健脾益气中药的小肠隐窝细胞药理靶点探讨

综述近年来开展IEC-6小肠隐窝细胞药理研究的成果。研究工作以隐窝细胞生理学研究进展作为基础,建立IEC-6细胞药理实验模型,开展健脾益气中药的肠上皮干细胞药理研究。实验采用噻唑蓝比色法(MTT)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、高效液相色谱、免疫荧光标记等方法,观察健脾益气中药对IEC-6细胞增殖、迁移及分化的影响并观察其对绒毛蛋白、二价金属转运蛋白、白细胞介素6(IL-6)和鸟氨酸脱羧酶(ODC)的表达及对ODC活性及腐胺含量的影响,结果表明党参、白术、黄芪、甘草化学提取组分通过调节细胞内ODC活性和多胺生成,对IEC-6细胞增殖、迁移、分化、吸收功能起到促进或抑制作用。提示小肠隐窝细胞是健脾益气中药的主要药理作用靶点。     

全血培养胞质分裂阻断微核(CBMN)实验方法的改进

 目的  改良全血培养胞质分裂阻断微核(cytokinesis-block micronucleus,CBMN)实验制片法及探讨细胞松弛素B(cytochalasin B,cyt-B)的最佳浓度。方法  依据常规微核试验制片法,在低渗液的温度、固定液比例和操作手法等方面改进实验方法;设置不同浓度cyt B组(4、5、6、7 μg/mL),常规外周血淋巴培养至44 h加入cyt-B,继续培养至68 h或72 h,收获细胞。按人类微核计划(HUMN Project)中的识别标准识别双核、多核细胞和微核(micronuclei,MN),确定cyt B最适浓度,并分析cyt-B对自发微核率的影响。结果  改良法所获的双核淋巴细胞的胞膜完整,边界清晰,微核易于辨认。培养72 h后,cyt B浓度≥5 μg /mL时,双核细胞比例较4 μg /mL 组显著增加(P=0.001);cyt-B浓度≥6 μg/mL时,三核以上细胞比例显著增加(P=0.01)。培养68 h后,cyt-B浓度为6 μg/mL时,双核细胞比例较高(58.4%)。各浓度组淋巴细胞自发微核率的差异无统计学意义(P=0.32)。结论  改良法选用cyt-B浓度为5 μg/mL、培养72 h或cyt-B浓度为6 μg/mL、培养68 h时收获的细胞,可获得大量双核细胞,且胞膜完整,染色清晰;cyt-B对淋巴细胞自发微核率无显著影响。     

EGCG对血小板源性生长因子-BB诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

 目的  研究表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)对血小板源性生长因子-BB (platelet-derived growth factor BB, PDGF-BB)诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖和迁移的影响并探讨其可能的机制。方法  组织块贴壁法培养SD大鼠胸主动脉VSMC, 用RTCA (real time cellular analysis)仪器检测EGCG (10、50、100 μmol/L)和Jak2特异性抑制剂AG490 (50 μmol/L)对PDGF-BB (10 ng/mL)诱导的VSMC增殖和迁移的影响; 运用 Western blot检测Jak2、Stat3、Cyclin D1蛋白质水平及Stat3磷酸化水平。结果  RTCA检测结果显示, 10~100 μmol/L的 EGCG及50 μmol/L的AG490均能抑制PDGF-BB诱导的VSMC的增殖和迁移(P＜0.001)。Western blot检测结果显示, 50 μmol/L的EGCG能明显下调PDGF-BB刺激上调的VSMC的Jak2、Stat3、Cyclin D1蛋白质水平及Stat3磷酸化(p-Stat3)水平(P＜0.001), 且与其他两个浓度组相比较下调更为明显(P＜0.001); 50 μmol/L的AG490也能明显下调上述蛋白质水平(P＜0.001), 且50 μmol/L 的EGCG下调Jak2、Stat3、p-Stat3 蛋白质水平与AG490组比较无明显差异。结论  EGCG抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖和迁移可能通过抑制Jak2/ Stat3信号转导通路而实现。     

