PSGL-1＋/-；IL-2-/-小鼠模型的构建

目的构建PSGL-1＋/-;IL-2-/-小鼠模型。方法将白介素2敲除（IL-2KO）小鼠与P-选择素糖蛋白配体-1敲除（PSGL-1 KO）小鼠杂交,剪尾提DNA后用PCR法检测小鼠的基因型。结果IL-2KO小鼠与PSGL-1KO小鼠杂交三代后,PSGL-1＋/-;IL-2-/-小鼠模型构建成功。结论将IL-2KO小鼠与PSGL-1KO小鼠杂交三代后,成功建立了PSGL-1＋/-;IL-2-/-小鼠模型。     

Rip1-Tag2;PSGL-1^-/-小鼠模型的构建

目的构建Rip1-Tag2;PSGL^-1-/-小鼠模型。方法将Rip1-Tag2小鼠与P-选择素糖蛋白配体敲除（PSGL-1 KO）小鼠杂交,剪尾提DNA后用PCR法检测小鼠的基因型。结果 Rip1-Tag2小鼠与PSGL-1KO小鼠杂交3代后,Rip1-Tag2;PSGL-1-/-小鼠模型构建成功。结论将Rip1-Tag2小鼠与PSGL-1 KO小鼠杂交3代后成功建立了Rip1-Tag2;PSGL-1-/-小鼠模型,并进行繁育。     

Rip1-Tag2;P-sel-/-小鼠模型的构建

目的构建Rip1-Tag2;P-sel-/-小鼠模型。方法将Rip1-Tag2小鼠与P-选择素敲除(PKO)小鼠杂交,剪尾提DNA后用PCR法检测小鼠的基因型。结果 Rip1-Tag2小鼠与PKO小鼠杂交三代后,Rip1-Tag2;P-sel-/-小鼠模型构建成功。结论将Rip1-Tag2小鼠与PKO小鼠杂交三代后成功建立了Rip1-Tag2;P-sel-/-小鼠模型,并进行繁育。     

Rip1-Tag2；PSGL-1-/-小鼠模型的构建

目的 构建Rip1-Tag2；PSGL-1-/-小鼠模型.方法 将Rip1-Tag2小鼠与P-选择素糖蛋白配体敲除(PSGL-1 KO)小鼠杂交,剪尾提DNA后用PCR法检测小鼠的基冈型.结果 Rip1-Tag2小鼠与PSGL-1KO小鼠杂交3代后,Rip1-Tag2；PSGL-1-/-小鼠模型构建成功.结论 将Rip1-Tag2小鼠与PSGL-1 KO小鼠杂交3代后成功建立了Rip1-Tag2；PSGL-1-/-小鼠模型,并进行繁育.     

ApoE^-/-；SAP—Tg小鼠模型的构建

目的为研究SAP蛋白在动脉粥样硬化中的作用及机制,拟构建ApoE^-/-;SAP—Tg小鼠模型。方法分别选取6～8周龄的雄性ApoE^-/-小鼠与血清淀粉样蛋白P转基因（SAP—Tg）6周龄的雌性小鼠杂交,得到的杂交后代以剪尾方式提取基因组DNA,用PCR法检测小鼠的基因型。结果雄性ApoE^-/-小鼠与雌性SAP-Tg小鼠杂交得F1代后自交,在F2代获得ApoE^-/-;SAP—Tg基因型小鼠,模型构建成功。结论将ApoE^-/-小鼠与SAP—Tg小鼠杂交2代后成功建立了ApoE^-/-;SAP—Tg小鼠模型,并可通过筛选出的F2代ApoE^-/-小鼠和ApoE^-/-;SAP—Tg小鼠交配进行繁育筛选工作。     

