双重实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒方法的建立及应用

目的 建立检测肠道病毒(EV)和肠道病毒71型(EV71)的双重实时荧光RT-PCR法.方法 设计特异性引物和探针,建立双重实时荧光RT-PCR反应体系,绘制标准曲线,对该方法的灵敏度、精密度等进行评价.收集109例临床手足口病患者粪便和咽拭子标本用该法进行检测,并与EV71商品化试剂盒检测结果进行比较.结果 双重荧光PCR法建立的EV和EV71标准曲线相关系数(r)均为0.998;该法检测EV和EV71的灵敏度分别达到0.5 TCID50/mL和0.05 TCID50/mL;检测EV和EV71的批内精密度均小于3％,总精密度均小于或等于4％;对肠道病毒及其他人类非肠道病毒进行检测,显示了良好的特异性.109例临床样本用该法检测出84例EV病毒阳性样本,其中EV71阳性56例,EV71总阳性率为51.4％;与单重荧光PCR商品化试剂盒的检测结果完全一致(P=1.000).结论 建立的双重实时荧光RT-PCR法灵敏度高、稳定性好,对手足口病的早期高通量快速诊断具有重要意义.     

手足口病样本类别间检测结果的差异比较

目的 探索手足口病病毒核酸检测多类型样本间的阳性率差异,为手足口病病毒核酸检测样本类型选择提供依据.方法 选取2017年1月至2019年12月本院收治的385例手足口患儿为研究对象.采用荧光定量RT-PCR实时荧光探针技术同步进行病毒核酸检测肠道病毒EV通用型、肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)、柯萨奇病毒A组16型(coxsackie virus A16,CV-A16)及其他肠道病毒型,并统计分析结果.结果 第一组279例患儿肛拭EV通用型、EV71、CV-A16和肠道病毒其他型阳性率为81.00％、43.72％、30.47％、6.81％,高于咽拭子的67.38％、34.40％、26.52％、6.45％.肛拭标本肠道病毒检测的EV通用型和EV71的阳性检出率均明显高于同步检测的咽拭标本,差异有统计学意义(P<0.05).第二组106例患儿肛拭EV通用型、EV71、CV-A16和肠道病毒其他型阳性率为79.24％、42.45％、30.18％、6.60％,低于疱疹液的92.45％、56.60％、29.24％、6.60％,肛拭标本肠道病毒EV通用型,EV71阳性检出率均明显低于同步检测的疱疹液标本,差异有统计学意义(P<0.05).结论 3种类型标本间检出率存在明显差异,建议今后手足口病病毒核酸检测在患者实际条件允许的情况下,尽量同步送检两个类型的标本,首选疱疹液标本送检,肛拭标本次之,咽拭子为末选.     

手足口病EV71型与其他肠道病毒型患者心肌酶谱结果分析

目的 比较EV71型与其他肠道病毒型手足口病患者心肌酶谱结果是否有差异,为临床医师诊治EV71型感染的手足口病提供参考依据.方法 选取我院感染性疾病科收治的手足口病患儿89例,应用RT-PCR法检测患儿咽拭子肠道病毒类型,分为肠道病毒71型(EV71)组和其他肠道病毒感染组,分析2组患者心肌酶谱结果.结果 2组患儿心肌酶谱各项检测结果比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 EV71型与其他型肠道病毒手足口病感染患者心肌酶谱检测结果无差异,不能用心肌酶谱来评估EV71型肠道病毒感染以及患者病情的严重性.     

