树鼩鞭毛虫的形态学观察及其18S rRNA基因分析

目的 对树鼩体内的鞭毛虫进行形态学观察及基因分析鉴定。方法 取树鼩回盲部内容物和粪便经过滤离心处理直接涂片和碘液染色镜检,传统方法提取虫体总DNA,PCR扩增该鞭毛虫的18S rRNA,测序后经BLAST进行同源性分析,并应用MEGA5.1绘制系统发育进化树。结果 形态学观察表明树鼩体内的鞭毛虫为三毛滴虫;测序分析表明树鼩鞭毛虫序列18S rRNA与已报道的胎儿三毛滴虫18S rRNA(AY754332.1)同源性高达99%。结论 树鼩体内可感染胎儿三毛滴虫,研究结果为树鼩的寄生虫学质量控制提供依据。     

成年中缅树鼩大脑BDNF、trkB、ChAT mRNA与蛋白的表达

目的 观察成年中缅树鼩大脑BDNF、trkB、ChAT mRNA及蛋白的表达。方法 利用q-PCR和Western blotting方法检测成年中缅树鼩大脑海马、基底核和皮层BDNF、trkB、ChAT mRNA及蛋白的表达。结果 成年树鼩大脑BDNF mRNA在海马最高,与基底核和皮层差异具有显著性(P<0.01);trkB mRNA在海马最低,额叶皮层最高,二者间差异显著(P<0.05);ChAT mRNA在海马、基底核和额叶皮层的表达差异无显著性(P>0.05)。成年树鼩大脑BDNF蛋白表达在基底核最高,与海马或皮层有显著性差异(P<0.01);树鼩大脑3个部位trkB、ChAT蛋白表达差异无显著性(P>0.05)。结论成年树鼩大脑海马、基底核和皮层ChAT mRNA表达与蛋白表达具有一致性;而BDNF、trkB mRNA表达与蛋白表达不对应。推测树鼩大脑BDNF/trkB比ChAT具有更为复杂的转录水平调控模式,树鼩可能是研究BDNF/trkB基因表达的影响机制的良好动物。     

树鼩粪便细菌分离培养与鉴定

目的 了解人工饲养树鼩粪便菌群多样性,为树鼩的正常饲养繁殖和微生物质量控制标准化提供依据。方法 随机采集10份树鼩粪便样品,利用有氧及厌氧培养基进行细菌分离培养,提取细菌基因组DNA后PCR扩增16SrRNA基因并测序鉴定。结果 本实验从树鼩粪便样品中,经有氧培养分离鉴定出25株、12种细菌,经厌氧培养分离鉴定出25株、10种细菌,包括变形杆菌属、肠球菌属、埃希菌属、志贺菌属、葡萄球菌属、气单胞菌属、拉恩氏菌属、拉乌尔菌属、微小杆菌属、链球菌属、明串珠菌属。结论 树鼩肠道好氧菌及厌氧菌具有丰富的种属多样性,普通变形杆菌群、费格森埃希菌群和屎肠球菌群可能是树鼩肠道的主要寄生菌群。     

猪胰岛素启动子调控EGFP表达载体的优化及体外验证

目的 获得猪胰岛素启动子调控外源基因的高效表达载体,为制备转基因猪胰岛特异性表达目的基因奠定基础.方法 利用猪胰岛素启动子(PIP,包含5''调控区、第一外显子、第一内含子及第二外显子ATG前的序列共1.5 kb)构建表达载体,连接PIP和EGFP的酶切位点HindⅢ设计在起始密码子前,命名为PIP-HindIII-EGFP.鉴于酶切位点的插入位置可能会影响外源基因的表达效率,对载体进行了优化:将HindIII酶切位点删除,实现PIP和EGFP无缝连接,载体命名PIP-EGFP;将第一内含子3''端的内含子剪接受体位点(splicing acceptor site,SA)突变为HindIII内切酶识别位点,命名为PIP-SA(M)-EGFP.三种载体分别电转染小鼠胰岛素瘤β细胞株MIN-6细胞、猪耳成纤维细胞以及猪肾细胞,48 h后通过荧光强度、流式分析、RT-PCR及Western blot检测,验证载体的表达效率.结果 转染细胞后,三种载体都仅在MIN-6胰岛β细胞表达绿色荧光.RT-PCR及其产物测序结果显示三种载体的胰岛素启动子第一内含子的剪切存在差异:载体PIP-HindIII-EGFP和PIP-EGFP的内含子存在剪切和不剪切两种情况,剪切不稳定;载体PIP-SA(M)-EGFP的SA位点突变后内含子不剪切,流式细胞及Western blot检测显示,与另外两种载体相比,该载体目的蛋白的表达量最高.结论 通过突变胰岛素启动子第一内含子的3''端的剪接受体位点,成功获得了胰岛β细胞的高效表达载体,可用于制备胰岛特异表达外源基因的转基因猪.     

