阿司匹林引起胰腺癌细胞株SW1990对吉西他滨耐药及其机制研究

目的探讨阿司匹林是否引起胰腺癌细胞株SW1990对吉西他滨耐药及其可能机制。方法通过四氮唑蓝(MTT)和HOCHEST33258染色方法检测药物对人胰腺癌耐药株SW1990细胞的生长情况以及凋亡的影响;并应用蛋白免疫印迹方法检测细胞信号通路PI3K/AKT的变化。结果阿司匹林能明显降低吉西他滨对细胞的抑制率并提高IC50。0.4μmol/L吉西他滨干预细胞后,凋亡率达56%,明显高于吉西他滨与阿司匹林合用时细胞的凋亡率(28%,P<0.01)。磷酸化AKT和PI3K水平明显增高。PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002能明显逆转阿司匹林引起的SW1990细胞耐受吉西他滨的现象。结论阿司匹林通过激活PI3K/AKT信号通路引起胰腺癌细胞株SW1990对吉西他滨耐药。     

吉西他滨诱导胰腺癌细胞株SW1990的耐药作用与硫氧还蛋白还原酶活性的改变

目的建立对吉西他宾耐药的胰腺癌细胞株,探讨硫氧还蛋白还原酶(TrxR)在耐药过程中的作用.方法采用间歇浓度递增法诱导胰腺癌细胞株SW1990对吉西他宾耐药,检测其生物学性状变化,并对比观察TrxR活性变化.结果药物培养9个月后,得到稳定传代的SW1990/GZ耐药细胞株;其形态学、生长特征等均发生了明显变化,细胞变圆、体积缩小、内质网扩张、颗粒样物质增多及细胞倍增时间延长;对吉西他滨、5-氟尿嘧啶、阿霉素和丝裂霉素的耐药性均显著增加;耐药细胞的TrxR活性也明显增高.结论SW1990/GZ有多药耐药现象,TrxR在耐药过程中起一定作用.     

人胰腺癌干细胞对吉西他滨的敏感性及其分子机制研究

目的 检测人胰腺癌干细胞对吉西他滨的敏感性,分析其差异性基因的表达,初步阐明其耐药分子机制.方法 运用流式技术从人原代胰腺癌和细胞系SW1990中分选CD24+CD44+ESA+细胞,行NOD/SCID鼠移植瘤实验验证其肿瘤干细胞特性;运用吉西他滨进行体内、外干预,检测胰腺癌干细胞凋亡和表达率变化情况.采用人类全基因组表达谱Affymetrix U133 plus2.0芯片对胰腺癌干细胞和非干细胞进行差异基因筛选.结果 人原代胰腺癌和细胞系SW1990中分选到CD24+CD44+ESA+(0.8%)和CD24+CD44+(3.6%)细胞,移植瘤实验证实其为胰腺癌干细胞.肿瘤干细胞凋亡率及表达率检测提示胰腺癌干细胞对吉西他滨显著耐药.与胰腺癌非干细胞比对,基因表达谱芯片筛查到胰腺癌干细胞820条差异基因,其中上调表达281个,下调表达539个.结论 胰腺癌干细胞对吉西他滨耐药,具有特征性基因表达谱,为阐明胰腺癌多药耐药机制及靶向治疗奠定基础.     

小分子干扰RNA沉默Notch1后增加胰腺癌细胞凋亡活性而提高吉西他滨化疗敏感性

目的：探讨应用小分子干扰RNA（siRNA）沉默Notch1信号通路对胰腺癌吉西他滨化疗敏感性的影响及其可能机制。方法：Notch1 siRNA转染AsPC 1、BxPC 3、MIAPaCa 2 和Panc 1这4种胰腺癌细胞株。实时PCR检测胰腺癌细胞株Notch1受体相对表达量;应用Notch1 siRNA转染后,CCK 8法计算吉西他滨（10 μmol/L）作用时细胞抑制率,蛋白质印迹法检测促凋亡蛋白Bax表达水平,CaspACETM比色法检测caspase 3活性。结果：4株胰腺癌细胞中BxPC 1 Notch1受体相对表达量最高,Panc 1最低。Notch1 siRNA转染组吉西他滨作用抑制率较对照siRNA转染组明显增高,同时伴随促凋亡蛋白Bax表达上调,caspase 3活性明显增高（均P<005）。结论：应用siRNA降低Notch1信号通路活性可通过激活凋亡活性而增加胰腺癌吉西他滨化疗敏感性。     