病毒性脑炎患者脑脊液肠道病毒和EV71检测与分析

目的 探讨肠道病毒和EV71所致脑炎的发病情况及荧光定量PCR诊断病毒性脑炎的意义.方法 收集银川市118例临床诊断病毒性脑炎、脑膜炎患者脑脊液和血清,用荧光定量PCR检测肠道病毒和EV71阳性率及病毒拷贝数,用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）定性检测血清EV71病毒IgM抗体.结果 荧光定量PCR检测肠道病毒阳性病例42例,检测阳性率为35.6％;EV71阳性病例22例,检测阳性率为18.6％,占EV阳性病例的52.3％;ELISA定性检测EV71病毒IgM抗体,阳性病例30例,检测阳性率25.4％,肠道病毒和EV71病毒性脑炎患者6岁以内幼儿明显多见于其他年龄组.结论 肠道病毒是本地区病毒性脑炎、脑膜炎患者最常见的病原体,EV71可能是本地区肠道病毒性脑炎中最多见的一种,肠道病毒和EV71感染所致脑炎都以6以内幼儿为主;荧光定量PCR对EV71检测特异性高于ELISA.     

佛山地区手足口病病毒检测及临床特征

目的 探讨手足口病(HFMD)患儿咽拭子的病毒水平及其临床意义.方法 对105例HFMD患儿采集咽拭子(其中66例于恢复期采集咽拭子复查),以荧光定量RT-PCR方法检测病毒负荷量并做对比分析;用描述性流行病学方法对实验室确诊病例进行流行病学特征分析.结果 本组病例中57例(54.3％)肠道病毒71型( EV71)检测阳性,28例(26.7％)柯萨奇病毒A16( CoxA 16)检测阳性.其中合并甲型流感病毒感染1例,副流感病毒感染4例,冠状病毒感染1例.急性期患儿病毒负荷水平明显升高,恢复期病毒水平明显下降,部分(13例)恢复期患儿病毒检测阴性.结论 咽拭子荧光定量RT-PCR检测是儿童HFMD的病原学诊断的快速有效手段.HFMD临床表现轻重与患儿咽部病毒负荷量无相关性.患病早期病毒呈高水平表达,抗病毒治疗宜尽早实施.     

贵阳地区2013年手足口病非 EV71、非 CVA16型肠道病毒的检测分析

目的：了解贵阳地区引起手足口病（HFMD）的非肠道病毒71型（EV71）、非柯萨奇病毒 A（CVA）16型肠道病毒的病原构成及优势型别,为贵阳地区 HFMD 防治工作提供依据。方法收集2013年4～6月检测为非 EV71、非 CVA16型肠道病毒的 HFMD 患者肛拭子标本共107例。提取病毒核酸,用巢式 RT-PCR 法扩增病毒 VP4区序列,对 PCR 阳性扩增产物进行测序,通过与 GenBank 收录的序列 BLAST 比对确定病毒型别;并对优势型别进行序列和进化分析。结果107例标本中共有100例标本巢式 RT-PCR 检测为阳性（93％）,其中100例 PCR 产物测序成功,经 BLAST 比对后,100例标本病毒型别均得到确定：CVA6为46例,CVA10为30例,CVA5为10例,CVA2为6例,CVA3和 CVA4各2例,CVB2和 ECHO16各2例。 CVA6在型别确定的非 EV71、非 CVA16型肠道病毒中占42．99％,为优势肠道病毒型别。结论贵阳地区引起 HFMD 的肠道病毒型别多样,CVA6为非 EV71、非 CVA16型肠道病毒中的优势型别。     

东莞市2011年手足口病肠道病毒型别分析

目的了解引起东莞市2011年手足口病疫情的肠道病毒型别。方法采用荧光RT-PCR方法对标本中总肠道病毒、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16)进行特异性核酸检测。对非EV71非CVA16的其它肠道病毒采用VP4基因测序进行型别鉴定。结果 2011年共检测608份手足口病病例标本,537份为阳性,其中198份为EV71阳性(占36.87%),128份为CVA16阳性(占23.84%),211份为非EV71、非CVA16的其它肠道病毒阳性(占39.29%)。对其它肠道病毒进行VP4基因测序分型,共获得50个可用序列,通过BLAST在线比对确定型别,1例CVA1,43例CVA6,4例CVA10,1例CVA12,1例CVB1。结论 2011年引起手足口病的非EV71非CVA16肠道病毒构成比已超过EV71和CVA16,成为东莞引起手足口病主要病原体之一,其中CVA6构成比较大,值得进一步研究。     

