基因转染肺癌细胞表达之血管内皮抑素对血管内皮细胞的影响

目的:研究肺癌A549细胞体外转染重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因后,其产物对血管内皮细胞增殖的抑制作用。方法:体外培养肺癌A549细胞,分为3组:实验组、缺陷型腺病毒组、PBS组。以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将血管内皮抑素基因导入体外培养的肺癌A549细胞,ELISA检测外源基因内皮抑素,在体外培养的肺癌A549细胞中的表达。体外培养血管内皮细胞,以MTT法评价重组血管内皮抑素基因腺病毒(Ad.Endostatin)转染肺癌细胞后含内皮抑素的上清液对内皮细胞增殖的抑制作用。结果:ELISA检测结果:重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因在转染的肺癌A549细胞中高效表达,在转染肺癌细胞后第1天即有内皮抑素的表达,在第3天达到高峰,5～7天后逐渐减弱。缺陷型腺病毒组及PBS组未见有表达。MTT检测结果:Ad.Endostatin转染肺癌A549细胞后表达的内皮抑素可抑制体外培养的血管内皮细胞的增殖,而缺陷型腺病毒组及PBS组对血管内皮细胞的增殖未见有抑制作用。结论:腺病毒介导的血管内皮抑素基因转染肺癌细胞表达之血管内皮抑素,能很好抑制血管内皮细胞的生长和增殖,为进一步开展肺癌基因治疗打下基础。     

重组人血管内皮抑素对Lewis肺癌抑制作用的实验研究

[目的]研究重组人血管内皮抑素对Lewis肺癌的抑制作用。[方法]采用MTT法检测不同剂量不同时间重组人血管内皮抑素对Lewis肺癌细胞增殖的影响;建立Lewis肺癌自发转移模型,将40只荷瘤小鼠随机分为重组人血管内皮抑素小、中、大剂量组(5、15、30 mg.kg-1.d-1)及对照组各10只,连续给药14 d,停药1周后处死小鼠,绘制肿瘤生长曲线,计算原发瘤抑瘤率;利用光镜和透射电镜技术,观察重组人血管内皮抑素对Lewis肺癌细胞以及对荷瘤小鼠血管内皮细胞和肿瘤细胞的形态学改变。[结果]重组人血管内皮抑素对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用与浓度和作用时间呈正相关,400 ng处理72 h后的抑制率为(68.4±1.5)%,与处理24 h后的抑制率(21.9±2.1)%比较,差异有显著性意义(P<0.05)。各给药组肿瘤生长均较对照组缓慢,小、中、大剂量组的抑瘤率分别为28.2%、49.7%、52.8%。各给药组小鼠瘤组织内均有大面积坏死,血管内皮细胞和肿瘤细胞均发生早期凋亡的改变,且具有剂量依赖性。[结论]重组人血管内皮抑素对Lewis肺癌的抑制作用可能表现为对肿瘤细胞和毛细血管内皮细胞的双重抑制作用。     

内皮抑素基因治疗对癌性腹水抑制效应研究

目的 探讨内皮抑素基因对癌性腹水的治疗作用，并观察与化疗药物顺铂(DDP)联合应用的疗效。方法 利用已构建的腺病毒载体介导的内皮抑素基因，在体外转染sKOV3肿瘤细胞，观察其对人脐静脉内皮细胞的抑制，在小鼠腹腔内注射腺病毒载体介导的内皮抑素基因，观察其在体内的表达情况，在两个不同的小鼠肿瘤腹水模型腹腔中注射腺病毒载体介导的内皮抑索基因，观察其对腹水形成、腹膜渗透性、新生血管形成及肿瘤细胞作用，以及对小鼠生存期的影响等，并比较与化疗药物顺铂联合应用的疗效。结果 ①体外重组内皮抑素蛋白抑制内皮细胞生长，在1：8稀释倍数时内皮细胞抑制率达到50％以上；②腺病毒载体介导的内皮抑素基因在小鼠体内能够表达，在注射第3d血清表达量最高，达1921ng／m1；③使用内皮抑素基因治疗组小鼠的腹水量，腹膜渗透性受到明显抑制，腹水中的红细胞、癌细胞、血管内皮生长因子水平明显减少，腹水中的凋亡细胞明显增多，肿瘤组织内微血管密度明显减少，小鼠的生存期明显延长。内皮抑索基因治疗与化疗联合应用进一步加强这一种治疗效果。结论 内皮抑素基因治疗有望成为治疗癌性腹水的一种新方法，与化疗联合应用可以加强这种治疗效果。     