塞来昔布对胰腺癌细胞株SW1990增殖及干性标记物CD133表达的影响

目的观察环氧合酶-2(COX-2)选择性抑制剂塞来昔布对胰腺癌细胞株SW1990增殖及肿瘤干细胞标记物CD133表达的影响。方法取对数生长期的SW1990细胞,分别加入不同浓度的单药吉西他滨、单药塞来昔布、塞来昔布联合吉西他滨进行培养,观察SW1990细胞增殖抑制情况及CD133mRNA、表面分子CD133表达变化。结果不同浓度塞来昔布与吉西他滨(0.500μmol/L)联合应用,对SW1990细胞的增殖抑制作用更为明显,与0.500μmol/L吉西他滨组比较,差异均有显著性(F=339.28～967.22,q=4.48～36.76,P<0.05),与对应剂量的塞来昔布组比较,差异亦均有显著性(q=16.24～66.23,P<0.05)。不同浓度塞来昔布组胰腺癌细胞株SW1990CD133mRNA的表达较对照组明显下调(F=51.84～625.80,q=14.39～45.03,P<0.05),联合应用塞来昔布与吉西他滨(0.500μmol/L)时,其下调作用较各浓度单药塞来昔布减弱,差异有显著性(q=2.85～7.75,P<0.05)。结论塞来昔布对胰腺癌细胞株SW1990的增殖有抑制作用,且与吉西他滨有协同作用;塞来昔布可显著下调SW1990细胞株干细胞表面标记物CD133mRNA的表达。     

普伐他汀对人胰腺癌细胞SW1990的影响及其协同吉西他滨的抑瘤作用

目的研究普伐他汀(pravastatin,Pra)对人胰腺癌细胞SW1990增殖和凋亡的影响及其联合吉西他滨(gemcitabine,GEM)对该细胞的作用。方法MTT比色法测定普伐他汀对SW1990细胞生长的抑制作用。不同浓度普伐他汀处理细胞48 h后,流式细胞仪测定细胞凋亡率,光学显微镜下观察细胞形态学改变。吉西他滨、普伐他汀联合吉西他滨作用细胞48 h,MTT法测定各处理组的OD值,并计算相互作用指数。结果 MTT比色法显示普伐他汀对SW1990细胞具有抑制增殖的作用,5、15、25μmol/L普伐他汀处理SW1990细胞后,SW1990细胞出现典型的形态学改变,且凋亡百分率随浓度增大而逐渐增加。普伐他汀联合吉西他滨作用细胞后,GEM的IC50值降低。结论普伐他汀具有抑制胰腺癌细胞SW1990增殖和诱导该细胞凋亡的作用,普伐他汀联合吉西他滨对SW1990细胞具有协同抗瘤作用。     

ERK通路参与调控胰腺癌细胞吉西他滨化疗抵抗

目的检测ERK蛋白在胰腺癌细胞株产生吉西他滨(GEM)化疗抵抗前后的表达,分析ERK通路在化疗抵抗中的作用。方法通过浓度梯度递增诱导法建立对不同浓度吉西他滨化疗抵抗的胰腺癌细胞株模型;应用免疫组化检测各个化疗抵抗浓度细胞株ERK的表达;使用ERK通路阻断剂和激活剂分别作用于化疗抵抗最低和最高浓度,再检测ERK的表达;运用MTT法检测各因素对细胞耐药的影响,计算IC50值。结果经过吉西他滨化疗诱导后,ERK的表达随着化疗抵抗浓度的增加而升高;ERK通路特异性阻断剂作用于最低及最高浓度的化疗抵抗细胞株后,ERK蛋白的表达降低,细胞的1C50值降低,细胞对化疗药物的敏感性增强;ERK通路激活剂作用后,ERK蛋白的表达增强,细胞的IC50值升高,细胞对化疗药物的敏感性增强。结论 ERK通路参与调控胰腺癌细胞吉西他滨化疗抵抗。     

