基于Drp1-Ser637磷酸化探讨补阴牵正方对PD小鼠脑线粒体的影响

目的通过帕金森病(PD)小鼠脑动力相关蛋白1(Drp1)和其磷酸化位点丝氨酸637(Ser637)表达的变化及对脑线粒体的影响探讨补阴牵正方防治PD的可能机制。方法选用C57BL/6小鼠72只,随机分为正常组、模型组、补阴牵正方组、美多芭组,每组18只。除正常组外,其余3组小鼠腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)建立PD模型,补阴牵正方组灌胃补阴牵正方水煎剂,每天灌胃2次,连续28 d,美多芭组腹腔注射美多芭,隔天1次,共28 d。爬杆法、抓握法观察小鼠行为学;免疫荧光组化法观察中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数目;荧光素酶法测定脑线粒体三磷酸腺苷(ATP);JC-1法检测脑线粒体膜电位;蛋白印迹法(Western blot)检测脑蛋白Drp1及其磷酸化蛋白Drp1-Ser637表达。结果相比正常组,模型组小鼠爬杆时间延长(P0.01),抓握力度减弱(P0.01),黑质TH阳性神经元数目减少(P0.01),脑线粒体膜电位及ATP水平降低(P0.01),脑Drp1蛋白表达增加(P0.01),Drp1-Ser637磷酸化蛋白表达降低(P0.01)。与模型组相比,补阴牵正方组小鼠在第14天爬杆时间缩短、握力明显增加(P0.05),黑质TH数目明显增加(P0.05),Drp1蛋白表达减少(P0.01),Drp1-Ser637磷酸化蛋白表达增加(P0.05),脑线粒体膜电位及ATP水平显著升高(P0.01);而美多芭组除在第14天行为学较模型组有明显改善外(P0.05),其余指标均无统计学差异;补阴牵正方组与美多芭组比较其黑质TH数目、ATP水平及膜电位均有差异(P0.05,P0.01),Drp1-Ser637磷酸化蛋白表达也显著增加(P0.01)。结论补阴牵正方可能通过下调维持线粒体动态平衡的分裂蛋白Drp1、上调Drp1-Ser637磷酸化位点的表达改善PD小鼠脑线粒体功能,从而保护中脑黑质多巴胺神经元达到防治PD的作用。     

醒脑启智胶囊对血管性痴呆小鼠脑组织海马细胞Bcl-2和Bax蛋白的影响

目的 探讨中药醒脑启智胶囊对血管性痴呆小鼠脑组织海马细胞Bcl-2和Bax蛋白的影响.方法 将120只昆明种小鼠随机分为假手术组、模型组、醒脑液高剂量组、醒脑液低剂量组、银杏叶液对照组、尼莫地平液对照组,每组20只,采用双侧颈总动脉结扎反复脑缺血再灌注的方法制备血管性痴呆小鼠模型.术后15 d进行行为学实验和脑组织的病理形态学观察,并用流式细胞术检测各组海马细胞Bcl-2和Bax蛋白的含量.结果 （1）行为学实验显示,模型组小鼠学习成绩与记忆成绩下降,各治疗组小鼠的学习成绩与记忆成绩均有提高（P＜0.05）.（2）光镜下病理形态学显示,术后模型组小鼠脑组织海马区呈缺血性病理改变,各治疗组小鼠病变轻于模型组.（3）流式细胞术检测显示：模型组小鼠脑组织海马细胞Bcl-2和Bax蛋白含量高于假手术组（P＜0.01）,但二者的比值低于假手术组（P＜0.01）;各用药组与模型组比较,Bax蛋白降低（P＜0.01）,Bcl-2蛋白与Bcl-2/Bax的比值升高（P＜0.05）.结论 醒脑启智胶囊对血管性痴呆小鼠有明显治疗作用,其作用机制之一是调节海马细胞Bcl-2和Bax蛋白的表达.     

