microRNA-126 基因敲减小鼠的鉴定及其血糖水平变化

目的：检测microRNA-126(miR-126)基因敲减(knock down,KD)小鼠各组织器官中miR-126的表达,并观察 小鼠血糖的变化,初步探讨其意义。方法：分别提取野生型(wild type,WT)和miR-126 KD模型小鼠中12种组织器官的 总RNA,荧光定量PCR探针法检测miR-126在12种组织器官的表达水平;检测小鼠血糖的变化,并观察小鼠体质量的 变化;HE染色观察肝脏和胰腺的病理改变。结果：与正常小鼠相比,miR-126 KD模型小鼠的脾、胰腺、肝、肌肉和 肺等器官组织中miR-126的表达显著下调(P<0.05);出生第7周和第16周模型小鼠血糖水平均明显增高(P<0.05),HE染 色显示模型小鼠胰腺和肝组织呈明显病理异常;出生第13周后,模型小鼠体质量逐渐增加(P<0.05)。结论：miR-126 KD小鼠血糖水平明显增加,可能与胰腺和肝的病理改变有关,提示miR-126在血糖代谢中具有重要作用,可能与2型 糖尿病的发生发展密切相关。     

一管酒精法提取转基因小鼠胚胎组织基因组的实验方法及应用

目的:优化提取基因组的方法,建立高效、简便、快速提取基因组DNA的方法,用于大批量转基因小鼠鉴定。方法:用一管酒精基因组DNA抽提法抽提基因组DNA。结果:经过分光光度法检测基因组DNA浓度、纯度及电泳分析DNA质量,显示一管酒精抽提法提取的基因组与经典酚/氯仿提取法提取的基因组产量、纯度及质量没有明显差别;酶切全基因组后,2种方法获得的基因组都可以被酶完全切开;两者模板都能成功应用PCR扩增来鉴定基因敲入小鼠并可应用于基因组测序及Real-time PCR检测基因敲入小鼠中外源基因并鉴定其相对拷贝数。结论:一管酒精基因组抽提法得到的DNA质量可靠,可高效、简便、快速鉴定转基因小鼠及进行基因组DNA酶切、测序、Real-time PCR等后续实验。     

一管酒精法提取转基因小鼠胚胎组织基因组的实验方法及应用

目的：优化提取基因组的方法,建立高效、简便、快速提取基因组DNA的方法,用于大批量转基因小鼠鉴定。方法：用一管酒精基因组DNA抽提法抽提基因组DNA。结果：经过分光光度法检测基因组DNA浓度、纯度及电泳分析DNA质量,显示一管酒精抽提法提取的基因组与经典酚氯仿提取法提取的基因组产量、纯度及质量没有明显差别;酶切全基因组后,2种方法获得的基因组都可以被酶完全切开;两者模板都能成功应用PCR扩增来鉴定基因敲入小鼠并可应用于基因组测序及Real-time PCR检测基因敲入小鼠中外源基因并鉴定其相对拷贝数。结论：一管酒精基因组抽提法得到的DNA质量可靠,可高效、简便、快速鉴定转基因小鼠及进行基因组DNA酶切、测序、Real-time PCR等后续实验。     

微小RNA-126基因在CD4+T细胞介导小鼠自身免疫性肠炎中的作用

目的 研究微小RNA-126(microRNA-126,miR-126)基因敲减(knock down,KD)对CD4+T细胞介导的自身免疫性结肠炎模型的影响并探讨其意义.方法 常规利用DSS溶液喂养野生型(WT)和miR-126基因敲减(miR-126KD)小鼠,诱导急性自身免疫性结肠炎模型.HE染色观察小鼠结肠组织病理变化;FACS检测CD4+T细胞的比例变化及其表面活化分子CD62L、CD44的表达;MACS分选出WT和miR-126KD小鼠脾脏中CD4+ CD62L+T细胞,CFSE染色标记后,分别经尾静脉转输给WT小鼠,再诱导自身免疫性结肠炎模型;HE染色观察结肠组织病理变化;FACS检测CFSE阳性CD4+T细胞表面活化分子CD62L、CD44的表达变化.结果 与对照组相比,miR-126KD小鼠肠组织绒毛缺失不完整,黏膜上皮出现较大溃疡,炎性细胞浸润增加;FACS结果显示,miR-126KD组小鼠CD4+T细胞比例和总数显著上调(P＜0.01);且高表达CD44,低表达CD62L;过继转输实验结果显示,miR-126KD小鼠CD4+T细胞转输组结肠组织损伤加重;同时,CFSE+细胞高表达CD44,低表达CD62L.结论 miR-126基因敲减加重葡聚糖硫酸钠所致肠炎的病变程度.     