在结肠癌细胞内高效表达内皮抑素的增殖型腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建携带内皮抑素基因的增殖型腺病毒载体,寻找结肠癌的有效治疗方法.方法:通过RT-PCR克隆内皮抑素基因,293细胞内分别重组携带内皮抑素基因的增殖型(CNHK200-hE)和增殖缺陷型(Ad-hE)腺病毒,分别体外感染结肠癌细胞HT-29后比较两者在细胞病理效应、病毒增殖和内皮抑素表达量方面的差异.结果:CNHK200-hE感染结肠癌细胞96 h后可增殖2 000多倍;感染后7 d肿瘤细胞死亡率达96.2%,而对正常肝细胞基本无杀伤作用;随着感染时间的延长,肿瘤细胞培养上清液中内皮抑素表达量不断增加,第5天达1 090 ng/ml,显著高于Ad-hE感染组(P<0.01).结论:携带内皮抑素基因的增殖型腺病毒CNHK200-hE具有高效表达内皮抑素和在结肠癌细胞内增殖并杀灭肿瘤细胞的作用.     

血管抑素抑制鼠视网膜微血管内皮细胞增生及视网膜新生血管形成的研究

目的　探讨血管抑素蛋白对体外培养的鼠视网膜微血管内皮细胞 (REC)生长的抑制作用及其抑制视网膜新生血管形成的效果。方法　从血浆中分离血管抑素。原代培养鼠视网膜微血管内皮细胞 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色法检测不同浓度的血管抑素对其生长的抑制作用。高浓度氧诱导C57BL/ 6J小鼠建立视网膜缺血性病变动物模型。将 30只小鼠分为 5组 :正常组 ;高氧对照组 ;实验Ⅰ组 (血管抑素浓度 15 0 μg/ μl) ;实验Ⅱ组 (血管抑素浓度 2 0 0 μg/ μl) ;实验Ⅲ组 (血管抑素浓度 30 0μg/ μl) ,计数各组小鼠视网膜新生血管内皮细胞核数 ,并加以比较。 结果　血管抑素在体外能显著抑制视网膜微血管内皮细胞增殖 ,其半数有效剂量 (ED50 )约为 130 μg/ml。吸入高氧的鼠不论是对照组还是血管抑素治疗组每只眼均可见突出内界膜的新生血管内皮细胞 ,发生率为 10 0 %。实验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组与高氧对照组相比小鼠视网膜新生血管细胞核数分别减少了 4 2 %、5 7%、82 %。结论　血管抑素在体外能有效地抑制视网膜微血管内皮细胞增殖。血管抑素能有效抑制高氧诱导的小鼠视网膜新生血管形成     