Sirt1在缺氧条件下对心肌细胞线粒体融合与分裂中的作用

目的 探讨缺氧条件下线粒体动态学变化及Sirt1在其中的作用.方法 ①收集2014年于新桥医院心血管外科行手术治疗的先心病患儿29例,其中非紫绀型先心病14例,紫绀型先心病15例,取术中所切除的右室流出道心肌组织为心肌标本,Western blot检测促线粒体分裂蛋白Drp1与Fis1表达情况.②将H9c2心肌细胞置入缺氧培养箱(94％N2,5％ CO2,1％ O2)中进行培养,检测缺氧0、2、4、8、12 h后促线粒体分裂蛋白Drp1与Fis1的表达水平.③将线粒体靶向质粒分别同空载质粒、Sirt1过表达质粒和Sirt1干扰质粒共转染H9c2细胞,常氧或缺氧培养箱中培养12 h后,激光共聚焦显微镜下观察线粒体融合、分裂情况;④运用腺病毒Ad-Sirt1和慢病毒Lv-Sh-Sirt1分别在H9c2细胞中过表达或干扰Sirt1后,将细胞置于缺氧培养箱中培养12 h,检测Drp1与Fis1表达水平;⑤分别转染空载质粒、Sirt1过表达质粒和Sirt1干扰质粒至H9c2细胞后,缺氧培养12 h,LDH试剂盒检测细胞毒性.结果 ①同非紫绀组相比,紫绀组心肌中Drp1与Fis1表达显著增高,Drp1相对灰度值:[(0.47±0.11)vs(0.76±0.12)、Fis1相对灰度值(0.53 ±0.02)vs (0.83 ±0.03),P＜0.05];②细胞水平研究结果显示Drp1与Fis1的蛋白表达随缺氧的时间的延长呈递增趋势;③激光共聚焦结果表明,Sirt1过表达后能够一定程度地缓解缺氧诱导的线粒体分裂(P＜0.05),而当Sirt1受到干扰后,缺氧所诱导的线粒体分裂水平明显提高(P＜0.05);④在缺氧条件下,过表达Sirt1能够抑制Drp1与Fis1蛋白表达水平(P＜0.05),而Sirt1被抑制后,Drp1与Fis1蛋白表达水平增加(对照组,过表达组,低表达组Drp1相对灰度值依次为[(0.47 ±0.02)vs(0.36±0.02) vs (0.78 ±0.04);Fis1相对灰度值依次为(0.64±0.02) vs (0.42±0.02) vs (0.80±0.04),P＜0.05];⑤Sirt1过表达能够降低缺氧刺激后H9c2心肌细胞的死亡率.结论 Sirt1可能通过调控促线粒体分裂蛋白Drp1与Fis1表达水平促进心肌细胞在缺氧条件下的适应.     

二氢杨梅素抑制高脂喂养小鼠肝脏脂肪蓄积与线粒体融裂基因变化的关系

目的 探讨肝脏线粒体融裂相关基因表达变化在二氢杨梅素抑制高脂喂养小鼠肝脏脂肪蓄积中的可能作用.方法 45只6周龄C57BL/6J雄性小鼠,按随机数表法分为普通饲料组(CON),高脂饲料组(HFD)和高脂加二氢杨梅素组(HFD+ DHM),每组15只,干预12周.检测小鼠体质量、肝脏指数、血清生化指标;分别采用HE染色和油红O染色观察肝细胞脂肪变性和脂滴数量与形态.使用增强型ATP试剂盒检测肝脏ATP含量;采用荧光定量PCR和Western blot分别检测肝脏线粒体融合与分裂相关基因[动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)、分裂蛋白1(fission 1,Fis1)、融合蛋白2(mitofusion 2,Mfn2)、视神经萎缩蛋白1(optic atrophy1,Opa1)]的mRNA及蛋白表达.结果 与CON组相比,HFD组小鼠体质量、肝脏指数、空腹血糖、空腹胰岛素水平、甘油三酯、总胆固醇、低密度胆固醇明显增高(P＜0.05),肝脏ATP含量显著降低(P＜0.05),HE染色见明显的肝内脂肪空泡和肝细胞气球样变,油红O染色见大量的脂滴蓄积,肝脏组织Fis1、Drp1 mRNA和蛋白表达显著增高(P＜0.05),而Mfn2、Opa1明显降低(P＜0.05).二氢杨梅素干预显著抑制高脂喂养诱导的肝脏指数、空腹血糖、空腹胰岛素和血甘油三酯的升高,肝脏脂肪蓄积以及肝脏ATP含量的降低,并且明显拮抗高脂诱导的线粒体分裂与融合基因mRNA和蛋白的表达水平变化.结论 二氢杨梅素可明显改善高脂喂养小鼠肝脏的脂肪蓄积,该效应可能与其调节肝脏线粒体的融合与分裂有关.     