miR-34在小鼠心脏组织中的表达和功能研究

目的 探讨miR-34家族中miR-34a、miR-34b、miR-34c在心脏组织的表达情况,确定这个家族中哪一个microRNA是主要表达形式;并比较miR-34家族在年轻小鼠心脏和老年小鼠心脏的表达差异,检测其中哪一个成员对由衰老引起的心脏功能退化具有敏感性,可作为心脏功能的检测标志.方法 提取小鼠心脏总RNA,对miRNA采用加尾法,反转成cDNA.使用RT-PCR的方式检测miR-34a、miR-34b、miR-34c引物的特异性.随后使用实时荧光定量PCR的方法检测miR-34a、miR-34b、miR-34c三个基因在心脏细胞中的表达差异.同时比较年轻小鼠和老年小鼠心脏组织中的miR-34a、miR-34b、miR-34c表达量.结果 提取的总RNA经检测符合要求,反转成cDNA后分别用miR-34a、miR-34b、miR-34c的荧光定量PCR引物检测,确认引物特异性极好,只有单一条带,可以进行下游荧光定量实验.在小鼠心脏组织中miR-34a的表达量较miR-34b和miR-34c高,说明miR-34a在miR-34家族中起主导作用.在老年小鼠心脏中miR-34a的表达量高于年轻小鼠（2.5倍）.miR-34b在老年小鼠心脏中也有部分上调（1.4倍）,而miR-34c在年轻小鼠和老年小鼠心脏中无明显变化.结论 在miR-34家族中,miR-34a的表达起主导地位,表达量高于miR-34b、miR-34c.随着年龄增加,miR-34a、miR-34b在老年小鼠心脏的表达量比年轻小鼠心脏要高,其中miR-34a 2.5倍的增幅明显大于miR-34b 1.4倍的增幅.故可将miR-34a作为心脏由衰老引起的功能退化的标志基因,也可作诊断心脏功能的重要指标.     

miR-100基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

目的 探讨miR-100基因敲除小鼠模型的构建及基因鉴定.方法 将引进的miR-100flox/flox小鼠与EIIa-Cre小鼠进行交配繁育出F1代小鼠,将F1代小鼠中基因型为miR-100flox/-的雌雄小鼠继续进行交配,获得F2代小鼠,待小鼠1周龄时剪尾部组织提取DNA,PCR法扩增目的基因片段,琼脂糖凝胶电泳进行基因型结果判定.结果 结果显示有所需要的miR-100基因敲除纯合子小鼠,将获得的敲除纯合子小鼠再交配,就可获得更多的基因敲除纯合子小鼠.F1代杂合子小鼠交配获得的F2代小鼠中出现3种基因型:miR-100flox/flox、miR-100flox/-、miR-100-/-,使用 PCR 法成功鉴定出了子代小鼠的基因型.同时剪取miR-100敲除纯合子小鼠、miR-100flox/flox小鼠及miR-100敲除杂合子小鼠的耳朵提取RNA,然后进行qRT-PCR验证miR-100的表达情况.qRT-PCR结果显示,miR-100基因全身敲除纯合子小鼠的耳朵中miR-100的表达几乎为零.结论 该实验成功配繁出miR-100基因全身敲除的小鼠模型,为后续实验提供基础.     

利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠

目的利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠。方法针对miR-223基因设计双重sgRNAs,将体外转录的sgRNAs和Cas9 mRNA共同显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行PCR扩增和测序以鉴定基因型,同时取小鼠肝脏研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miR-223在肝脏中的表达。结果设计了miR-223基因双重sgRNAs并对其进行了体外转录,纯化后显微注射小鼠受精卵细胞获得miR-223基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有3种基因型,一种为6 bp的缺失突变,但未对miR-223序列产生影响;另外两种为162 bp和168 bp的缺失突变,完全删除miR-223前体和成熟区序列。与野生型相比,这两种小鼠肝组织中几乎不能检测到miR-223的表达。结论设计双重sgRNAs并应用CRISPR/Cas9技术成功构建miR-223全基因敲除小鼠。     