实时荧光RT-PCR法在手足口病患儿病原检测中的应用

目的:了解核酸检测(RT-PCR)法在抚顺市手足口病患儿病原谱调查中的应用价值,为疾病防控提供依据。方法:在全市范围内收集2013年和2014年疑似手足口病患儿咽拭子、肛拭子标本,使用人肠道病毒通用引物、肠道病毒71型(EV71)引物和萨奇病毒A组16型(Cox A16)引物,采用实时荧光RT-PCR方法进行病原核酸检测。结果:2013年检测标本461份,其中EV71阳性16份,Cox A16阳性316份,其他肠道病毒阳性46份。2014年检测标本253份,其中EV71阳性112份,Cox A16阳性57份,其他肠道病毒阳性35份。两年标本肠道阳性率平均为81.51%,其中EV71型和Cox A16型占阳性标本总数的86.08%。结论:实时荧光RT-PCR方法因具有操作简便、快速和特异性高的优点,非常适合于手足口病患儿病毒核酸的快速分型。EV71型和Cox A16型肠道病毒是抚顺市近两年引起手足口病患儿感染的主要病原体。     

EV71型与其他EV手足口病患者WBC和CRP结果分析

目的：比较EV71型与其他EV手足口病患者白细胞（WBC）和C反应蛋白（CRP）结果是否有差异,为临床医师治疗EV71型感染的手足口病提供参考依据。方法回顾我院感染性疾病科收治的手足口病患儿86例,应用RT-PCR法检测患者咽拭子肠道病毒类型,分为肠道病毒71型（EV71）组和其他肠道病毒感染组,分析2组患者WBC和CRP结果。结果 EV71型与其他型肠道病毒感染的手足口病患儿WBC和CRP定量检测结果和异常率比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论 EV71型与其他型肠道病毒手足口病感染患者WBC、CRP检测结果无差异,不能用WBC和CRP来区分EV71型和其他肠道病毒感染以及患者病情严重性。     

2010~2013年濉溪县手足口病病原学及流行病学特征分析

目的了解本地区手足口病(HFMD)病原及流行病学特征,为HFMD防治提供科学依据。方法 251例临床诊断手足口病患者来自濉溪县医院2010年1月至2013年12月住院病例,采集咽拭子标本,应用实时荧光RT-PCR法检测标本中的人肠道病毒(HEV)、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)特异性核酸,分析手足口病的流行病学特征。结果251例HFMD患者标本,肠道病毒阳性率为28.69%(72/251),EV71阳性率为19.92%(50/251),Cox A16阳性率为6.77%(17/251),其他HEV阳性率为1.99%(5/251)。72例检测阳性病例中,EV71阳性病例50例占69.44%,Cox A16 17例占23.61%,CoxA16在年检测阳性率方面有统计学意义(P<0.05),EV71病毒在每年病原检测比例中都处于较高水平,为2010~2013年手足口病的优势病原。流行高峰主要是每年的3~6月份,发病年龄主要集中在1~3岁幼儿,肠道病毒检测阳性率在性别、年龄、流行季节方面比较无差异统计学意义(P>0.05)。结论 2010~2013年手足口病流行中,病原体主要为以EV71和Cox A16,其中EV71是优势病毒型,应加强1~3岁婴幼儿手足口病的预防和监测。     

血肠道病毒核糖核酸测定协助诊断心肌炎的价值

为探讨血肠道病毒核糖核酸测定对协助诊断心肌炎的价值,本文根据肠道病毒高度保守区设计合成引物序列,应用RT—PCR方法分别对120例心肌炎患者,40例正常人血标本进行肠道病毒核糖核酸检测。结果检出率分别为54％及5％,说明RT—PCR在用于临床心肌炎诊断上具有很高的特异性和敏感性,优于间接酶链免疫吸附法。     