同型半胱氨酸对大鼠主动脉血管平滑肌细胞表型转化的影响

目的： 验证同型半胱氨酸（Hcy）是否具有促进大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）去分化的作用。 方法： SD大鼠主动脉VSMCs原代细胞培养鉴定,取4～7代细胞用于实验。VSMCs分为对照组、100 μmol/L Hcy干预组、500 μmol/L Hcy干预组、1 000 μmol/L Hcy干预组共4组。MTT法测各组VSMCs的增殖情况;划痕法和Transwell法检测各组VSMCs的迁移情况;ICC法检测各组VSMCs的细胞形态;Western blot法检测各组VSMCs中SM-actin、SM-MHC、Calponin、骨桥蛋白（OPN）的表达情况。 结果： 相比于对照组,Hcy组VSMCs增殖迁移增加;细胞形态变圆;SM-MCH和Calponin表达减少（ P＜0.01〉;OPN表达增加（ P＜0.01）,Hcy的这一作用与浓度呈正相关。 结论：Hcy可以促进VSMCs去分化,这可能是其促进VSMCs增殖和迁移的机制之一。     

小鼠脂肪间质干细胞源胞外囊泡激活蛋白激酶B促进卵巢癌细胞增殖迁移和上皮间质转化

目的:探讨小鼠脂肪间质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)源胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)对卵巢癌ID8细胞株生物功能的影响及其可能机制。方法:采用酶消化法分离获得ADSCs,利用其形态特征、成骨成脂多向分化能力和流式细胞术表面标志检测对ADSCs进行鉴定;采用超速离心法从ADSCs上清液中分离和纯化EVs(ADSC-EVs),并通过透射电子显微镜、纳米粒径分析和蛋白质印迹实验进行鉴定;以PBS作为对照组,实验组采用不同浓度ADSC-EVs(20 μg/mL和40 μg/mL)分别预处理ID8细胞,通过平板克隆实验检测ADSC-EVs对ID8细胞增殖能力的影响;划痕实验和Transwell实验检测ADSC-EVs对ID8细胞迁移能力的影响;蛋白质印迹实验检测ID8细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和蛋白激酶B(即AKT)相关蛋白的表达。结果:分离的ADSCs具有典型的干细胞形态,能够向成骨成脂分化,并符合干细胞表面一般特征;ADSC-EVs表达CD9和CD81蛋白;与PBS组相比,ADSC-EVs组ID8细胞增殖和迁移能力明显增强(P均＜0.05),且40 μg/mL ADSC-EVs组细胞增殖和迁移能力较20 μg/mL ADSC-EVs组明显增强(P均＜0.05);随着ADSC-EVs浓度增加,ID8细胞E-钙黏蛋白表达明显降低,N-钙黏蛋白、波形蛋白和p-AKT表达明显增加(P均＜0.05)。结论:ADSC-EVs可能通过激活AKT信号的磷酸化促进ID8细胞EMT,进而增强其增殖和迁移能力。     

医用臭氧对骨关节炎病理过程中软骨细胞的影响

目的   观察不同浓度医用臭氧(O3)对白介素-1β(IL-1β)损伤关节软骨细胞的影响,探讨临床使用O3的浓度范围。方法   在无菌环境下消化得到7月龄新西兰白兔膝关节软骨细胞,培养并传代,用传代软骨细胞作为实验用细胞。随机分为8组：正常软骨细胞组(N组),模型细胞组即软骨细胞加IL-1β(M组),对照组即软骨细胞加不同浓度O3(20、40、60μg/mL)组,实验组即IL-1β(10ng/mL)干预的软骨细胞加不同浓度O3(20、40、60μg/mL)组,共同孵育24h后观察细胞形态。酶联免疫吸附测定法 (ELISA) 测定软骨细胞培养液上清液中丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)的含量。结果   20、40μg/mL浓度医用臭氧干预软骨细胞后,对照组和实验组细胞的形态与正常软骨细胞相似,有少量核固缩,MDA、TNF-α、MMP-3的含量比模型细胞组降低(P＜0.05);60μg/mL医用臭氧干预软骨细胞后,细胞损伤严重,呈凋亡形态,且MDA、TNF-α、MMP 3的含量比模型细胞组增高(P＜0.05)。结论   20、40μg/mL浓度医用臭氧通过降低细胞培养液中炎症因子的浓度对骨关节炎软骨细胞有保护作用,60μg/mL医用臭氧对正常软骨细胞和骨关节炎病理过程中的软骨细胞均有损伤作用。     

