人心房肌KChlP2和SK2基因表达检测及方法研究

目的检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础。方法提取人心房肌组织总RNA,采用RT-PCR方法获取KChIP2、SK2、GAPDH、β-actin目的片段,与pMD-18Tvector连接成重组质粒,转化到大肠杆菌DH5α中,通过PCR和测序鉴定。提取含目的基因的质粒作为标准品。采用Taqman探针法与SYBR Green I法分别检测人心房肌SK2与KChIP2基因表达和构建标准曲线。结果人心房肌存在KChIP2和SK2基因表达,质粒标准品经过PCR鉴定并测序,与Pubmed数据库完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2〉0.99。结论成功检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,构建的质粒标准品能用于后续实验。     

人心房肌KCh1P2和SK2基因表达检测及方法研究

目的 检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础.方法 提取人心房肌组织总RNA,采用RT-PCR方法获取KChIP2、SK2、GAPDH、β-actin目的 片段,与pMD-18T vector连接成重组质粒,转化到大肠杆菌DH5α中,通过PCR和测序鉴定.提取含目的 基因的质粒作为标准品.采用Taqman探针法与SYBR Green Ⅰ法分别检测人心房肌SK2与KChIP2基因表达和构建标准曲线.结果 人心房肌存在KChIP2和SK2基因表达.质粒标准品经过PCR鉴定并测序.与Pubmed数据库完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2>0.99.结论 成功检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,构建的质粒标准品能用于后续实验.     

大鼠β神经生长因子前体基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-NGF的构建

目的克隆大鼠脑组织中神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列，构建其真核表达载体pEGFP-NGF。方法采用RT-PCR方法扩增NGFβ亚基前体的全长序列，克隆入载体pMD18-T，转化大肠杆菌JM109，挑选白色菌落行酶切鉴定、PCR鉴定及序列分析；利用高保真Taq酶自重组质粒pMD 18-T／NGF中扩增目的基因NGF，将目的基因与真核表达载体pEGFP-N1行双酶切，T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH-5α，挑选白色菌落行酶切鉴定。结果pMD 18-T／NGF测序结果与GenBank的序列完全一致，pEGFP-NGF、行限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ酶切，可见酶切片断与插入基因长度相符。结论成功从大鼠脑组织中克隆神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列，并构建其真核表达载体pEGFP-NGF，为从分子水平开展NGF转基因相关研究奠定了基础。     

胡椒碱对H2O2所致兔心房肌细胞瞬时外向钾电流异常的保护作用

目的研究胡椒碱对H2O2引起的兔单个心房肌细胞瞬时外向钾电流(Ito)异常的保护作用。方法采用全细胞膜片钳技术分析50μmol/L的H2O2对兔单个心房肌细胞Ito的影响,并研究预先应用7μmol/L的胡椒碱对其的保护作用。结果 7μmol/L胡椒碱对正常兔心房肌细胞Ito及其通道动力学无显著影响。在50μmol/L H2O2作用下,兔心房肌细胞Ito峰值由(39.3±5.4)pA/pF降低至(32.8±2.0)pA/pF(P<0.05),电流-电压曲线下移,通道稳态激活曲线右移,通道稳态失活曲线及恢复时间不变,关闭态失活加速。预先给予7μmol/L胡椒碱,明显减轻H2O2对Ito的抑制作用(P<0.01),并可减轻H2O2对瞬时外向钾通道动力学的异常影响。结论胡椒碱可减轻氧化应激对心房肌细胞Ito的影响。     

未知基因CGI-100的克隆及其真核表达载体的构建

目的:为探讨研究未知基因CGI-100的功能,克隆人CGI-100基因并构建其真核表达载体.方法:通过RT-PCR从人白血病K562细胞中克隆CGI-100基因全长编码区,将该cDNA片段亚克隆至载体pMD18-T SimpleT中,经测序鉴定后,用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ双酶切将目的cDNA片段定向克隆至相同处理的pIRES2-EGFP真核表达质粒中,然后经酶切、PCR鉴定和DNA序列测定三重鉴定方法对重组质粒进行鉴定.结果:经酶切、PCR及测序鉴定证实,CGI-100基因全长编码区cDNA被准确正向插入至pIRES2-EGFP质粒的酶切位点BamH Ⅰ和Pst Ⅰ之间,未发现碱基突变或移位.结论:成功地构建并鉴定了含CGI-100基因全长编码区的真核表达质粒,为以后研究该基因的功能奠定了基础.     

hERβ全长基因真核表达载体pEGFP-C1-hERβ的构建及其在PC-3M细胞中的表达

目的：构建人雌激素受体β（hERβ）全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。方法：采用RT-PCR法从卵巢囊肿患者切除的部分正常卵巢组织中钓取hERβ全长基因（1 593 bp）,与pMD18-T载体连接做全自动序列测定。将测序正确的克隆质粒pMD18-T-hERβ和表达载体pEGFP-C1分别用Hind Ⅲ和BamHⅠ进行双酶切,应用基因重组技术构建hERβ全长基因真核表达载体pEGFP-C1-hERβ。质粒经Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切和PCR电泳鉴定后,采用脂质体转染法转染PC-3M细胞。结果：重组质粒经限制性酶切鉴定得到与hERβ全长基因长度一致（1 612 bp）的酶切产物;测序分析证实,PCR产物与GenBank上登录的hERβ基因（NM_001437）序列完全一致,表明成功地完成了hERβ的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的PC-3M细胞有绿色荧光蛋白的表达;PCR测定分析,转染细胞hERβ的表达增加。结论：构建完成真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,hERβ基因在PC-3M细胞内成功表达。     