广西和云南树鼩群体遗传多样性的比较分析

目的 比较分析我国广西、云南两个树鼩群体的遗传差异和分化程度，推动树鼩优良品系的培育和优化实验动物模型。方法 提取广西和云南各32只树鼩的全血基因组DNA，分别采用9对荧光标记微卫星引物进行PCR扩增，通过毛细管电泳技术检测扩增片段，并利用POPGENE等软件比较两个树鼩群体的遗传相关指标。结果 广西和云南两个树鼩群体平均期望杂合度（He）为0.703，平均多态信息含量（PIC）为0.725，Fis均值>0。CCBL1B、CCDC61、EDA1和OPA3四个位点表现为极显著偏离哈迪-温伯格平衡。两群体的遗传距离及无偏遗传距离分别为1.277和1.268，遗传相似系数约为0.28。遗传结构变异的分布情况显示61.57%的微卫星遗传变异来自于群体内部，38.43%存在于群体之间。STRUCTURE分析发现广西和云南树鼩为中缅树鼩群体的两个不同的亚种。结论 广西和云南树鼩两个群体的遗传多样性都较丰富，两个群体间具有较大的遗传差异和分化程度，遗传变异主要来源于群体内部。     

滇西亚种树鼩微卫星分子标记的筛选

目的 筛选出适用于滇西亚种树鼩种群遗传质量控制的特异性微卫星分子标记。方法 首先从树鼩全基因组序列中筛选出约700个微卫星位点, 择优选出约100个位点设计引物, 去除有不良因素的, 最后保留33对和文献报道的13对引物对滇西亚种树鼩DNA进行 PCR扩增, 根据琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳结果筛选保留, 进行STR扫描再次筛选适于树鼩遗传检测的微卫星位点组合。结果 筛选出树鼩微卫星位点22个, STR基因扫描有明显Stutter峰。比较备选位点和最终筛选出的位点, 普通树鼩位点中选取5个, 2个可用, 与滇西亚种的重合率是40%;印度小树鼩位点中选取5个, 2个可用, 重合率是40%;中缅树鼩的位点中选取3个, 2个可用, 重合率约70%。结论 筛选出的22个微卫星位点适用于滇西亚种树鼩的遗传检测, 为树鼩种群的遗传质量监测提供科学依据。     

人工饲养树鼩皮肤真菌携带的调查

目的 调查人工饲养条件下树鼩皮肤真菌携带情况,为实验树鼩的微生物质量控制提供依据。方法 刮取79只树鼩皮肤表皮碎屑,包括野生来源的51只和人工繁殖的F1代28只,采用沙氏青霉素瓶斜面法和沙氏平皿培养法分别进行培养,对长出的每株真菌进行取样涂片染色,显微镜镜检观察真菌形态,用酚氯仿法提取真菌DNA,PCR扩增ITS基因,测序后经BLAST进行核酸同源性比对,进一步鉴定分析。结果 野生来源树鼩有9份样长出真菌,F1代有3份样长出真菌菌落,携带率分别15.69%和10.71%。所有真菌DNA最后进行BLAST比对鉴定后发现为7个种属的真菌,但均无致病性。结论 人工饲养的树鼩种群中皮肤真菌携带率较低,并且随繁殖代次增加而下降,未检测到皮肤病原真菌。     