小肠隐窝细胞株药理实验方法的建立

目的：建立小肠隐窝细胞株（IEC-6）药理实验方法。方法：观察细胞接种密度、α-二氟甲基鸟氨酸（DFMO）和胃泌素对IEC-6细胞增殖及细胞鸟氨酸脱羧酶（ODC）的影响。结果：较高接种密度（〉0.5×10^4细胞/孔）组,接种后第2天,细胞生长抑制,尤其是密度增加到4×104细胞/孔时,第2~3天,OD值逐渐增加,第4天明显增加,第5天达高峰,此后OD值开始下降。而低密度（0.2×10^4细胞/孔）接种后第4天,细胞生长出现抑制,此后其生长与其他密度相似。加入DFMO后1~3天,完全抑制了细胞增殖,此后与空白组一样,细胞逐渐生长。DFMO还明显抑制IEC-6细胞分化和移行,以及ODC活性和腐胺含量,与空白组比较具有显著性差异（P〈0.01）。IEC-6细胞在胃泌素250μg·L^-1作用后第一天,开始增殖,第3天达高峰。胃泌素500μg·L^-1作用后第1~2天,细胞开始增殖,第3天以后,细胞增殖下降。胃泌素明显促进细胞分化和移行。与空白组比较,胃泌素250μg·L^-1分别使ODC m RNA水平,ODC活性,腐胺含量增加1.09倍（P〈0.05）,1.71倍（P〈0.01）和5.30倍（P〈0.01）。同样,胃泌素500μg·L^-1可使以上3项指标分别升高1.16倍（P〈0.05）,1.63倍（P〈0.05）和4.41倍（P〈0.01）。但胃泌素两个剂量组之间无显著性差异。结论：IEC-6细胞是进行胃肠粘膜修复药理实验的合适细胞模型。     

EGF 对前列腺细胞中鸟氨酸脱羧酶基因表达的调控

目的 :探讨EGF诱导前列腺增殖的分子机理。方法 :以MTT法测定不同浓度表皮生长因子(EGF)对前列腺癌细胞PC 3的促增殖作用 ;以最适浓度EGF(5 0ng/ml)刺激该细胞 ,分别于 0、1、3、6、12、2 4h提取总RNA ,用斑点杂交法分析测定各组细胞中ODCmRNA丰度 ;用免疫组化及流式细胞术两种方法检测EGF刺激细胞后ODC蛋白表达量的变化。结果 :①EGF能促进PC 3细胞的增殖 ,而且随着EGF浓度的升高 ,细胞增殖活性增加 ;②斑点杂交显示 ,EGF刺激细胞后 3h ,ODCmRNA开始明显升高 ,12h达高峰 (约为 0h的 3.6 6倍 ) ,至 2 4h时有所降低 ;③免疫组化及流式细胞术检测显示 ,EGF刺激细胞 3d后ODC蛋白阳性细胞表达率明显升高。结论 :EGF诱导ODC基因表达可能是其促进前列腺细胞增殖的分子机制之一     

Tiger17促进口腔黏膜成纤维细胞的增殖和迁移

  目的  观察在不同浓度 Tiger17作用于人口腔黏膜成纤维细胞（hOMF）不同时间后对细胞增殖和迁移的影响。  方法  培养hOMF细胞，CCK8和划痕实验检测不同浓度Tiger17作用于hOMF细胞不同时间后细胞增殖和迁移的变化；Western Blot 检测hOMF细胞表达TGF-β1、Erk1/2和p-Erk1/2蛋白的水平。  结果  100 μg/mL和200 μg/mL Tiger17对hOMF的增殖活性在48 h明显高于对照组（P < 0.05）；100 μg/mL Tiger17对hOMF的迁移率在24 h和48 h均明显高于对照组（P < 0.01）；不同浓度的Tiger17作用于hOMF 24 h和48 h后，细胞表达TGF-β1、p-Erk1/2蛋白升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。  结论  Tiger17使hOMF细胞表达TGF-β1、p-Erk1/2升高，促进hOMF细胞的增殖和迁移。     