珠海市手足口病流行病学分析

目的探讨珠海市手足口病的流行病学特点。方法利用荧光PCR检测手足口病临床诊断标本和健康人群标本柯萨奇病毒A组16型（coxsackievims A16,CoxA16）、肠道埃可病毒71型（enterovims 71,EV71）以及非EV71和CoxA16其他肠道病毒阳性率。采用描述性流行病学研究方法进行流行病学特征分析。结果319份临床样本EV71、CoxA16以及非EV71和CoxA16其他肠道病毒阳性率分别为26．02％,6．90％和30．09％;180份健康人群样本Ev71和CoxA16均阴性,非EV71和CoxA16其他肠道病毒阳性率2．78％。在105份手足口病实验室诊断病例中,男性68例,女性37例。1～5岁感染病例数最多,占实验室诊断病例的86．67％。病例主要集中在3～7月,占诊断总数的85．71％,高峰在6月。病例以散居婴幼儿为主。结论珠海市手足口病临床诊断病例中EV71、CoxA16以及非EV71和CoxA16其他肠道病毒阳性率显著高于健康人群。实验室诊断病例以1～5岁托幼儿童为主,男性多于女性,病例发生有明显的季节性。     

感染性心内膜炎瓣膜标本中肠道病毒RNA的检测

为探讨肠道病毒在感染性心内膜炎发病中的作用，应用逆转录聚合酶键反应对34例感染性心内膜炎患者的瓣膜标本和11树先心患者瓣膜（或心肌）标本进行肠道病毒基因检测。结果在感染性心内膜炎患者的瓣膜标本中阳性14例，阳性率41．2％；先心患者瓣膜（或心肌）标本阳性1例，阳性率9．1％，两者经统计学处理有显著性意义（P＜O．05）。结论：感染性心内膜炎的发病与肠道病毒感染有一定关系。     

应用通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应检测肠道病毒

目的设计通用引物建立巢式逆转录聚合酶链反应(RT-n-PCR),以达到广泛.特异及快速诊断肠道病毒(Enterovirus,EV)感染.方法在EV基因组5'端非编码区(5'-UTR)设计二对通用第物,建立RT-n-PCR检测方法,对3种EV和3种非EV标准株以及165例可疑EV感染的327份临床标本进行检测.结果EV标准株均在电泳中检测到一清晰312bp扩增条带,而非EV标准株则无扩增条带;共有104份标本检测到相应大小扩增条带,阳性率31.8%;147例病例同时检测了粪便和咽拭子,粪便阳性49例,咽拭子阳性44例,其中粪便和咽拭子同时阳性35例,粪便和咽拭子EV阳性比较无显著性差异(P＞0.05).病例总阳性数64例,阳性率38.8%.结论RT-n-PCR可以准确地检测出肠道病毒,特异性强,用时少,同时检测多份标本可以提高EV阳性率.     

泰安市2013年手足口病病原体检测结果分析

目的对2013年泰安市手足口病病例进行病原体检测和分析。方法对临床诊断为手足口病病例的粪便标本505份,用实时荧光定量PCR筛选出肠道病毒通用引物阳性的标本,再分别使用Cox A 16和EV71型的特异引物进行分类检测。结果标本总肠道病毒阳性率为95.05%（408/505）,Cox A 16阳性率为31.09%（157/505）,EV71阳性率为27.92%（141/505）,其他肠道病毒阳性率为36.24%（183/505）,Cox A 16的阳性率高于EV71。发病年龄多为1-6岁,男性多于女性。结论 2013年度泰安市的手足口病疫情以EV71和Cox A 16并发为主,采用分子生物学方法检测手足口病的病原体,对手足口病的监测及防控具有重要作用。     