脑源性神经营养因子受体trkB基因扩增和真核表达载体的构建

目的构建大鼠脑源性神经营养因子受体trkB基因真核表达载体。方法根据trkB基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRⅠ及BamHⅠ酶切位点,用反转录PCR(RT-PCR)方法从大鼠脑组织总RNA中扩增编码trkB的基因片断,插入克隆载体pMD 18-T,构建pMD 18-trkB载体。经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切出trkB基因片断,再克隆至载体pEGFP-C2中构建pEGFP-C2-trkB真核表达载体。结果trkB基因RT-PCR扩增产物大小约1 461 bp,真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子,基因测序结果与已知序列基本吻合。结论成功扩增出完整trkB基因,构建了真核表达载体pEGFP-C2-trkB。     

家兔C型利钠肽基因真核表达载体的构建及鉴定

目的为开展C型利钠肽(CNP)基因治疗构建家兔CNP基因真核表达载体。方法通过RT-PCR从家兔腹主动脉组织中克隆CNP基因全长编码区,将该DNA片段亚克隆至克隆载体pMD 18-T中,用PstⅠ单酶切筛选出负向插入片段,用HindⅢ和KpnⅠ双酶切将目的DNA片段定向克隆至真核表达质粒pEGFP-N1中,然后用双酶切、DNA序列测定鉴定方法对重组质粒进行鉴定。结果酶切及测序鉴定证实,家兔CNP基因全长编码区被准确插入到pEGFP-N1酶切位点HindⅢ和KpnⅠ中。结论含家兔CNP基因真核表达载体的成功构建和鉴定为CNP基因治疗的研究奠定了基础。     

脑源性神经营养因子受体trkB基因扩增和真核表达载体的构建

目的 构建大鼠脑源性神经营养因子受体trkB基因真核表达载体。方法 根据trkB基因已知序列，设计合成一对引物，上、下游引物分别引入EcoRⅠ及BamHⅠ酶切位点，用反转录PCR(RT-PCR)方法从大鼠脑组织总RNA中扩增编码trkB的基因片断，插入克隆载体pMD18-T，构建pMD18-trkB载体。经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切出trkB基因片断．再克隆至载体pEGFP-C2中构建pEGFP-C2-trkB真核表达载体。结果 trkB基因RT-PCR扩增产物大小约1461bp，真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子，基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 成功扩增出完整trkB基因，构建了真核表达载体pEGFP-C2-trkB。     

人PPARα受体cDNA全长序列的克隆及测序

目的对人过氧化物酶体增殖物激活受体α(hPPARα)全长cDNA序列进行克隆并测序,为构建含hPPARα基因真核表达载体奠定基础。方法通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从HepG2细胞总RNA克隆hPPARα全长cDNA序列,胶回收目的条带后与pMD19-T载体连接并转化DH5α感受态菌,用BamH I、Sal I双酶切及基因测序筛选鉴定阳性克隆pMD19-hPPARα-T载体中hPPARα基因的完整性和忠实性。结果经酶切和DNA测序证实pMD19-hPPARα-T载体中插入的hPPARα基因序列与GeneBank中提交的序列(NM001001928)一致。结论成功克隆了hPPARα基因,构建了pMD19-hPPARα-T中间载体,为含hPPARα基因真核表达载体的构建奠定了基础。     

PIAS3的Myc融合蛋白真核表达重组质粒的构建

目的：构建PIAS3 （活化型STAT3抑制蛋白）的Myc融合蛋白真核表达重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。方法： 采用PCR方法，扩增鼠PIAS3基因全长cDNA编码区序列。将该1 851 bp的特异性片段连接到T载体上，将其亚克隆至pCMV-Myc真核表达载体的SalⅠ和NotⅠ位点之间。将pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染前列腺癌PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达。结果：重组pCMV-Myc-PIAS3质粒通过酶切和测序鉴定了其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定时有4 357和1 318 bp 2条带，XbaⅠ酶切鉴定时有3 291 bp和2 384 bp 2条带，与预期结果一致。测序结果显示，13个氨基酸Myc在N端，然后是阅读框架正确的PIAS3的基因序列。pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染PC3细胞，利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达，在相对分子质量68 000处检测到特异的蛋白表达条带。结论：成功构建pCMV-Myc-PIAS3重组质粒，并表达融合蛋白Myc-PIAS3。     