血小板衍生生长因子对人脐带间充质干细胞胞外基质的影响

目的 探讨血小板衍生生长因子(PDGF)对人脐带间充质干细胞(UCMSCs)增殖和细胞外基质(ECM)表达的影响及其可能的作用机制。方法 体外传代培养UCMSCs,分为对照组和实验组,其中对照组不加PDGF,实验组分别加入不同质量浓度(2、5、10、20、50μg/L)的PDGF。加入PDGF 12h后,用qRT-PCR法检测ECM基因和凋亡相关基因(Bcl 2、Bax)的表达;加入PDGF 24h后,用四甲基偶氮唑(MTT)法检测细胞增殖。结果 与对照组比较,随着PDGF质量浓度的增加,反映细胞代谢活性的OD值逐渐增加,且PDGF质量浓度在20μg/L时达到最高值,但PDGF质量浓度为50μg/L时OD值反而降低;PDGF质量浓度为2μg/L时,ECM表达和Bcl 2/Bax比值较对照组有所降低,随着PDGF质量浓度的增加,ECM的表达和Bcl 2/Bax比值呈现先增高后降低的趋势,且在10μg/L时达到最高值。 结论 PDGF可以促进脐带间充质干细胞的增殖,同时能促进其ECM的表达,还能提高细胞耐受凋亡的能力,最佳作用质量浓度为10μg/L。     

造血干细胞移植后免疫重建及其意义的研究进展

本文对造血干细胞移植后的免疫重建及其意义的研究进展作一综述,着重介绍移植后宿主体内T细胞、自然杀伤(NK)细胞及树突细胞(DC)数量和功能的变化。     

细胞培养技术的研究进展

随着现代科学的发展,体外细胞培养技术已成为多个领域必不可少的研究工具,并且其新技术和方法也在不断涌现。本文就细胞培养技术的发展、支架材料以及细胞培养的影响因素作一综述。     

大鼠胃壁细胞的分离及培养

目的　完成胃壁细胞分离及纯化 ,建立原代培养胃壁细胞的方法 .方法　制备大鼠翻转的胃囊用含链霉蛋白酶E的消化液注入胃囊内孵育 ,并用磁力搅拌器轻轻搅拌而制备单个的胃底腺细胞 ,Percoll梯度离心富集胃壁细胞 ,用含10 0 m L· L- 1 血清的 PBS或培养液 ,时差贴壁去除成纤维细胞 ,然后 ,将壁细胞接种于培养板中 ,培养液用无血清的 1∶ 1Harm's F- 12 / DMEM培养 ,内含胰岛素 5 mg· L- 1 ,氢化可地松 4μg· L- 1 ,转铁蛋白 5 mg· L- 1 ,硒酸钠 5μg· L- 1 ,牛血清白蛋白 2 g· L- 1 ,表皮生长因子 2 5 μg· L- 1 ,葡萄糖 1.98g· L- 1持续培养可达 1wk以上 .结果　获得的壁细胞经吖啶橙 (acridine orange,AO)鉴定纯度达 80 %以上 ,原代培养经HE染色可见壁细胞呈分散小组式生长 ,且生长状态良好 .结论　此方法适宜于大鼠胃壁细胞的分离及体外培养 ,为体外进一步研究壁细胞的功能打下基础 .     

内毒素对睾丸功能影响的研究进展

众所周知生殖道感染、炎症和其他疾病可抑制雄性生殖功能,但对系统性炎症和疾病引起男性不育的具体机制却所知甚少。内毒素是一种高效炎症激活物,可诱导炎症感染、内毒素血症、败血症休克及多组织器官损伤等,虽然内毒素广泛用于其他系统的炎症研究,但对其在生殖系统炎症的研究较少,因而深入了解内毒素对睾丸功能的影响,有助于进一步理解内毒素所致疾病对雄性生殖功能的影响。本文就内毒素的结构和生物学功能及其对睾丸生精细胞、Sertoli细胞和Leydig细胞功能的影响进行了相关研究。     