fmr1基因敲除小鼠中间神经元发育研究的新方法

目的：通过杂交技术获得能表达GAD67-GFP的fmr1基因敲除小鼠模型。方法：fmr1基因敲除（fmrl—ko）雌性小鼠（X—X-）和GAD67-GFP敲入基因杂合雄性小鼠（2＋2-）杂交。鼠尾巴提取基因组DNA,用PCR方法鉴定所有子代基因型。对杂交后代小鼠进行行为学观察,并行脑组织切片观察绿色荧光蛋白在γ-氨基丁酸能神经元的表达。结果：PCR方法证实通过杂交繁殖出四种基因型小鼠：同时带有杂合fmrlko及GAD67-GFP位点的雌性小鼠（X＋X-／2＋2-）、带有纯合fmr1—ko及GAD67-GFP位点的雄性小鼠（X—Y／2＋2-）、不带有GAD67-GFP的雌性和雄性小鼠（X＋X-／2-2-,X—Y／2-2-）。观察发现X—Y／2＋2-小鼠具有fmr1-ko小鼠类似的行为学表现,同时在显微镜下观察到X—Y／2＋2-小鼠脑组织切片有发绿色荧光的GABA神经元。结论：该杂交小鼠成功表达了GAD67-GFP,为研究γ-氨基丁酸能神经元在脆性X综合征发病机制中的作用提供-种可靠的模型。     

Slit2蛋白过表达的阿尔茨海默症杂合子小鼠的构建与鉴定

目的利用阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease,AD）模型构建Slit2蛋白过表达杂合子小鼠,并进行鉴定,为进一步在动物整体水平研究Slit2蛋白过表达在阿尔兹海默症中的作用提供研究平台。方法将AD模型鼠Tg2576的杂合子小鼠（Tg2576^＋/-小鼠）进行繁殖并鉴定,然后将鉴定结果为阳性的子代Tg2576^＋/-小鼠与Slit2蛋白过表达的Slit2-Tg纯合子小鼠进行杂交,鉴定其子代小鼠的基因型。结果成功繁育Tg2576^＋/-小鼠和Slit2-Tg小鼠,并通过鉴定得到Tg2576^＋/-小鼠,与Slit2-Tg小鼠杂交并繁殖,获得基因型为Tg2576^＋/-;Slit2-Tg小鼠5只。结论本研究利用AD模型鼠成功构建了Slit2蛋白过表达杂合子小鼠,为进一步研究Slit2蛋白过表达在AD发生发展中的作用提供了良好的动物模型。     

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒115型（HPV16）E5蛋白真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5,分析E5在HeLa细胞及BALB／c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16E5基因引物,PCR扩增E5基因。经Bam-HI、EcoR1酶切后将其连接入pcDNA3．1（＋）,PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5转染HeLa细胞,利用RT—PCR测定HPV16E5mRNA表达。将6只BALB／c小鼠分为3组,分别取100mgpcDNA3．1（＋）／HPV16E5、100mgpcDNA3．1（＋）、100mLPBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果PCR扩增得到252bpHPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3．1（＋）。构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16E5mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16E5蛋白。     

Mac-1基因缺失对ApcMin/+小鼠肿瘤生长及脂代谢的影响

目的 探讨整合素Mac-1基因缺失对自发肠道腺瘤小鼠ApcMin/+脂代谢的影响.方法 ApcMin/+小鼠和Mac-1基因缺失小鼠(Mac-1-/-)扩群获得实验所需数量小鼠,并进行杂交剪尾提取DNA,用PCR法检测小鼠基因型;计数肠道腺瘤数目和体积,并检测血清中总胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)的变化.结果 获得Mac-1缺失的自发腺瘤ApcMin/+;Mac-1-/-小鼠.Mac-1基因缺失后,ApcMin/+小鼠小肠腺瘤数目和体积减少,血清中TC和TG均下调约40%.结论 Mac-1基因缺失抑制ApcMin/+小鼠小肠腺瘤生长可能与脂代谢有关.     

通胆汤对原发性胆汁性胆管炎模型小鼠Mac-2BP表达的影响

【目的】探讨通胆汤对原发性胆汁性胆管炎(PBC)模型小鼠的干预作用及机制。【方法】将Mac-2结合蛋白(Mac-2BP)基因敲除小鼠(作为A组)与野生型C57BL/6小鼠(作为B组),采用2-辛炔酸结合牛血清白蛋白(2OA-BSA)腹腔注射构建PBC模型。8周后评价造模是否成功。将造模成功的A组小鼠再随机分为A1、A2组,B组随机分为B1、B2组。A1、B1组给予磷酸盐缓冲液(PBS)灌胃为对照;A2、B2组给予通胆汤灌胃。连续治疗12周后,观察小鼠肝组织病理变化、肝功能指标及肝组织Mac-2BP的蛋白和mRNA表达水平。【结果】应用2OA-BSA构建PBC小鼠模型8周,可得到在病理及生化学上与人类PBC相类似的改变。经通胆汤干预后,B2组生化学指标较A2组改善得更为明显;B2组肝组织Mac-2BP蛋白和mRNA表达量较B1组明显降低(P 0.01)。【结论】通胆汤可改善PBC模型小鼠的胆汁淤积情况,与其下调Mac-2BP的蛋白和mRNA表达相关,但其具体机制有待进一步研究。     