石蜡包埋组织切片原位核酸杂交研究

目的 :探讨石蜡包埋组织切片的原位核酸杂交方法 ,以检测克山病 ( KSD)尸检心肌中的RNA。方法 :应用生物素标记的人工合成寡核苷酸探针 ,对 72例心肌石蜡包埋组织切片进行原位核酸杂交。结果 :各型克山病心肌石蜡组织切片的阳性杂交信号为 80 %～ 87.9% ,而正常对照仅为 14.3%。结论 :应用人工合成寡核苷酸之原位核酸杂交技术 ,对长期保存的石蜡组织进行回顾性研究是可行的。     

聚合酶链反应技术诊断中枢神经系统肠道病毒感染

目的：探讨肠道病毒（ＥＶ）在中枢神经系统感染中的致病情况,建立一种检测ＥＶ感染的方法。方法：采用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和病毒分离技术检测４０种ＥＶ标准毒株和４６例无菌性脑膜炎、脑炎病人脑脊液（ＣＳＦ）标本。     

新疆2011-2013年肠道病毒71型VP1区基因特征分析简

目的了解新疆肠道病毒71型（EV71）分离株VP1区基因特征。方法选取2011-2013年新疆部分地州手足口病病例标本,临床标本或其病毒培养物经实时荧光PCR鉴定后,通过RT—PCR法进行VP1区编码基因扩增,并对扩增产物进行序列测定,所得序列用ChromasPro1．7．4,BioEdit7．1．11和MEGA5．1软件进行序列校正、拼接、整理和分析,并与EV71各型及亚型参考序列构建基于VPl序列的系统进化树。结果新疆EV71分离株之间核苷酸和氨基酸序列同源性在92．8％～100．0％和97．9％～100．0％,22株病毒株与安徽阜阳和山东临沂C4a基因参考株最为相近,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在93．9％～98．6％和98．6％～99．6％。而与A、B基因型参考株差异较大,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在82．1％～84．8％和95．9％～98．3％。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定的阳性率为30．0％,低于用病毒培养物的阳性率（100．0％）。结论2011—2013年新疆EV71分离株均为C4a基因型,与安徽和山东分离的EV71毒株可能有相同的起源。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定可用于肠道病毒的分型鉴定。     

2010年邢台市手足口病重症病例检测结果分析

目的对2010年邢台市手足口病重症病例进行病原体检测。方法收集临床诊断为手足口病重症病例的疱疹液、咽拭子和肛拭子标本385份,采用实时荧光定量PCR对这些标本进行人肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型和其它肠道病毒的分型检测。结果人肠道病毒71型阳性率80.00%,柯萨奇病毒A组16型阳性率0.26%,其它肠道病毒阳性率7.53%;阳性率较高的地区为东南部平原人口密集区,发病率较高的年龄组为1～3岁,男性多于女性。结论实时荧光定量PCR可用于手足口病的病原体分型检测,一旦发现手足口病患者感染的病原体为人肠道病毒71型,可提示临床医生警惕手足口病重症病例的发生,对减少手足口病重症病例发生及防止患儿死亡具有重要作用。     

PDGFR-α在胃肠道间质瘤中的表达及其临床意义

目的:通过检测胃肠道间质瘤中血小板衍生生长因子受体-α(PDGFR-α)的表达情况,探讨PDGFR-α在胃肠道间质瘤中的诊断及预后意义。方法:应用免疫组织化学EnvisionTM二步法检测了119例胃肠道间质瘤中的PDGFR-α蛋白的表达情况,并与非胃肠道间质瘤进行对照研究。结果:在胃肠道间质瘤中PDGFR-α的阳性表达率为65.5%(78/119),其中,极低危险性、低度危险性、中度危险性和高度危险性的阳性率分别为52.9%(9/17)、71.0%(22/31)、67.9%(19/28)和65.1%(28/43),但各组之间PDGFR-α的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。胃肠道间质瘤和非胃肠道间质瘤PDGFR-α的表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PDGFR-α联合CD117应用于胃肠道间质瘤的检测,特别是对一些CD117表达阴性的胃肠道间质瘤诊断及鉴别诊断具有重要的临床意义,但其不能作为胃肠道间质瘤分化程度的指标。