人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性

目的 探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法,为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据.方法 胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞;细胞生长曲线及MTT法测定细胞增殖能力;流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数;倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态;HE染色观察细胞爬片下的形态及着色;免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白;电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构,结果体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞;传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强;倒置镜下观察、HE染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞.结论 本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养.     

Primary culture of human and rat thoracic aortic fibroblast cells

目的 培养成纤维细胞,建立不同种属来源的胸主动脉成纤维细胞的培养方法并比较其形态差异.方法 用消化法和贴壁法分离不同来源的成纤维细胞,利用差速培养法纯化成纤维细胞,并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫染色鉴定.结果 接种24 h后细胞全部贴壁,48 h后人胸主动脉成纤维细胞体积增大并伸出伪足,形状以梭形或不规则形为主;而大鼠胸主动脉的成纤维细胞生长的相对较慢.结论 用Ⅰ型胶原消化动脉的成纤维细胞效果较好,用差速生长纯化的成纤维细胞可用于实验研究.     

人和大鼠胸主动脉成纤维细胞的原代培养

目的培养成纤维细胞,建立不同种属来源的胸主动脉成纤维细胞的培养方法并比较其形态差异。方法用消化法和贴壁法分离不同来源的成纤维细胞,利用差速培养法纯化成纤维细胞,并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养细胞行波形蛋白免疫染色鉴定。结果接种24h后细胞全部贴壁,48h后人胸主动脉成纤维细胞体积增大并伸出伪足,形状以梭形或不规则形为主;而大鼠胸主动脉的成纤维细胞生长的相对较慢。结论用Ⅰ型胶原消化动脉的成纤维细胞效果较好,用差速生长纯化的成纤维细胞可用于实验研究。     

人成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的建立不同组织来源成纤维细胞的培养方法并比较其培养差异。方法用消化法和贴壁法分离人胚胸主动脉成纤维细胞与人胚肺成纤维细胞,利用差速培养法纯化成纤维细胞,并对所培养的细胞进行倒置显微镜观察和苏木素-伊红染色,观察成纤维细胞形态,并对培养的细胞行波形蛋白免疫染色鉴定。结果接种24 h后人胚胸主动脉成纤维细胞全部贴壁,48 h后细胞体积增大并伸出伪足,形状以梭形或不规则形为主;而消化的人胚肺组织中细胞形态不一,经继续培养4～5代后,培养物完全由成纤维细胞构成。结论用胶原酶Ⅰ消化人胚胸主动脉成纤维细胞效果好,而用胰蛋白酶液消化人胚肺成纤维细胞效果较好,用差速生长纯化的成纤维细胞可用于实验研究。     

东方田鼠皮肤成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的 探索和建立东方田鼠皮肤成纤维细胞体外分离、培养的技术方法并观察其生物学特性。方法采用含10%小牛血清的Dulbecco 改良Eagle培养液(DMEM)和1640两种培养体系,运用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1 、3 d和5 d的东方田鼠乳鼠皮肤成纤维细胞进行原代分离、培养。苏木素-伊红染色及倒置相差显微镜下观察成纤维细胞形态和生长特性。结果0.25%胰酶消化分离出生后1 d和3 d东方田鼠乳鼠皮肤较出生后5 d组织可获得较多数量细胞,成纤维细胞在体外快速贴壁生长,一般6 ～7 d长满培养瓶,细胞纯度高,HE染色细胞呈长梭形,胞核明显；DMEM和1640两种培养液均可用于东方田鼠皮肤成纤维细胞的培养,但细胞传代后生长趋缓,只可传代2～3次。本实验运用组织块贴壁法未能培养出皮肤成纤维细胞。结论确定了有效分离东方田鼠皮肤成纤维细胞的日龄和方法,为进一步深入研究提供了技术方法和操作依据。     