mBD1-mBD3融合基因真核表达载体构建及体外抗流感病毒初步研究

目的构建小鼠β防御素1和β-防御素3（mBD1,mBD3）融合基因的真核表达载体,研究mBD1-mBD3融合蛋白的抗流感病毒作用。方法通过RT-PCR和重建PCR方法构建mBD1-mBD3融合基因;经EcoRI和Xho工双酶切后插入相同酶切的pcDNA3．1（＋）,构建成重组质粒pcDNA3．1（＋）／mBD1-mBD3,对重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定;将构建好的真核表达载体转染MDCK细胞,G418筛选稳定表达株,RT—PCR和免疫荧光染色法鉴定胞内mBDl-mBD3的表达。用流感病毒感染稳定表达细胞株,TCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果成功克隆到mBD1-mBD3基因,并构建了真核表达载体pcDNA3．1（＋）／mBD1—mBD3。RT—PCR和间接免疫荧光证实重组质粒可以在细胞内表达。实验组的TCID50显著高于对照组,初步显示出mBD1-mBD3的抗流感病毒作用。结论本研究成功构建了pcDNA3．1（＋）／mBD1-mBD3真核表达载体,且能在MDCK细胞中稳定表达,表达产物具有-定的抗流感病毒作用。为进-步深入研究mBDI-mBD3的生物学特性及其抗流感病毒作用机制奠定了基础。     

益生菌对炎症性肠病小鼠肠道菌群紊乱及细菌移位的影响

目的探讨植物乳杆菌（LP）对炎症性肠病（IBD）小鼠肠道菌群及细菌移位的影响。方法采用白介素10基因敲除（IL-10^-/-）小鼠作为IBD动物模型,将8周龄雌性小鼠随机分成空白对照组、IL-10^-/-组和IL—10^-/- ＋LP组三组。IL-10^-/- ＋LP组每日灌胃0．5mLLP菌液（1．0×10^9 CFU／mL）,其余两组灌胃Ringer缓冲液0．5mL,持续4周。以小鼠粪便中的双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌和产气荚膜梭菌数量及肠系膜淋巴结、脾脏细菌移位为检测指标。结果IL-10^-/-小鼠肠内双歧杆菌、乳酸杆菌含量明显下降,肠球菌、产气荚膜梭菌含量升高,且肠道细菌移位明显增加;而连续灌胃LP菌液4周后,益生菌发挥了对肠道的调节作用,纠正了肠道菌群失衡,并降低了肠道细菌移位。结论LP能纠正炎症性肠病小鼠肠道菌群紊乱,减少细菌移位,从而增强了肠道屏障功能。     

Tg（CD4-EGFP）；LFA-1^-/-基因工程小鼠模型的构建

目的构建并繁殖T细胞表达绿色荧光蛋白的LFA-1基因敲除小鼠[Tg（CD4-EGFP）;LFA-1^√-]。方法将CD4-EGFP转基因小鼠与LFA-1基因敲除小鼠杂交并将其子代相互杂交,提取小鼠尾部DNA,用PCR法鉴定基因型。根据孟德尔定律,可得到Tg（CD4-EGFP;LFA-1^√-）小鼠。结果Tg（CD4-EGFP）;LFA-1。小鼠的构建、饲养繁殖均获得成功。结论成功获得了T细胞表达绿色荧光蛋白的LFA-1基因敲除小鼠。     