保肝解毒颗粒对急性肝损伤小鼠肝细胞Bcl-2、Bax表达的影响

目的:观察保肝解毒颗粒对雷公藤多苷所致小鼠急性肝损伤肝细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响,探讨保肝解毒颗粒的干预作用。方法:60只昆明种清洁级小鼠随机分为6组,即空白组,模型组,对照组,保肝解毒颗粒给药高剂量组、中剂量组、低剂量组。造模前,每天1次,给予小鼠灌胃不同剂量的保肝解毒颗粒,连续5 d;对照组灌服甘利欣混悬液;空白组、模型组灌服生理盐水。第5天给药后禁食12 h,以雷公藤多苷造模。免疫组织化学法检测肝细胞Bcl-2、Bax基因表达。结果:与正常组对比,模型组Bcl-2蛋白表达下降(P0.05),而Bax蛋白阳性表达升高(P0.05);保肝解毒颗粒组与模型组对比,下调Bax蛋白表达(P0.05),上调Bcl-2蛋白表达(P0.05)。结论:保肝解毒颗粒可以下调促凋亡基因Bax水平,上调抗凋亡基因Bcl-2水平,抑制细胞凋亡,从而起到对肝脏的保护作用,这可能是其治疗急性肝损伤的机制之一。     

长期低剂量锰染毒对子代大鼠睾丸生精细胞线粒体状态和细胞凋亡的影响

目的 探讨长期低剂量氯化锰染毒对子代大鼠睾丸生精细胞线粒体形态和凋亡的影响.方法 健康雌性SD大鼠32只分为对照组、低、中、高剂量组.腹腔注射2、4和8 mg/kg MnCl2·4H2O或生理盐水,1次/天,5天/周,共8周,并在妊娠期和哺乳期继续染毒.每组8只12周龄子代大鼠断头处死后,观察睾丸生精小管结构和生精细胞线粒体形态、视神经萎缩蛋白1(Opa1)、动力相关蛋白1(Drp1)、半胱氨酸蛋白酶9(Caspase9)表达和细胞凋亡情况.结果 随锰染毒剂量增加,生精细胞层数逐渐减少,细胞排列紊乱、数量减少;中、高剂量组可见线粒体分离、肿胀等表现;中、高剂量组Opa1显著降低(P＜0.05,P＜0.01),Drp1、Caspase9则随锰染毒剂量增加而递增(P＜0.05,P＜0.01);锰染毒组生精细胞凋亡指数随锰染毒剂量增加而上升(P＜0.05).结论 长期低剂量锰染毒可调节Opa1/Drp1基因表达而影响线粒体功能,导致子代大鼠生精细胞凋亡.     

补元清脑颗粒对APP /PS1 双转基因小鼠学习记忆及Bax、Bcl-2表达的影响

目的观察补元清脑颗粒对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力及Bax、Bcl-2表达的影响。方法将40只APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、多奈哌齐组、补元清脑颗粒高剂量组和低剂量组,每组10只,同月龄相同遗传背景C57BL/6J小鼠10只为空白组。从5月龄开始分别灌胃,1天1次。空白组、模型组均给予等容积生理盐水灌胃。连续灌胃30天后进行Morris水迷宫测试评定各组小鼠学习记忆能力;采用Western Blot法检测小鼠海马组织Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果与模型组比较,补元清脑颗粒高、低剂量组均可减少小鼠Morris水迷宫测试的上平台潜伏期[(37.90±20.10)s比(66.98±21.00)s,P0.01;(47.65±22.93)s比(66.98±21.00)s,P0.05]、减少游泳总路程[(414.94±171.10)cm、(559.72±178.76)cm比(1032.12±118.66)cm,P0.01]和第一次抵原平台时间[(21.36±20.22)s、(27.82±21.96)s比(51.71±20.96)s,P0.01],增加穿越平台次数[(5.90±1.60)次比(1.80±1.41)次,P0.01;(4.60±1.71)次比(1.80±1.41)次,P0.05]和目标象限时间[(17.71±7.58)s、(14.07±7.08)s比(5.55±4.42)s,P0.01],增加小鼠海马组织Bcl-2蛋白相对表达量(0.52±0.07比0.15±0.06,P0.01;0.42±0.06比0.15±0.06,P0.05)。结论补元清脑颗粒对APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆能力具有改善作用,及有一定的抗神经元凋亡作用。     

线粒体动力学改变对APP/PS1小鼠移植黑色素瘤生长的抑制作用

目的：探讨线粒体动力学的变化对APP/PS1转基因小鼠移植黑色素瘤生长的抑制作用及其机制。方法：将C57BL/6J （C57）和APP/PS1雄性小鼠分为C57移植瘤组（n=7）和APP/PS1移植瘤组（n=7）。观察2组小鼠肿瘤出现时间并计算肿瘤体积,绘制移植瘤生长曲线。光学显微镜观察2组小鼠肿瘤组织形态表现,Western blotting法检测2组小鼠肿瘤组织中线粒体融合蛋白2（Mfn2）、动力相关蛋白1（Drp1）、线粒体分裂蛋白1（Fis1）、泛素化及多泛素化蛋白、LC3、PINK1及Parkin蛋白表达水平。结果：C57移植瘤组和APP/PS1移植瘤组小鼠皮肤下均见肿瘤组织,肿瘤细胞内呈现黑色素颗粒。与C57移植瘤组比较,APP/PS1移植瘤组小鼠出瘤时间晚,肿瘤组织体积小（P<0.05）。小鼠肿瘤组织中Mfn2表达水平降低（P<0.05）,Fis1和Drp1表达水平升高（P<0.05）,泛素化及多聚泛素化蛋白、LC3-Ⅱ、PINK1和Parkin蛋白表达水平升高（P<0.05）。结论：APP/PS1小鼠移植瘤模型肿瘤生长缓慢,其机制可能与PINK1/Parkin通路参与线粒体自噬有关。     

Bcl-2和Bax蛋白在大鼠脑缺血预处理脑组织中的表达及意义

目的:探讨Bcl-2和Bax蛋白在大鼠局灶性脑缺血预处理脑组织中的表达及意义.方法:线栓法阻断SD大鼠大脑中动脉建立脑缺血预处理及脑缺血模型.TTC染色法测量脑梗死体积,免疫组织化学检测前脑皮质、基底核Bcl-2和Bax蛋白的表达.结果:与缺血组相比,预处理缺血组脑梗死体积明显减小(P＜0.01),Bcl-2蛋白表达细胞数明显增加(P＜0.01),Bax蛋白表达减少(P＜0.05).结论:缺血预处理诱导Bcl-2蛋白表达增加和Bax蛋白表达下降可能是缺血预处理诱导抗凋亡、产生脑保护机制的原因之一.     

照射时间延长对小鼠LEWIS肺癌细胞杀伤作用影响

目的 模拟调强适形放射治疗(IMRT)模式,观察照射时间延长对小鼠LEWIS肺癌细胞杀伤作用的影响及凋亡相关基因蛋白Bcl-2、Bax表达的变化.方法 荷LEWIS肺癌的C57BL/6 雄性小鼠40只,随机分成假照组、常规照射组(A组)及IMRT模拟组(B1组、B2组).按设计要求对各个照射剂量点进行照射,每个剂量点分5 次照射,其间分别间隔7.0、10.5 min,照射后取出肿瘤,用末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡指数,并采用免疫组化技术检测凋亡相关基因蛋白Bcl-2、Bax的表达水平.结果 各组凋亡指数的差别有显著性(F=161.54,P＜0.01),其中假照组的凋亡指数最低,A组的凋亡指数最高.各组间Bcl-2蛋白的半定量测定结果比较差别有统计学意义(F=737.40,P＜0.01),其中假照组的Bcl-2蛋白含量最高,A组的含量最低.各组Bax蛋白的半定量测定结果比较差别有统计学意义(F=161.45,P＜0.01),其中假照组的Bax蛋白含量最低.结论 在一定的范围内,随着照射时间延长,小鼠LEWIS肺癌细胞Bax表达降低,而Bcl-2表达升高,凋亡指数下降.照射时间延长可导致高能X线对小鼠LEWIS肺癌细胞杀伤作用降低.