EV71病毒对树鼩原代肾上皮细胞感染模型的建立

目的 建立EV71对树鼩原代肾细胞的感染模型。方法 胰蛋白酶消化法获得树鼩的原代肾细胞，用EV71感染树鼩肾细胞，测定1、2、4、6和8 d培养上清病毒滴度，分别用Western blot和间接免疫荧光法检测细胞中EV71病毒VP1蛋白的表达，以确定EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性。结果 对分离得到的树鼩原代肾细胞进行传代纯化和形态鉴别，建立以树鼩原代肾细胞为主的细胞培养。用EV71病毒感染树鼩原代肾细胞，感染后48 ~ 96 h病毒滴度可达到1.3×10⁶ TCID₅₀/mL，说明EV71病毒可有效感染树鼩原代肾细胞并有效增殖。Western blot检测发现，EV71病毒VP1蛋白可在感染后2 ~ 8 d的树鼩原代肾细胞中有效检出，间接免疫荧光法则在感染后2 ~ 6 d细胞的细胞质中检测到病毒VP1蛋白的分布。结论 在成功建立树鼩原代肾细胞培养的基础上，确定了EV71病毒对树鼩原代肾细胞的感染性和病毒增殖特性，初步建立了EV71树鼩原代肾细胞感染模型。     

荧光定量PCR与半定量PCR检测猕猴不同器官组织中黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因的mRNA表达差异的比较

目的 比较荧光定量PCR与半定量PCR检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤脱氢酶氧化酶(XDH/XO)的mRNA的相对表达量的差异,为改进实验研究方法学提供参考依据。方法 提取健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中总RNA,使用相同的引物序列及内参基因,分别用荧光定量PCR与半定量PCR进行相对定量检测,结果做比对分析。结果 两种检测方法均能检测到健康猕猴新鲜肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中XDH/XO的mRNA表达,荧光定量PCR灵敏度可检测到肝脏组织0.4ng总RNA中的XDH/XO的mRNA表达,半定量PCR灵敏度可检测到肝脏组织15.625 ng总RNA中的XDH/XO的mRNA表达,荧光定量PCR较半定量灵敏度高39倍。两种方法检测结果均显示猕猴不同组织XDH/XO的mRNA表达在肝脏组织中表达水平最高,对于表达量较低的其他组织,荧光定量PCR与半定量PCR检测结果存在有一定差异。结论 两种方法均可用于检测猕猴体内肝脏组织、上皮组织、睾丸组织、心肌组织,肾脏组织中黄嘌呤氧化脱氢酶(XDH/XO)的mRNA的相对表达量,荧光实时定量PCR灵敏度较高于半定量PCR法。     

人轮状病毒G1P[8]型感染树鼩原代小肠上皮细胞模型的建立

目的 探究树鼩原代小肠上皮细胞的增殖特性,建立人轮状G1P[8]型病毒体外感染树鼩原代小肠上皮的细胞模型。方法 采用胶原酶XI和中性蛋白酶I联合消化法获取树鼩原代小肠上皮细胞,经纯化和鉴定,用人轮状G1P[8]型病毒感染细胞,测定培养上清的病毒滴度和载量,并用Western blot和间接免疫荧光检测法检测人轮状病毒G1P[8]型VP6蛋白的表达情况,评价人轮状G1P[8]型病毒体外对树鼩原代小肠上皮细胞的感染性。结果 分离的树鼩原代小肠上皮细胞经传代培养纯化,获得纯度达90%树鼩原代小肠上皮细胞。对树鼩原代小肠上皮细胞、原代肾细胞、HCT116细胞和MA104细胞进行轮状病毒易感性比较,确定树鼩原代小肠上皮细胞可以被人轮状病毒G1P[8]感染,培养72 h时病毒滴度可达到2.0×10⁵ TCID₅₀/mL。经Western blot和间接免疫荧光发现在人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞1~5 d均能检测到人轮状病毒VP6蛋白的表达和分布。结论 确立了树鼩原代小肠上皮细胞的分离、纯化与培养方法,并建立了人轮状G1P[8]型病毒感染树鼩原代小肠上皮细胞的体外模型。     

成年树鼩骨骼系统CT三维可视化模型建立及分析

目的 建立树鼩骨骼系统的三维可视化模型，为树鼩的骨骼系统疾病诊断提供依据。方法 使用日本东芝Aquillon one 320 排螺旋CT进行扫描，100 kV，80 mA，球管转数每转0.35 s，螺距1.35，图像为0.5 mm，层间隔为0.5 mm，使用骨算法重建。在并行计算环境中采用Vitrea软件包，选择Musculoskeletal CT选项，采用容积成像（VR）、多平面成像（MPR）、曲面成像（CPR）技术进行三维重建。结果 重建后的可视化模型结构明显、清楚，可以真实地在计算机中重现出树鼩的骨骼系统三维模型。在此模型中，在头骨背面可见五条隆起的嵴，侧面观可见四个大孔：位于前端的外鼻孔、前颌骨后上方的眶下孔、由颧弓所范围着的眼窝和鼓泡外侧的外耳道。此外，可见一些较小的头骨孔，如视神经孔、颌下神经孔。利用该成像技术可定量测定各主要骨骼的长度、前后径、左右径和身长、尾长等数据。尤其是还获得了以往通过解剖难以测量准确的数据：如腭长、臼齿列长等较细微的数据，以及解剖不易获得脊椎前后径及左右径的数据。同时还利用三维可视化技术发现了树鼩存在有骨盆形态不对称、胸廓增大、骨折、跟腱周围滑膜囊钙化的骨骼异常情况。结论 所建立的CT三维可视化技术可确定树鼩骨骼系统的特殊特征，对树鼩骨骼系统无侵入性的生态分类、鉴定、进化分析均有重要意义。     

野生树鼩肠道蠕虫感染调查及分析

目的调查野生树鼩(Tupaia belangeri Chinensis)感染肠道蠕虫的主要种类并进行鉴定,为今后树鼩寄生虫检测提供形态学参考,为实验树鼩寄生虫控制提供依据。方法采集203只野外来源的树鼩新鲜粪便,虫卵采用常规粪便直接涂片以及孵化后显微镜观察;绦虫采用压片、固定染色,以及线虫经透明后体视镜观察,虫卵与成虫相对应鉴定。结果野生树鼩肠道蠕虫的总感染率为75.86%,主要感染种类有3种,经鉴定为长膜壳绦虫、奇口线虫和粪类圆线虫,感染率分别为27.67%,30.06%和51.52%。三种蠕虫的混合感染率为4.55%。两种线虫虫卵在树鼩粪便中多为含胚胎形态。结论野生树鼩肠道蠕虫的感染率较高。对野外引入的新种源必须隔离检疫,进行针对性的药物治疗,才能有效地控制肠道寄生虫病的传播。     

人工诱导树鼩乳腺肿瘤的病理分析

目的建立树鼩乳腺肿瘤模型。方法用DMBA联合人工合成孕激素MPA的方法,挑选45只雌性树鼩,随机分为3组。(1)DMBA组:连续3次进行DMBA(20 mg/次)灌胃处理,每周1次;(2)DMBA+MPA组:每3周1次,连续3次DMBA灌胃处理之后,于树鼩背部左侧皮下第1次植入MPA缓释片剂(150 mg/片,90 d缓释),间隔3个月,第2次植入MPA片;(3)正常对照组:使用花生油进行灌胃处理,每3周1次,连续3次。实验处理后,每周定期观察肿瘤发生情况,共观察45周。采用HE染色对诱发肿瘤的病理类型进行鉴定。结果 DMBA能单独诱导树鼩特异的产生乳腺肿瘤,诱发率为12%;联合MPA皮下植入可以把DMBA诱导的乳腺肿瘤发病率提高到50%;而对照组没有观察到乳腺肿瘤的发生。诱导的肿瘤主要为导管内乳头状瘤,恶性程度低,仅有一例为恶性程度高的浸润性导管癌。结论所诱导的树鼩导管内乳头状瘤和浸润性导管癌均为人类共有的肿瘤病理类型。诱发肿瘤形态与自发肿瘤相似。     

二株不同基因型树鼩呼肠孤病毒的分离和鉴定

目的 从腹泻树鼩的粪便样本中分离和鉴定病毒。方法 树鼩腹泻粪便样本分别接种Vero、LLC-MK2和KMB17细胞,经连续传代,观察记录细胞病变,并对培养上清进行透射电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析、轮状病毒鉴别筛查、S1全长基因片段扩增和生物信息学分析。结果 树鼩腹泻粪便样品在KMB17、Vero 和LLC-MK2细胞上经连续3代次传代后,均能产生细胞病变。经电镜检查、病毒RNA-PAGE电泳分析和轮状病毒鉴别筛查,推测其为呼肠孤病毒。病毒基因组全长S1基因扩增、序列测定和分析结果表明,KMB17培养上清中获得的病毒与I型原型株T1L同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和90%,因此该病毒定义为呼肠孤病毒I型。而LLC-MK2和Vero细胞上清中的病毒S1基因与III型原型株T3D核苷酸和氨基酸同源性分别为85%和92%,因此为呼肠孤病毒III型。结论 对今后树鼩和其他宿主呼肠孤病毒的分离鉴定有一定的指导意义。     

不同来源树鼩的弓形虫感染调查

目的：调查不同群体树鼩弓形虫的感染情况,为建立树鼩寄生虫学监测指标提供依据。方法分别从野外来源、人工驯化一年和人工繁殖的子一代三个树鼩群体中,随机采集动物全血样本各40份,用间接血凝试验（IHA）检测弓形虫抗体,PCR 方法检测其核酸,根据两种方法的检测结果分析树鼩弓形虫的感染情况。结果IHA 和 PCR 检测结果显示,120份树鼩血样均为阴性,两种检测方法结果一致。结论本次调查三个群体来源的树鼩均未感染弓形虫,树鼩对弓形虫的易感情况还需要通过扩大样本量和感染性实验来进一步验证。     

恒古骨伤愈合剂对骨折树鼩血液生理和脏器系数的影响

目的评价恒古骨伤愈合剂对去势树鼩骨质疏松性骨折模型的血液生理指标和脏器系数的影响。方法 30只雌性树鼩分为对照组、模型组和治疗组。治疗组和模型组树鼩切除双侧卵巢6个月证实骨质疏松后再造成胫骨骨折。于骨折次日起,治疗组用恒古骨伤愈合剂灌胃,每两天1次;模型组和对照组用等量生理盐水灌胃。灌胃3个月后,检测各组树鼩血液生理指标和脏器系数。结果在16项血液生理指标中,模型组白细胞数、淋巴细胞绝对值和百分率显著低于对照组(P0.01),单核细胞百分比和绝对值也降低(P0.05)。与模型组比较,治疗组单核细胞百分比和绝对值显著升高(P0.01),淋巴细胞绝对值和百分率以及白细胞数显著升高(P0.05),且治疗组脾脏系数明显高于模型组(P0.05)。结论恒古骨伤愈合剂提高骨质疏松性骨折树鼩的免疫力。     

应用PCR方法对三种新型实验动物钩端螺旋体感染情况的调查研究

目的：建立有效的钩端螺旋体 PCR 检测方法,并对树鼩（（tree shrew, Tupaia belangeri））、长爪沙鼠（ Meriones unguiculatus; Mongolian gerbil）和灰仓鼠（ Cricetulus migratorius）等三种新型实验动物进行感染情况调查。方法针对 NCBI 公布的钩端螺旋体序列,设计并筛选特异性引物,优化 PCR 体系,进行特异性和敏感性测试;并运用优化 PCR 方法对树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠样品进行检测。结果成功建立钩端螺旋体 PCR 检测方法,序列测定验证了该方法的特异性。普通级树鼩钩端螺旋体的阳性率为8.33％,普通级长爪沙鼠钩端螺旋体为100％,清洁级长爪沙鼠和清洁级灰仓鼠钩端螺旋体的阳性率为0％。结论本研究建立了钩端螺旋体 PCR 检测方法,调查了树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠三种新型实验动物的感染情况,为这三种实验动物的研究和使用奠定基础。     

人乙型肝炎病毒在树鼩中传代感染的研究

用人乙型肝炎病毒(HHBV·)感染树鼩(Tree shrews)后,取其HBsAg及(或)HBeAg阳性的树齣血清传代感染另一批树鼩;18只树鼩分四批感染至第四代,经检测发现17只树鼩血清或肝细胞中HBV标志物阳性(94.4%);血清转氨酶(SGPT)升高,肝组织有不同程度的炎症变化。此结果表明HHBV能够在树鼩间连续传代复制,为人乙型肝炎病毒感染树鼩动物模型的建立提供又一佐证。