小鼠β-防御素6与甲型流感病毒M2e基因融合表达及其免疫特性研究

目的构建小鼠β防御素6（mBD6）与甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区（M2e）真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。方法通过重叠延伸PCR法（overlap-PCR）将M2e与mBD6通过一段多肽接头Gly4Ser融合成为mBD6-M2e。将其插入载体pcDNA3．1（＋）,构建成pcDNA3．1（＋）／mBD6-M2e。鉴定正确后,转染MDCK细胞,免疫荧光、MTT检测mBD6-M2e表达和分泌。免疫小鼠,半定量PCR检测脾细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、CCR7表达。结果融舍基因mBD6-M2e真核表达载体pcDNA3．1（＋）／mBD6-M2e构建成功,在MDCK细胞膜上成功表达融和蛋白,转染细胞的培养上清刺激淋巴细胞增殖。免疫小鼠细胞因子表达改变。结论融合基因mBD6-M2e真核表达载体成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。     

小鼠PDL1胞外区的克隆、表达及生物学效应研究

目的：克隆小鼠PDL1膜外区（简称mPDL-1 IgV）基因,构建原核表达载体,检测其表达和生物学活性。方法：提取小鼠脾细胞总RNA,采用RT-PCR克隆mPDL-1 IgV基因,并将其克隆到原核表达载体pET28a（＋）中,构建原核表达质粒pET28a（＋）／mPDL-1 IgV,转化大肠杆菌DH5α,进行PCR和双酶切鉴定,并测序。筛选阳性菌落,提取质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,同时纯化mPDL-1 IgV蛋白,进行生物学活性检测。结果：从小鼠脾细胞总RNA中成功获得mPDL-1 IgVcDNA克隆,重组质粒pET28a（＋）／mPDL-1 IgV构建正确。转化pET28a（＋）／mPDL-1 IgV的E．coli BL21（DE3）成功诱导性表达重组小鼠PDL-1胞外区蛋白,并纯化mPDL-1 IgV蛋白,对其进行了复性和浓缩,复性后的蛋白显示出良好的生物学活性。结论：成功地克隆、表达和纯化了小鼠PDL1胞外区蛋白,为进一步研究其功能提供了条件。     

Graves病病人外周血T淋巴细胞和甲状腺自身抗体的检测

目的：观察Graves病病人外周血T细胞亚群、Th1／Th2细胞极化的变化,探讨细胞免疫在Graves病发病中的作用。方法：①采用流式细胞仪检测20例未经治疗的Graves病病人的T细胞亚群和CD8^-／IFN-γ^＋细胞和CD8^-／IL-4^＋T细胞的百分含量;②化学发光法检测FT3、FT4、s—TSH,放射免疫法检测TRAb、TGAb、TMAb;③观察Graves病病人经他巴唑（30mg／d）治疗1个月后T细胞亚群和CD8^-／IL-4^＋T细胞和CD8^-／IFN-γ^＋T细胞的百分含量的变化情况。结果：①Graves病病人较正常对照人群的CD4^＋T细胞与CD4^＋T细胞／CD8^＋T细胞比值增高;CD8^-／IL-4^＋T（Th2）细胞的百分含量增高;CD8^-／IFN-γ^＋T细胞／CD8^-／IL-4^＋T细胞比值（Th1／Th2）下降（均P〈0．05）;②Graves病病人的FT3、FT4较正常对照组明显增高（均P〈0．01）,但s-TSH明显降低（P〈0．01）,TRAb、TGAb、TMAb明显增高（均P〈0．05）;③他巴唑治疗1个月后,T细胞亚群、CD8^-／IL-4^＋T细胞和CD8^-／IFN-γ^＋T细胞百分含量,以及CD8^-／IFN-γ^＋T细胞／CD8^-／IL^-4^＋T细胞比值与治疗前相比均无显著差异。结论：在Graves病人外周血中Th2细胞亚群比例占明显优势,Th1／Th2细胞极化向Th2偏移,甲状腺特异的自身抗体增高,证明Graves病的发病与Th2型细胞介导的体液免疫直接相关。     

C3在迟发型超敏反应中的作用

目的 探讨补体成分3（C3）在迟发型超敏反应（DTH）中的作用。方法用卵白蛋白（OVA）诱导C3基因敲除（C3^-/-）和野生型（C3^＋/＋）小鼠足垫部位的DTH，测量足垫厚度的变化，并对反应部位组织进行HE和免疫组化染色检测。分离小鼠脾脏T淋巴细胞，用巨噬细胞作为抗原提呈细胞，在体外分别用丝裂原和特异性抗原刺激，用^3H-TdR掺入法评价T淋巴细胞的增殖活性。结果OVA诱导足垫DTH后，C3^-/-小鼠足垫厚度和局部浸润单个核细胞的数量都显著低于C3^＋/＋小鼠的，其中浸润的单个核细胞主要为CD4^＋T淋巴细胞。2种小鼠的T淋巴细胞对丝裂原刺激的反应相似，而已致敏C3^-/-小鼠脾脏T细胞对特异性抗原再次刺激后的增殖反应显著低于C3^＋/＋小鼠。结论C3缺陷明显影响DTH应答，提示C3在DTH中起了重要作用.     

原花青素对C57BL／6J小鼠动脉舒张功能保护作用的研究

目的探讨原花青素（OPC）对C57BL／6J小鼠血管内皮舒张功能的影响及物质基础。方法①将内皮功能紊乱的C57BL／6J小鼠分为对照组、0．1％w／w原花青素组、抗生素组、抗生素＋0．1％w／w原花青素组,干预4周后观察小鼠胸主动脉舒张功能;②采用高效液相色谱法（HPLC）测定OPC（100mg／kg）灌胃后小鼠60min血浆中OPC以及其代谢物原儿茶酸（PCA）含量;③将内皮功能紊乱的C57BL／6J小鼠分为抗生素组、抗生素＋0．1％w／wOPC、抗生素＋0．1％w／wOPC＋0．003％w／wPCA,干预4周后观察小鼠胸主动脉舒张功能。结果①OPC干预可提高小鼠动脉舒张功能．但该效应被抗生素阻断;②OPC灌胃小鼠60min后,HPLC法测得血浆PCA浓度为（10．6±1．8）μmol／L,但OPC未检出;③抗生素阻断OPC介导的小鼠动脉舒张功能可被其代谢物PCA部分恢复。结论原花青素可以改善血管内皮舒张功能,其物质基础可能与其代谢物PCA有关。     

抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响

 【目的】构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒，探讨抵抗素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响。【方法】用RT-PCR技术从小鼠脂肪组织扩增抵抗素基因cDNA，A／T克隆于pGEM-T载体，再亚克隆于pcDNA3．1（＋）和pcDNA3．1（-）真核表达载体，构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒pcDNA3．1^（＋）resistin和pcDNA3．1^（-）-resistin^（-）。将pcDNA3．1^（-）resistin^（-）转染小鼠3T3-L1脂肪细胞，通过G418筛选稳定表达的细胞株。3T3-L1脂肪细胞分为对照、瞬时、载体和稳定4个细胞组（每组n=6），用^3H-2-脱氧葡萄糖进行非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取试验。【结果】插入pcDNA3．1^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与小鼠抵抗素基因mRNA编码区序列完全一致．且方向正确：插入pcDNA3．10^（＋）的DNA片段的核苷酸序列与抵抗素基因mRNA编码区核苷酸序列完全一致，且方向相反。对照组、瞬时组、载体组和稳定组的3T3-L1脂肪细胞非胰岛素和胰岛素介导的葡萄糖摄取率的无显著性差别（P〉O．05）。【结论】成功构建了载有抵抗素基因和载有抵抗素基因反义核酸的重组真核表达质粒。抵抗素对3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取均无明显影响。     

羟基红花黄色素A的血管作用及其机制研究

目的探讨羟基红花黄色素A（HSYA）对离体大鼠胸主动脉环收缩功能的影响及其机制。方法采用生物信号采集系统记录灌流大鼠胸主动脉环张力变化,观察HSYA（1×10^-6～1×10^-4mol／L）对苯肾上腺素（PE）（1×10^-6～1×10^-4mol／L）、KCl（6×10^-2mol／L）和CaCl2（1×10^-5～3×10^-3mol／L）收缩血管功能的影响,并观察钌红（RR）或肝素（HP）预处理对HSYA作用的影响。结果HSYA抑制KCl、PE对完整内皮和去内皮血管环的收缩作用,且呈浓度依赖性。HSYA可使CaCl2量-效曲线下移,呈浓度依赖性。HSYA＋HP抑制血管收缩的作用比单用HSYA明显（P〈0．05）,与HP相比差异无统计学意义（P〉0．05）;HSYA＋RR抑制血管收缩的作用与单用RR或HSYA比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论HSYA的血管作用可能是通过抑制Ca^2＋内流和减小Ca^2＋浓度实现的。