大鼠Ngn2基因真核表达质粒的构建

目的：构建大鼠Neurogenin2（Ngn2）基因的真核表达质粒。方法：从大鼠海马组织提取海马总mRNA ,RT-PCR获得Ngn2基因cDNA,构建重组质粒pSecTag2／HygroB-Ngn2, XhoⅠ和HindⅢ双酶切、测序鉴定重组质粒。结果：RT-PCR获得片断与预期结果相符,酶切鉴定、测序鉴定证实pSecTag2／HygroB-Ngn2重组质粒构建成功。结论：成功构建了大鼠Ngn2基因的真核表达质粒,并对该基因的真核表达产物进行鉴定,为下一步Ngn2基因对神经损伤修复作用的研究奠定基础。     

肌球蛋白结合蛋白C的表达和鉴定

目的：探讨优化原核表达方法以及用亲和层析的方法制备重组人快型肌球蛋白结合蛋白C （MYBPC2）.方法：根据MYBPC2的序列设计一对引物,在上下游引物的5’端分别加上BamHI和HindⅢ酶切位点.以健康人骨骼肌cDNA为模版,扩增第284位至第579位氨基酸残基对应的碱基序列,经双酶切后插入pMalc-5e载体中,测序鉴定重组质粒的序列,将构建好的重组质粒转化大肠杆菌中,IPTG诱导重组蛋白MYBPC2-MBP的表达,亲和层析纯化重组蛋白,蛋白电泳法鉴定蛋白的分子量及纯度,测定蛋白浓度并估算蛋白纯化后得率.用商品化的抗MYBPC2抗体证实所表达蛋白序列的正确性.以纯化的蛋白免疫动物获得动物免疫血清,用Western Blot的方法鉴定此蛋白的免疫原性.结果：人MYBPC2蛋白表达载体构建成功,每升大肠杆菌菌液可生产纯化后的重组MYBPC2蛋白约30mg,Western Blot显示重组蛋白与其抗体及抗血清特异结合.结论：本方法可以高效制备生产人MYBPC2蛋白片段,具备良好的抗原特异性和免疫原性.     

人CYB5R2基因真核表达载体的构建

目的构建人CYB5R2基因真核表达载体,并观察其在人鼻咽癌细胞HONE1中的表达。方法根据表达载体pCMV-Tag3A上的多克隆位点和CYB5R2基因CDS序列设计引物,应用RT-PCR从人睾丸cDNA中克隆出CYB5R2的CDS,并进行TA克隆。对经PER、双酶切和双向测序验证正确的质粒,进行CDS目的片段的回收,将其连接于pCMV-Tag3A载体的多克隆位点内构建真核载体,然后进行PCR、双酶切和双向测序验证。脂质体法转染鼻咽癌细胞HONE1细胞,荧光显微镜观察和RT—PCR验证该基因的表达。结果PCR、双酶切和双向测序结果显示pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体构建成功,荧光显微镜和RT—PER的结果显示该重组质粒在HONE1细胞中正确表达。结论成功构建了pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体,并在鼻咽癌细胞HONE1中表达,为进一步验证其抑癌作用及探索其抑癌机制做准备。     

pcDNA3.1(+)gpc-5真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建pcDNA3.1（＋）磷脂酞肌醇蛋白5（gpc-5）基因真核表达载体。方法：根据gpc-5基因序列设计一对引物,利用RT-PCR法扩增出gpc-5基因的编码区（CDS）,连接在PGM-T载体上,并进行pcDNA3.1（＋）gpc-5真核表达载体的构建、酶切鉴定以及测序。结果：gpc-5基因的体外扩增目的片段为2 083 bp。所构建的重组体pcDNA3.1（＋）gpc-5经双酶切鉴定,与预期片段大小一致,测序结果与NCB I收录gpc-5基因的CDS序列一致。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）gpc-5,为研究gpc-5基因在原发性肺癌的发生发展中的作用奠定了基础。     

DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达DREAM基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(rAAV)载体,并观察感染PC12细胞后DREAM蛋白表达受抑制情况。方法设计并合成shRNA对应的2条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,构建pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6质粒,以其为模板设计引物并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物酶切后与pSANV2.0连接构建重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,酶切测序证实后,重组腺相关病毒介导将pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP感染PC12细胞,Western blot检测DREAM蛋白表达水平。结果经PCR、酶切及测序证实,重组腺相关病毒载体质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP构建成功,包装成病毒感染PC12细胞48 h后,Western blot结果显示与对照组细胞相比,DREAM蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结论成功构建和筛选出介导特异性shRNA-DREAM的重组腺相关病毒载体。     

代表PDCD5蛋白不同功能区域的质粒构建及其在胃癌细胞中的表达定位

目的分析PDCD5蛋白的不同功能区域,将这些区域所对应的序列与质粒pEGFP-C1相连接,在胃癌细胞中表达后,检测其细胞定位。方法设计带有HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点的PDCD5引物共4对,包括完整的PDCD5蛋白序列及3个不同功能区域的序列。以上质粒构建完成后,转染胃癌细胞SGC-7901。荧光显微镜检测融合蛋白的表达定位。结果经酶切鉴定,可见相应长度的4种序列,后经测序确定序列无误,荧光显微镜检测融合蛋白表达。结论代表PDCD5蛋白不同功能区域的质粒成功构建,并在SGC-7901细胞中表达。经过观察绿色荧光蛋白,确定4种蛋白均定位于细胞浆内。