内皮抑素基因腺病毒联合化疗治疗小鼠Lewis肺癌

目的:研究腺病毒介导的小鼠内皮抑素基因联合化疗对肺癌的综合治疗作用.方法:利用病毒重组技术将内皮抑素基因克隆入增殖缺陷型腺病毒基因组中,构建携带内皮抑素基因的重组腺病毒Ad-mES,复制小鼠Lewis肺癌的动物模型,随机分成4组,每组10只:化疗组,皮下隔日注射环磷酰胺150 mg/kg,共3次;基因治疗组,一次性瘤内多点注射6×1010 pfu/ml的Ad-mES病毒纯化液100 μl;基因联合化疗组,Ad-mES病毒纯化液联合环磷酰胺,剂量同上;对照组,以0.9%生理盐水100 μl替代环磷酰胺.定期测量各组肿瘤体积,采用Western印迹分析检测基因转导后肿瘤组织中内皮抑素的表达,应用免疫组化法检测肿瘤微血管密度(MVD),观察内皮抑素基因对肿瘤血管生长的抑制作用.结果:构建了表达内皮抑素的重组腺病毒载体Ad-mES;各治疗组荷瘤C57BL/6小鼠肿瘤生长抑制明显,以基因联合化疗组尤为显著(P＜0.01);基因治疗组和基因联合化疗组MVD与对照组和化疗组相比差异显著(P＜0.05).基因治疗过程中未见明显不良反应,且荷瘤鼠生存期明显延长,以联合治疗组为著(P＜0.05).结论:所构建的Ad-mES重组腺病毒载体可有效表达具有生物学活性的内皮抑素;并能减少肿瘤内微血管生成、减慢肿瘤增殖、延长生存期.     

人内皮抑素基因对人脐静脉内皮细胞周期变化的影响

目的 研究人内皮抑素基因对人脐静脉内皮细胞增殖能力的影响.方法 RT-PCR获取人内皮抑素基因(hEndostain,hES),通过酶切、测序鉴定获取的hES,MTT法检测该基因对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响.结果 获得的hES基因经测序证实成功克隆人内皮抑素基因;hES基因转染HUVEC细胞24h,48h和72h,细胞增殖率均较正常组明显降低(P＜0.05),而脂质体对照与载体对照与对照组无明显变化.结论 hES基因能够抑制HUVEC增殖.     

人内皮抑素基因对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用

目的研究人内皮抑素基因对人脐静脉内皮细胞增殖能力的影响。方法RT-PCR获取人内皮抑素基因，通过酶切，测序鉴定获取的hES，MTT法检测该基因对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的影响。结果获得的hES基因经测序证实成功克隆人内皮抑素基因；hES基因转染HUVEC细胞24h、4h和72h，细胞增殖率均较正常组明显降低（P〈0．05），而脂质体对照与载体对照与对照组无明显变化。结论hES基因能够抑制HUVEC增殖。     

硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素之纯化和生物学活性鉴定

目的:将硫氧还蛋白融合表达系统表达的小鼠内皮抑素(endostatin)进行纯化并对其生物学活性进行测定.方法: 将含有pThioHis-endo重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物为包涵体,将包涵体纯化后通过镍柱亲和层析得到纯化的、可溶性的小鼠内皮抑素,经SDS-PAGE分析鉴定.将纯化的蛋白质通过鸡胚尿囊膜血管生成抑制实验和内皮细胞抑制实验对纯化的蛋白质进行生物学活性测定.结果:经SDS-PAGE电泳分析获得了高纯度的小鼠内皮抑素重组融合蛋白,纯度可达95%,得率为0.27 g/L.纯化的重组蛋白在体外能抑制鸡胚囊膜血管生成及具有抑制血管内皮细胞增殖的活性,加入重组蛋白内皮抑素5 μg组与10 μg组血管生成抑制率分别为(22.3±2.0)%和(47.1±4.0)%,P<0.05,和对照组经过方差分析,差异都有显著性意义;内皮细胞抑制实验可见不同剂量重组蛋白内皮抑素对内皮细胞的生长具有抑制作用[抑制率分别为(49.6±4.1)%,(53.2±2.3)%,(55.0±3.6)%,(67.1±5.7)%],经过方差分析和相关性分析,具有剂量依赖效应(r＝0.984,P<0.05).结论: 用硫氧还蛋白融合表达系统在大肠杆菌中表达的小鼠内皮抑素重组融合蛋白易纯化并具有高活性.     

人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化及其对小鼠肺腺癌LA795细胞生长的抑制

目的通过基因重组技术获得能高效分泌表达人内皮抑素的毕赤酵母菌株;观察纯化的重组人内皮抑素(rhES)对小鼠肺腺癌LA795生长的抑制作用。方法 利用氯化锂转化法将人内皮抑素基因整合入毕赤酵母基因组,获得可分泌表达人内皮抑素(endostatin)的菌株。用肝素亲和层析的方法纯化目的蛋白。观察人内皮抑素对碱性纤维生长因子(bFGF)刺激的人血管内皮细胞系ECV－304细胞增殖的作用。将接种LA795肺腺癌细胞的T739小鼠随机分成2组,分别给予rhES和磷酸缓冲盐液(PBS)皮下注射,每日1次,连续14d。观察2组小鼠肿瘤生长情况。结果经筛选获得表达量较高的转化菌株,其表达的rhES能明显抑制bFGF刺激的人血符内皮细胞系ECV－304细胞的增殖,与对照组比较具有显苫差异(P＜0．001),动物实验表明其有效抑制小鼠肺腺癌LA795的生长(P＜0．001)。结论用毕亦酵母作为宿主分泌表达的rhES具有良好的生物学活性,能有效抑制小鼠肺腺癌LA795的生长。     

重组腺相关病毒介导内皮抑素的表达及体外活性研究

目的 构建携带人内皮抑素基因的重组腺相关病毒rAAV-hEndo,介导其体外表达并检测其生物活性。方法 采用无需包装辅助病毒的双质粒共转染方法制备rAAV-hEndo,测定其滴度及感染效率。免疫荧光染色检测内皮抑素蛋白在体外感染细胞中的表达,并通过MTT法、细胞周期检测及TUNEL法检测细胞凋亡指数,观察其对人脐静脉内皮细胞ECV304的影响。结果 所制备的重组腺相关病毒滴度为2×10¹²vg/ml,感染效率达98%。免疫荧光染色显示内皮抑素蛋白主要表达于细胞胞质。rAAV-hEndo感染细胞培养上清对ECV304细胞72h增殖抑制率为67.3%。内皮细胞转染内皮抑素基因后细胞周期明显阻滞于G₁期,其G₁期占(72.5±4.0)%,与对照组(52.1±2.1)%比较有显著差异(P<0.01)。TUNEL法检测实验组内皮细胞凋亡指数为(32.6±3.2)%,与对照组(4.2±1.9)%比较有显著差异(P<0.01)。结论 所制备的重组腺相关病毒rAAV-hEndo能有效介导具有生物活性的内皮抑素表达,为进一步肿瘤抗血管生成基因治疗动物实验奠定了基础。     

重组腺相关病毒介导内皮抑素的表达及体外活性研究

OBJECTIVE: To construct the recombinant adeno-associated viral vector containing human endostatin gene (rAAV-hEndo) and observe the biological activity of the expressed human endostatin in vitro. METHODS: rAAV-hEndo was prepared using a helper virus-free packaging system. The rAAV viral genome titer was quantified by Taqman real-time PCR, and the endostatin expressed in human umbilical vein endothelial cell line ECV304 was detected by immunofluorescence staining. The effects of endostatin on ECV340 cells were evaluated by MTT cell proliferation assay, cell cycle analysis and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling (TUNEL) technique. RESULTS: The viral titer of rAAV-hEndo prepared was 2 x 10(12) vg/ml and the vector had an infection efficiency of 98%. Immunofluorescence staining showed that the human endostatin protein was expressed mainly in the cytoplasm of ECV304 cells, and the proliferation of the cells was obviously inhibited by the supernatant of rAAV-hEndo, with a inhibition rate of 67.3% 72 h after the addition of the supernatant. ECV304 cells infected with rAAV-hEndo were obviously arrested in G(1) phase, and the G(1)-phase cell percentage of treatment group were significantly higher than that of control group [(72.5+/-4.0)% vs (52.1+/-2.1)%, P<0.01]. ECV304 cells infected with rAAV-hEndo demonstrated markedly enhanced apoptosis, with a significantly greater apoptotic index than that of the control cells [(32.6+/-3.2)% vs (4.2+/-1.9)%, P<0.01]. CONCLUSION: rAAV-hEndo can effectively mediate the expression of biologically active human endostatin, which may facilitate further study of antiangiogenic gene therapy with endostatin for cancers.     

内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达

目的：构建人内皮抑素（Human Endostatin，hE）基因的腺病毒载体，并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法：采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞；免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达；用不同感染复数（Muhiplicity of infection，MOI）的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞，观察细胞生长。结果：成功构建了含hE基因的腺病毒载体；经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白；表达的hE蛋白具有一定的生物学活性，可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论：获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体，表达产物可抑制ECV304细胞的增殖，为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。     

TRAIL和endostatin双基因-放射治疗对人血管内皮细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的：观察重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES携带的双基因TRAIL和endostatin联合X射线照射后,对血管内皮细胞ECV304增殖、周期和凋亡的影响。方法：实验分为对照组、空载体pshuttle转染组、TRAIL单基因重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL转染组、endostatin单基因重组质粒pshuttle-Egr1-shES转染组和TRAIL、endostatin双基因重组质粒pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES转染组。细胞转染采用脂质体介导的方法进行,对照组不转染。细胞转染后给予X射线照射（照射剂量分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0和5.0 Gy）,采用ELISA法检测转染细胞中TRAIL和endostatin蛋白的表达,并分别采用MTT及PI单染或/和Annexin Ⅴ双染流式细胞术（FCM）检测TRAIL、endostatin单/双基因治疗联合放射治疗对ECV304细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。结果：2.0 Gy X射线照射后与0 h比较,各时间点转染pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES的ECV304细胞上清中TRAIL和endostatin蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,分别于12和24 h达峰值;不同剂量X射线照射可诱导TRAIL和endostatin蛋白表达,且蛋白表达水平随照射剂量的增加而明显升高（P<0.05或P<0.01）。MTT结果显示,X射线照射后, pshuttle-Egr1-shTRAIL、pshuttle-Egr1-shES和pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES组ECV304细胞A490值均明显低于对照组和pshuttle组,并显示一定的时间-效应和剂量-效应关系,并伴有细胞凋亡率明显增加、G₂+M期细胞百分数明显上升和G₀/G₁期细胞百分数明显下降。上述细胞效应,尤以pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES组变化最为明显,与pshuttle-Egr1-shTRAIL和pshuttle-Egr1-shES组比较差异有统计学意义（P<0.05 或 P<0.01）。结论： TRAIL和endostatin双基因联合放射治疗可抑制ECV304细胞生长,影响细胞周期进程,促进细胞凋亡,且其治疗效果优于单纯放射治疗或TRAIL/endostatin单基因-放射治疗。     

Ad-VEGI151对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的:研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体的血管内皮细胞生长抑制因子基因(VEGI151)对静脉内皮细胞的增殖抑制作用.方法:利用腺病毒载体pCA13构建携带VEGI151基因的质粒,经293A细胞包装、扩增,Western印迹法检测病变细胞内基因的蛋白质表达.X-gal染色测定重组腺病毒载体系统的基因转移效率,结晶紫染色法检测细胞D570/630值,观察Ad-VEGI151对ECV304细胞增殖抑制作用的效果,免疫组织化学检测ECV304细胞内VEGI151基因的蛋白质表达.结果:应用细胞内质粒DNA同源重组法,将脂质体介导质粒pCA13-VEGI151与pJM17共转染293A细胞制备重组腺病毒,所获病毒滴度高,是一种制备重组腺病毒切实可行的方法.Ad-VEGI151在病变细胞内能成功表达蛋白,具有较高的基因转移效率,对静脉内皮细胞的增殖具有强烈的抑制作用,并能在靶细胞内表达有生物学活性的蛋白质.结论:以复制缺陷型重组腺病毒为载体的VEGI151基因能在靶细胞内表达具有生物学活性的蛋白质,抑制体外静脉内皮细胞的增殖,这为进一步肿瘤及新生血管性疾病的基因治疗提供了新的方法.     

纳米载体介导热诱导启动子调控内皮抑素基因治疗肝细胞癌

目的 探讨加热诱导调控下纳米载体介导内皮抑素(Endo)基因治疗对肝癌细胞HepG2的体内外杀伤作用.方法 双酶切法构建热诱导启动子(HSPTOB)调控Endo基因的重组质粒cDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP.溶剂挥发法制备载DNA的葡聚糖接枝聚乳酸纳米粒,透射电镜观察载DNA纳米粒的形态,并介导转染HepG2细胞,转染24 h后予以37 ℃、39℃、41℃、43℃、45℃加热诱导30 min,荧光显微镜和流式细胞术检测不同温度下EGFP表达,ELISA检测转染细胞上清Endo蛋白浓度,MTT法检测热诱导后Endo对HepG2和ECV304细胞牛长的影响,动物实验观察热诱导后Endo对肝癌移植瘤的抑制作用.结果 载DNA纳米粒呈圆形或椭圆形,粒径约90～120 nm.转染效率约30.65%.低温加热可增强HepG2细胞中Endo/EGFP表达,43℃组EGFP表达强度达37℃组的3.3倍.43℃热诱导后转染细胞上清中Endo浓度为(177±28)μg/L,高于不加热组(41 ±10)μg/L.Endo抑制ECV304的生长,72 h时热诱导后细胞抑制率为96.3%,对HepG2细胞的生长却无影响.体内实验显示热诱导后Endo显著抑制肝癌移植瘤的生长,肿瘤抑制率为58.5%,高于不加热组(34.9%).结论 纳米载体可介导Endo基因转染HepG2细胞,低温加热可增强HepG2细胞内Endo基因的表达和分泌,抑制肝痛移植瘤的生长.     

Enhanced effects of TRAIL-endostatin-based double-gene-radiotherapy on suppressing growth, promoting apoptosis and inducing cell cycle arrest in vascular endothelial cells

This study examined the effects of TRAIL-endostatin-based gene-radiotherapy on cellu-lar growth, apoptosis and cell cycle progression in human vascular endothelial cells ECV304 in vitro. The expression of TRAIL and endostatin protein in ECV304 cells was detected by ELISA after the transfection of recombinant plasmid pshuttle-Egr1-shTRAIL-shES and X-ray irradiation. Then MTT assay was used for determining the cellular proliferation, and flow cytometry (FCM) plus Annexin V and propidium iodide (PI) double-staining or PI single-staining were employed for the detection of apoptosis and cell cycle progression. The results showed that expression of TRAIL and endostatin protein exhibited a time- and dose-dependent change in ECV304 cells after pshut-tle-Egr1-shTRAIL-shES transfection in conjunction with irradiation. In the TRAIL-endostatin-based single- or double-gene-radiotherapy, the cell viability declined in a time- and dose-dependent manner, the percentage of cells at G2/M phase and apoptotic rate was increased, and the percentage of cells at G0/G1 phase was lowered as compared with those receiving radiotherapy alone. Moreover, TRAIL-endostatin-based double-gene-radiotherapy demonstrated better effects on growth inhibition, promotion of apoptosis and induction of cell cycle arrest in ECV304 cells than sin-gle-gene-radiotherapy.     