大鼠软脑膜间皮细胞的原代培养与鉴定

目的建立一种有效的大鼠软脑膜间皮细胞体外培养方法。方法用机械吹打法和2.5 g.L-1胰蛋白酶轻消化法剥离SD乳鼠软脑膜组织后培养。采用倒置相差显微镜、苏木素-伊红染色、扫描电子显微镜、细胞免疫荧光及免疫细胞化学法鉴定细胞。结果倒置显微镜示细胞融合后呈多边形;苏木素-伊红染色显示细胞呈多角形,胞浆薄染为淡红色;扫描电子显微镜下见细胞有丰富的微绒毛;细胞免疫荧光显示大鼠软脑膜间皮细胞可表达细胞角蛋白;免疫细胞化学法鉴定显示细胞角蛋白、波形蛋白抗原阳性表达,第Ⅷ因子相关抗原及磷酸盐缓冲液空白对照呈阴性。结论机械吹打法和胰蛋白酶轻消化法培养软脑膜间皮细胞的方法切实可行,可为脑膜纤维化及脑积水的形成机制研究提供实验模型。     

大鼠乳鼠皮肤成纤维细胞的分离和体外培养

目的建立大鼠乳鼠背部皮肤组织和尾尖部皮肤组织成纤维细胞的体外培养方法,并比较二者的区别。方法分别取大鼠乳鼠的背部和尾尖部皮肤组织,利用组织贴块法分离和培养皮肤成纤维细胞,用酶消化法进行细胞传代培养,采用梯度温度冻存细胞。倒置显微镜下观察成纤维细胞的形态,用细胞骨架波形蛋白抗体进行鉴定。结果光学显微镜下3~5 d可见细胞从组织块游出,7 d细胞数量增多,10 d可贴满培养瓶壁;且大鼠乳鼠背部和尾尖部来源的皮肤成纤维细胞波形蛋白表达均为阳性。结论大鼠乳鼠背部和尾尖部来源的皮肤成纤维细胞的生物特点无差别,均可作为皮肤成纤维细胞的取材部位。     

人早孕绒毛滋养层细胞的体外分离与培养

目的 建立人早孕绒毛滋养层细胞有效的分离、培养方法.方法 利用成纤维细胞较滋养细胞贴壁早的特性,将滋养细胞与前者分离、纯化、培养.倒置显微镜观察滋养细胞的形态学特征;免疫细胞化学鉴定细胞来源及纯度.结果 倒置显微镜下可见细胞为上皮样细胞形态,呈片状铺展生长.细胞角蛋白染色阳性,波形蛋白染色阴性细胞达80%～85%,台盼蓝排斥试验示活细胞率超过90%.结论 采用差异贴壁法及体外培养条件,可简单、快捷地获得较高纯度的人早孕绒毛滋养细胞.     

异体表皮细胞和成纤维细胞库的建立

目的 寻找表皮细胞和成纤维细胞体外培养、鉴定、冻存与复苏的可行方法.方法 酶消化法分离表皮细胞和成纤维细胞,分别进行原代、传代培养,并对细胞进行冻存与复苏.表皮细胞进行广谱角蛋白-异硫氰酸荧光素(PAN-FITC)免疫荧光染色,成纤维细胞行波形蛋白-FITC免疫荧光染色.结果 表皮细胞呈克降样增长,以后细胞逐渐互相融合.PAN-FITC染色均为阳性.成纤维细胞的体外生长活力强,波形蛋白-FITC染色呈阳性.结论 酶消化法是表皮细胞和成纤维细胞体外培养的重要方法,本实验为构建组织工程皮肤奠定了基础.     

大白兔胸主动脉平滑肌细胞、成纤维细胞的培养

目的：探讨以简便、高效的方法获取血管平滑肌细胞、成纤维细胞,为相关研究提供实验材料。方法：切取兔胸主动脉,组织块法培养平滑肌细胞、成纤维细胞并进行倒置显微镜下观察、HE染色和α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白免疫组化染色。结果：95%的组织块存活,5代的平滑肌细胞、成纤维细胞纯度达98%以上。组织块于接种后6～8d即有细胞以垂直方向从组织块边缘迁移游出,呈放射状排列。2～4周出现＂峰＂、＂谷＂状生长特点,倒置显微镜、HE染色和α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白免疫组化染色均示平滑肌细胞、成纤维细胞。结论：组织块培养方法可简便、高效地培养、扩增并传代胸主动脉壁平滑肌细胞、成纤维细胞。