miR-125a-5p基因敲除C57BL/6J小鼠的构建

目的：构建miR-125a-5p基因敲除小鼠并进行基因鉴定,并探讨基因敲除小鼠体内miR-125a-5p对靶基因Foxp3的调控。方法：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以C57BL/6J小鼠为背景,对miR-125a-5p基因位点进行基因敲除,培育纯合miR-125a-5p基因敲除小鼠。采用裂解法提取鼠尾组织基因组DNA,进行PCR反应检测亲代纯合miR-125a-5p基因敲除小鼠基因型,并选用雌、雄均为纯合子的基因敲除鼠作为亲代种鼠进行配种繁殖。通过全自动蛋白表达分析系统检测小鼠脾脏组织Foxp3的蛋白表达。结果：成功构建miR-125a-5p基因敲除小鼠,琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物为240 bp或0 bp单条带的为纯合型基因敲除（KO）小鼠,鉴定获得668 bp或428 bp单条带的为野生型（WT）小鼠,与预期的目的基因片段分子量大小一致,成功鉴定了miR-125a-5p基因敲除小鼠的基因型。选用雌、雄均为纯合子的基因敲除鼠进行配种繁育,获得了一批miR-125a-5p敲除纯合子基因型小鼠。与WT小鼠相比,miR-125a-5p基因敲除小鼠的脾脏组织中Foxp3表达降低（...     

miRNA-7在小鼠不同组织器官中表达的检测及其意义

目的 采用Real-time PCR方法来检测miRNA-7在小鼠12种不同组织器官中的表达情况并探讨其意义.方法 首先分别提取小鼠12种组织器官总RNA,用miRNA-7特异性引物逆转录为cDNA,采用Real-time PCR探针法检测miRNA-7在12种组织器官中的表达水平.结果 成功应用Real-time PCR方法检测miRNA-7在小鼠12种组织器官中的表达水平,结果显示,miRNA-7在肺组织中的表达水平最高,而在淋巴结中的表达水平最低.此外,在小肠、脑、胸腺、脾脏中也存在miRNA-7的高表达.结论 miRNA-7在小鼠的肺、小肠、脑、胸腺、脾脏中呈较高水平的表达,提示该分子可能在上述器官的发育、分化、功能维持及相关疾病发生中具有重要作用,为后续深入研究miRNA-7的生物学功能提供了前期试验依据.     

用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠

目的研究曲细精管微注射法建立转基因小鼠的可行性。方法选取人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白(pCMV-EGFP)表达载体,应用体视解剖镜和显微注射仪将不同剂量的被脂质体包裹的质粒DNA注射到不同年龄的KM小鼠曲细精管内。在注射后40d左右,雄鼠与雌鼠合笼交配;分娩后3周,剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PCR、Southernblotting技术进行整合检测。处死2只首建小鼠,荧光显微镜观察组织冰冻切片中EGFP的表达。结果共注射41只雄性小鼠,存活34只,其中32只具有交配、受精能力,获得仔鼠382只。仔鼠经检测,PCR阳性133只,Southernblotting阳性15只。小鼠的年龄、注射剂量与EGFP的整合率没有明显关系,荧光显微镜观察下没有观察到组织冰冻切片中EGFP明显表达。结论曲细精管微注射法是动物基因转移的一条简便可行的新途径。     

MiR?31 转基因小鼠的构建及其在组织器官的表达

目的构建稳定过表达的miR?31 转基因小鼠,检测其主要组织器官中miR?31的表达变化情况并对在体miR?31 过表达的应用提供合格的工具鼠?方法使用Gateway cloning 技术构建miR?31过表达载体,使用DNA 显微注射技术将构建好的载体注入受精卵内,随后转移至假孕母鼠内,待其自然生产?将新生小鼠提取尾部DNA,PCR 及琼脂糖凝胶电泳鉴定miR?31 过表达阳性小鼠,筛选阳性小鼠并饲养繁殖?另取阳性小鼠,提取主要组织器官的miRNA 并使用RT?PCR检测其miR?31的表达量?同时对比阳性小鼠和野生型小鼠神经系统中Nestin的表达和神经干细胞的数量?结果成功构建了miR?31 过表达转基因小鼠,并在屏障环境下饲养繁殖至14代以上?各主要组织器官miR?31的表达均升高且稳定表达?阳性小鼠Nestin 的表达和神经干细胞数量均高于野生型小鼠?结论通过使用Gateway cloning技术成功构建了miR?31 过表达转基因小鼠,且在各代小鼠中miR?31的表达稳定,神经系统内的神经干细胞数量多于野生型小鼠,可为进一步研究miR?31过表达后在体内的功能和神经系统疾病的治疗提供良好的工具小鼠?     

小鼠同种异体内皮祖细胞移植治疗急性肺损伤的相关研究

目的：观察外源性内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）移植对急性肺损伤（Au）小鼠受损肺组织的保护作用并探讨其机制。方法：选用转基因EGFP-BALB／c小鼠作为细胞移植供体,获得骨髓单核细胞,体外培养扩增获得足够数量的表达绿色荧光蛋白的EPCs（EGFP-EPCs）。选用野生型BALB／c小鼠18只,随机分为假手术组、AU组及EPC治疗组,每组6只。假手术组气管内滴注PBS,其后经尾静脉注射PBS;Au组气管内滴注脂多糖溶液,其后经尾静脉注射PBS;EPC治疗组气管内滴注LPS,其后经尾静脉注射EGFP-EPCs。各组小鼠术后3d处死,留取肺组织标本。荧光显微镜下观察各组肺组织中EGFP-EPCs表达情况,HE染色评价各组肺组织损伤程度并进行肺损伤指数评分,比较各组肺组织湿干重比,行肺组织CD34免疫组化染色并测定肺微血管密度（MVD）。结果：各组小鼠建模过程顺利,无围手术期死亡。EPC治疗组小鼠肺组织冰冻切片中可观察到均匀附着于血管内皮的绿色荧光表达,而假手术组及ALI组则未见明显的绿色荧光。HE切片显示：LPS可致严重的肺组织损伤,而EPC治疗组肺损伤程度较AU组明显减轻,肺损伤指数明显低于ALI对照组（P〈0．001）。肺组织湿干重比Au组明显高于假手术组（P〈0．001）,而EPC治疗组较ALI组明显降低（P〈0．05）。免疫组化染色显示：EPC治疗组肺组织切片中CD34的表达明显增加,MVD值均明显高于假手术组及ALI组（P〈0．001）。结论：对ALI小鼠行外源性EPC移植治疗,输入体内的EPC可定向迁移并黏附于受损的肺毛细血管内皮,直接参与肺毛细血管内皮修复及重建,维持肺毛细血管内皮完整性,减少炎症细胞向肺间质、肺泡内的浸润及对肺组织的炎性损伤。同时,外源性EPC治疗提高了EPC向受损肺组织归巢及受损肺组织内的血管新生。     

肺移植后闭塞性细支气管炎大鼠模型建立及其miRNA表达谱分析

目的 探索建立大鼠原位气管移植模拟肺移植后闭塞性细支气管炎（obliterative bronchiolitis,OB）的病理生理过程,为研究肺移植后OB中microRNA （miRNA）表达谱分析提供理想的动物模型.方法 通过近交系大鼠原位气管移植,建立模拟肺移植后发生OB的动物模型.模型成功后使用HE染色对气管移植模型进行评估;提取移植气管组织进行microarray芯片检测,同时应用实时定量RT-PCR（RT-qPCR）验证miRNAs芯片结果的可靠性.结果 成功建立了大鼠原位气管移植的模型26/30例（成功率为86.67％）;术后4周移植气管病理检查提示“移植气管炎症细胞浸润和纤维组织增生”,模型OB的发生率为100％.miRNA芯片筛选出移植气管OB组织中表达上调15个和下调14个;验证其中显著上调miR-146a、miR-155和显著下调miR-451结果与检测结果具有较好的一致性.结论 原位气管移植能够稳定形成模拟肺移植后OB的气道阻塞性病变,可适用于肺移植后OB的miRNA表达谱分析研究的动物模型.     

微小 RNA -7 过表达对人肺癌细胞体内外转移的影响简

目的 探讨过表达miR-7对人肺癌细胞体内外转移的影响.方法 将真核表达载体pcDNA3.1（-）-pri-miR-7（命名为p-miR-7）体外瞬时转染人肺癌95D细胞后,划痕法检测细胞的体外迁移情况;侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变;建立人肺癌裸鼠体内转移模型,HE染色观察过表达miR-7对肺部肿瘤转移的影响;免疫荧光技术检测肿瘤转移相关蛋白Sema4C蛋白的表达.结果 过表达miR-7可显著抑制人肺癌细胞的体外迁移和侵袭能力（P＜0.05）;与对照组相比,过表达miR-7组未观察到明显的肺部肿瘤细胞转移灶（P＜0.05）;免疫荧光结果显示,过表达miR-7组中,肿瘤细胞内Sema4C蛋白表达量显著降低（P＜0.05）.结论 过表达miR-7可以显著抑制人肺癌细胞体外及体内的转移能力,提示miR-7有望成为肺癌后续基因治疗的新靶点.     

胃癌组织中微小RNA表达水平的定量分析及其意义

目的 了解胃癌组织中微小RNA-421的表达水平及其临床意义.方法 收集41例胃癌组织和12例癌旁组织,提取RNA,用实时定量RT-PCR方法检测微小RNA-421的表达水平,然后分析其表达水平与临床因素的关系.结果 微小RNA-421高表达于70.85%（32/41）的胃癌组织中,它的表达水平与临床病理因素无相关性.结论 微小RNA-421可能参与了胃癌发生的起始过程.     

miR-7在肾癌中的表达及临床意义研究

目的检测肾细胞癌组织及相应癌旁正常组织中miR-7的表达,分析18达与临床病理特征之间的关系,为进一步研究miR-7在肾癌的发生发展中作用奠定基础。方法收集48例经手术切除的配对肾癌及癌旁组织标本,提取组织中总RNA,经逆转录获得cDNA,采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法检测标本中miR-7表达量,并通过统计学软件分析其表达量与患者临床病理特征之间的相关性。结果与相应癌旁组织相比,肾癌组织中miR-7表达量明显升高,其中34例（70.8%）肾癌标本miR-7表达上调,14例（29.2%）表达下调,差异有统计学意义（P〈0.05）。肾细胞癌中miR-7表达上调与患者年龄、性别、肾癌组织类型、TNM分期、AJCC临床分期无相关性（P〉0.05）。结论 miR-7在肾癌组织中明显高表达,提示其可能与肾癌的发生和发展相关,可能成为肾癌早期诊断、治疗乃至预后判断的新的生物标记物。     

用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠

目的 研究曲线精管微注射法建立转基因小鼠的可行性。方法 选取人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白（pCMV－EGFP）表达载体，应用体视解剖镜和显微注射仪将不同剂量的被脂质体包裹的质料DNA注射到不同年龄的KM小鼠曲细精管内。在注射后40d左右，雄鼠与雌鼠合笼交配；分娩后3周，剪取仔鼠尾，提取基因组DNA，应用PCR、Southern blotting技术进行整合检测。处死2只首建小鼠，荧光显微镜观察组织冰冻切片中EGFP的表达。结果 共注射41只雄性小鼠，存活34只，其中32只具有交配、受精能力，获得仔鼠382只。仔鼠经检测，PCR阳性133只，织冰冻切片中EGFP明显表达。结论 曲细精管微注射法是动物基因转移的一条简便可行的新途径。     

GC-C-/-小鼠在DSS诱导下肠道炎症损伤的变化

  目的  了解鸟苷酸环化酶C（GC-C）信号通路在右旋糖酐硫酸酯钠（DSS）诱导小鼠肠道炎症性损伤发生中的作用。  方法  运用DSS构建GC-C基因敲除（GC-C-/-）小鼠和野生型（WT）小鼠结肠炎模型,将小鼠分为炎症组和对照组,前者给予3%的DSS溶液自由饮用1周,后者给予正常饮食。运用qRT-PCR和Westernblot方法检测结肠组织GC-C mRNA和蛋白的表达,在光学显微镜下观察经HE染色后结肠组织的炎症损伤情况并进行组织病理学评分。运用ELISA方法检测小鼠外周血与肠黏液中炎症因子（IL-8和TNF-α）的水平。  结果  （1）与WT小鼠相比,GC-C-/-小鼠在DSS作用下疾病活动指数（DAI）评分明显升高（P < 0.05）, 结肠缩短、肠管增粗、充血水肿更明显;（2）显微镜下观察到GC-C-/-+DSS组小鼠结肠组织炎症损伤更为严重,组织病理学评分较WT+DSS组小鼠明显升高（P < 0.05）;（3）GC-C-/-小鼠在DSS诱导下外周血和肠粘液中IL-8和TNF-α水平较WT+DSS组明显升高（P < 0.05）。  结论  GC-C-/-小鼠在化学物质诱导下肠道炎症性损伤加重,GC-C信号通路可能参与了溃疡性结肠炎（UC）的发生与发展。