重组腺病毒介导hCGPx转染致血管内皮细胞产生抗氧化损伤作用的研究

目的 研究重组腺病毒介导的人胞浆型谷胱甘肽过氧化物酶（hCGPx）转染对血管内皮细胞ECV304氧化损伤保护作用。方法 将含hCGPx cDNA的质粒pGEM-T-hCGPx和重组腺病毒载体pACCMV-pLpA穿梭质粒进行基因重组，构建成pACCMV-hCGPx穿梭质粒后，与包装质粒pJM17共转染293细胞，构建成重组腺病毒AdCMV-hCGPx。用AdCMV—hCGPx转染体外培养的ECV304细胞并分为转染24、48和72h组，以转染空载体的细胞为对照组，检测转染细胞的基因表达水平。各组ECV304细胞经H2O2氧化损伤处理后，分别对细胞的活力和凋亡进行检测分析。结果 各转染组细胞转染基因表达率均显著高于对照组（P〈0．01）。经H2O2氧化损伤处理后，AdCMV-hCGPx转染组细胞活力较对照组明显增强，凋亡受到抑制。结论 重组腺病毒介导的hCGPx转染可保护ECV304细胞抵抗氧化损伤，具有明确的细胞保护作用，其具体保护机制可能与抗氧化和抑制细胞凋亡有关。     

小檗碱衍生物B-119抑制肿瘤及血管内皮细胞增殖的作用

目的探讨小檗碱衍生物B-119对肿瘤细胞的增殖抑制作用及对血管内皮细胞增殖、迁移和小管形成的影响。方法MTT法检测B-119对瘤细胞株MDA-MB-231、B16、K562、LLC、HT29、SMMC-7721、Colo205、HL60和血管内皮细胞ECV304的增殖抑制作用;划痕法测定B-119对血管内皮细胞ECV304迁移的影响;观察B-119对血管内皮细胞ECV304小管形成的影响。结果 B-119对8株肿瘤细胞具有不同程度的抑制作用,IC50值为0.76～26.83mg/L;B-119对ECV304的增殖抑制作用表现为时间、浓度依赖性,24,48,72h的IC50分别为59.22,12.08,3.31mg/L;药物干预组ECV304细胞迁移数减少,且随B-119浓度的增加,迁移抑制作用越强,B-119浓度为1.25,2.5,5mg/L干预24h后,细胞迁移数渐次减少,抑制率分别为49.29%,59.71%和71.94%(P<0.01);B-119对ECV304小管形成有明显的抑制作用,浓度为10,20,30mg/L时的小管形成抑制率分别为35.71%,57.14%和67.86%(P<0.01)。结论 B-119可抑制肿瘤细胞的增殖,并抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和小管形成。     

hSulf-1基因腺病毒表达载体的构建及其对血管内皮细胞增殖、迁移能力的影响

目的 构建携带人硫酸酯酶1基因(hSulf-1)的腺病毒载体,研究其对于人脐静脉内皮细胞ECV-304增殖、迁移能力的影响。方法 通过基因操作技术将hSulf-1基因插入到腺病毒基因组中,构建重组腺病毒Ad5-hSulf1;应用蛋白质免疫印迹法检测hSulf-1蛋白在ECV-304细胞中的表达及细胞内磷酸化Akt、ERK的表达变化;MTT实验检测hSulf-1过表达对于ECV-304细胞增殖的影响;采用划痕实验研究hSulf-1过表达对于ECV-304细胞迁移的影响。结果 成功构建携带目的基因hSulf-1的腺病毒载体;免疫印迹结果表明hSulf1基因过表达会下调ECV-304细胞Akt和ERK信号分子的磷酸化水平;细胞增殖实验结果表明hSulf1基因过表达抑制了ECV-304细胞增殖,感染复数为50、100时细胞存活率下降至(68.49±0.05)%以及(67.78±0.06)%(P<0.05);划痕实验结果表明hSulf1基因过表达能够抑制细胞的迁移,相比于对照组细胞迁移能力减弱(P<0.01)。结论 重组腺病毒Ad5-hSulf1介导的hSulf-1基因在ECV-304细胞中的过表达明显抑制细胞增殖及迁移,为hSulf-1用于肿瘤及血管生长相关疾病的基因治疗奠定了基础。