EPCs在MSCs向肝样细胞转化中作用的初步探讨

目的：探讨内皮前体细胞(endothelial precursor cells, EPCs)在间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)向肝样细胞转化中的作用。方法：分离培养SD大鼠MSCs和EPCs,取第3代MSCs向肝样细胞转化培养,培养过EPCs的无血清及因子的培养基(endothelial progenitor cell-conditioned medium, EPCs-CM)、无血清的α-最低必需培养基(alpha minimal essential medium, α-MEM)分别与肝细胞转化培养基按1∶1比例配置,作为实验组和模型对照组,正常α-MEM培养基为空白对照组,分别观察细胞形态及数量变化;在培养3、5、7、9 d时应用免疫荧光检测甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)、清蛋白(albumin, ALB)的表达。结果：空白对照组MSCs形态无明显变化;实验组与模型对照组细胞均出现肝样细胞形态。空白对照组未见AFP、ALB表达,模型对照组和实验组在3、5、7、9 d AFP、ALB表达水平均增高,其中实验组比模型对照组AFP、ALB水平增高明显。结论：EPCs在MSCs向肝样细胞转化中可能起一定的促进作用。     

Culture and Identification of Human Amniotic Mesenchymal Stem Cells

Objective To establish the method of isolation, purification, and identification of human amniotic mesenchymal stem cells （hAMSCs）. Methods hAMSCs were isolated from human amniotic membrane by trypsin-collagenase digestion, and cultured in Dulbecco＇s modified Eagle＇s medinm/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum. Phenotypic characteristics of these cells were analyzed by means of immunocytochemistry and flow cytometry. Results The cells successfully isolated from human amniotic membrane expressed representative mesenchymal cell surface markers CD44, CD90, and vimentin, but not CD45. Conclusions This study establishes a potential method for isolation of hAMSCs from human amnion, in vitro culture, and identification. The isolated cells show phenotypic characteristics of mesenchymal stem cells.     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

利用无血清培养和细胞克隆技术从孕鼠(14d)胚胎中分离出神经干细胞，并进行传代培养，采用免疫细胞化学技术检测神经巢蛋白和成熟脑细胞特异性抗原神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，同时采用H-E染色法鉴定神经细胞类型。证实从大鼠胚胎大脑皮质分离出的细胞具有连续的克隆能力，并表达神经巢蛋白，分化的细胞表达神经元和神经胶质细胞的特异性抗原，为中枢神经系统的干细胞。     

免疫性肝损伤大鼠枯否细胞对肝星状细胞增殖的影响及芍药苷的作用

目的探讨芍药苷(Pae)通过免疫性肝损伤大鼠枯否细胞(KC)影响肝星状细胞(HSC)的增殖能力。方法用卡介苗加脂多糖诱导大鼠肝损伤模型,肝脏原位灌流分离大鼠KC和HSC,观察共培养的形态学改变,观察Pae作用后的KC培养上清对HSC增殖的影响。结果免疫性肝损伤大鼠KC能明显促进HSC的增殖,在Pae作用后,KC培养上清能抑制HSC的增殖。结论KC是Pae发挥作用的靶细胞之一,Pae可通过作用于KC抑制HSC的增殖。     

莪术注射液抑制K562细胞增殖及诱导其凋亡的研究

目的：探寻新的抗白血病药物。方法：采用ＭＴＴ法,以柔红霉素（ＤＮＲ）、阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）和羟基脲作对照,了解莪术注射液对Ｋ５６２细胞增殖抑制作用;通过流式细胞仪检测和ＤＮＡ凝胶电泳,观察莪术注射液诱导Ｋ５６２细胞凋亡的情况。结果：莪术注射液对Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显强于对照ＤＮＲ、Ａｒａ－Ｃ和羟基脲;而它更主要的作用是诱导Ｋ５６２细胞不仅具有强大的增殖抑制作用,功效明显     

莪术醇对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的研究莪术醇对人胃癌SGC-7901细胞生物学特性的影响。方法用MTT法测定莪术醇对SGC-7901细胞增殖的影响,流式细胞仪检测莪术醇对SGC7—901细胞周期和细胞凋亡的影响。结果10、30、100μg／mL莪术醇均能够抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖;莪术醇能使S和G2／M期肿瘤细胞比例减少,G0／G1期肿瘤细胞比例增加,其中100μg／mL浓度的莪术醇作用最强（F=88．14,P〈0．01）;莪术醇诱导肿瘤细胞凋亡,其中100μg/mL浓度的莪术醇凋亡作用最强（F=34．14,P〈0．01）。结论莪术醇诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖,