的抗原有特异性结合.确定了2个配对抗体(ZBI-ZBI-HRP和ZB1-ZB2-HRP),可检出最小抗原量为30ng/mL,检出猪鼻支原体活菌8.34×102CFU/mL,与人呼吸道常见的致病菌及支原体均无非特异性反应.结论 筛选的单克隆抗体具有较高的特异性和敏感性,应用双抗体夹心ELISA方法可用于猪鼻支原体的检测.     

甲胎蛋白化学发光免疫定量分析方法的建立

目的:建立检测甲胎蛋白化学发光免疫定量分析方法.方法:采用双抗体异位点一步夹心法,以甲胎蛋白单克隆抗体作为固相包被,采用改良过碘酸钠法进行甲胎蛋白多克隆抗体与碱性磷酸酶偶联制备酶标抗体;以金刚烷胺衍生物CSPD作为底物,优化CSPD与SapphireII发光体系;用国家标准品校定定量标准品,建立了人血清AFP的化学发光免疫定量分析法.用该法检测800份正常人血清,确定正常值参考范围,将临床血清标本100份与bayer Acs:180全自动发光体系统进行比较.结果:本方法的最低检出量为2.0 ng /mL,线性范围2.0～600.0 ng/mL,批内和批间的变异率分别为6.7%和7.7%,回收率在98.2%～102.5%之间.与CEA(3 μg/mL)的交叉≤0.15%;与铁蛋白(10 μg /mL) ≤0.04%;与人血清白蛋白(200 g/L)≤2.5×10-8,与人血清丙球蛋白(100 g/L)≤2.0×10-8,与bayer Acs:180比较相关系数r=0.994(P＜0.001).结论:建立的甲胎蛋白化学发光免疫分析法可常规用于临床检测.     

应用量子点及磁微粒技术快速检测阴道毛滴虫抗原

目的 以阴道毛滴虫(trichomonas vaginalis,Tv)检测为切入点,构建以量子点和磁微粒技术为基础的夹心法快速检测抗原技术,为同步多项抗原检测作准备.方法 针对Tv特异性黏附蛋白AP33制备其抗体,以碳二亚胺交联法,分别连接抗体.量子点及抗体-磁微粒加入待测抗原AP33结合后,在荧光显微镜下观测结果.结果 确立了本检测系统的最优条件,对AP33的检测与儿种阴道常见病原菌无交叉反应,检测限为0.05υg/ml.结论 成功构建了量子点磁微粒检测技术,对Tv抗原检测,特异度为90%,准确率为88%.     

MLCK定量检测的双抗体夹心ELISA方法建立

目的:建立定量检测人肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的双抗夹心ELISA法.方法:用抗MLCK兔多克隆抗体包被酶标板,1％小牛血清白蛋白(1％BSA)作为封闭液,抗MLCK羊多克隆抗体和HRP-兔抗羊抗体分别为包被抗体和检测抗体,建立双抗体夹心ELISA法,并进行了实验条件的优化;同时对新建立方法的灵敏度、精密度进行了评价...     

应用时间分辨荧光免疫分析技术检测SARS病毒抗原的初步研究

目的 建立定量检测SARS冠状病毒N蛋白的时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)。方法 采用经SARS-CoVN蛋白和配对实验筛选的两株抗SARSN蛋白单克隆抗体,以双抗体夹心法为基础建立检测SARS-CoVN抗原的时间分辨荧光免疫分析技术,进行方法学的评价,并与相应ELISA试剂盒进行比较。结果 该法的测量范围为(0.02~150)ng/ml,灵敏度为0.02ng/ml;批内、批间CV分别为(3.3~6.2)%和(5.3~9.6)%,与采用ELISA试剂盒检测灭活SARS-CoVN蛋白情况比较的结果一致。结论 本研究建立的检测SARSN蛋白的时间分辨荧光免疫分析技术灵敏度高,特异性好,具有潜在的临床应用价值。     

双抗原夹心ELISA法检测烟曲霉硫氧还蛋白还原酶抗体

目的：建立检测烟曲霉硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase GliT,TR）特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,同时对其临床应用进行评价。方法：利用基因工程技术制备重组TR作为包被抗原和酶标记抗原,采用棋盘滴定法优化双抗原夹心ELISA法的反应条件,并考察ELISA法的敏感性、特异性以及重复性。用双抗原夹心ELISA法测定273例住院患者（侵袭性曲霉病50例、侵袭性念珠菌病46例、念珠菌定植82例、细菌感染95例）以及200例健康人血清,并与实验室前期建立的间接ELISA法检测TR抗体的结果进行比较。结果：双抗原夹心ELISA法工作条件为TR抗原包被浓度为1.0 μg/mL,酶标抗原1∶500稀释;封闭液含50 g/L脱脂奶粉溶液的PBS?T,待测血清稀释度为1∶100。患者血清检测结果显示,高、中、低3份血清批内变异系数（CV）分别为11.2%、11.8%和12.3%;不同批次重复测定6次,其批间CV分别为10.9%、12.1%和13.5%。重组抗原对血清中相应抗体的阻断率为94.4%。通过ROC曲线确定吸光度的cut?off值为0.126。检测侵袭性曲霉病的敏感性和特异性分别为80.0%（40/50）和95.5%（404/423）,敏感性高于检测TR抗体的间接ELISA法（83.3% vs. 72.2%）。结论：建立了双抗原夹心ELISA法检测烟曲霉TR特异性抗体,可提高侵袭性曲霉病的诊断率,具有临床应用价值。