吉西他滨耐药的胰腺癌SW1990细胞株的建立及相关特性检测

目的：探讨对吉西他滨( GEM )耐药的胰腺癌SW1990细胞诱导方法,以期进一步认识胰腺癌耐药的发生机制,并对诱导的GEM耐药的胰腺癌细胞与其亲本细胞的生物学特性进行比较。方法采用逐步浓度递增法诱导对GEM耐药的细胞株 SW1990-GZ。 MTT 法检测 SW1990和SW1990-GZ 的半数致死量(IC50)、耐药系数(R),并观察其生长差异。采用高效液相色谱法( HPLC)检测不同时间点SW1990和 SW1990-GZ 对 GEM 药物的摄取情况。结果SW1990和SW1990-GZ的IC50为(0．07±0．0021)、(87．50±3．2400)μg/ml,R=1250;在不同浓度GEM作用下,诱导后耐药的SW1990-GZ对GEM的敏感性明显降低。细胞生长曲线显示耐药细胞 SW1990-GZ相对于 SW1990生长缓慢。不同时间点GEM孵育后,SW1990-GZ细胞对GEM药物的摄取较SW1990细胞降低。结论成功诱导了耐GEM药物的SW1990-GZ细胞株,耐药性能稳定、明显。 SW1990-GZ细胞可能存在着一定的机制使得细胞摄取GEM降低。     

耐吉西他滨胰腺癌细胞株SW1990/GZ上皮间质转化现象的研究

目的:观察耐吉西他滨胰腺癌细胞株(SW1990/GZ)上皮间质转化的现象?方法:倒置显微镜下观察亲代SW1990细胞与SW1990/GZ细胞的形态差别;流式细胞仪检测细胞周期;免疫印迹法(Western blot)检测上皮间质转化相关蛋白表达;Transwell小室测定细胞侵袭迁移能力;通过表面特异抗原(CD44+?CD24+和CD133+)标记流式细胞仪检测肿瘤干细胞比例?结果:在形态学上,SW1990/GZ表现出明显的间质细胞特征,与亲代SW1990相比处于G1期的细胞无明显差异;SW1990/GZ细胞低表达上皮细胞标志物E-cadherin,而高表达间质细胞的标记物Vimentin;SW1990/GZ细胞侵袭和迁移能力明显增强(P < 0.01);与亲代细胞SW1990相比,SW1990/GZ细胞中CD44+CD24+细胞比例以及CD133+细胞比例分别提高了2倍和4倍以上(P < 0.01)?结论:SW1990耐吉西他滨细胞株(SW1990/GZ)发生了明显的上皮间质转化过程,肿瘤干细胞比例明显增多?     

CEACAM6介导上皮间质转化增强胰腺癌细胞侵袭能力和耐药性的研究

目的:研究CEACAM6对胰腺癌细胞株SW1990侵袭能力和耐药性的影响,并探讨上皮间质转化(EMT)在其中的作用?方法:筛选及鉴定过表达CEACAM6的稳定转染SW1990-CEACAM6细胞株,通过定量PCR和Western blot方法检测SW1990细胞株中EMT相关表型标志物的改变?通过Transwell实验检测过表达CEACAM6对SW1990细胞株侵袭的影响,MTT法检测耐药指数(RI)?结果:定量PCR及Western blot验证过表达CEACAM6细胞株SW1990-CEACAM6成功建立,其倾向于向间质细胞转化:波形蛋白(Vimentin)表达明显上调,E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达下降?功能实验证实过表达CEACAM6具有促进SW1990胰腺癌细胞株侵袭作用,同时细胞株耐药性增强?结论:CEACAM6能够促进SW1990胰腺癌细胞株上皮间质转化,从而促进胰腺癌细胞的恶性转化?     

3-methyladenine抑制自噬诱导胰腺癌细胞SW1990失巢凋亡

【目的】 探讨3-methyladenine(3-MA)对人胰腺癌SW1990细胞增殖?迁移及失巢凋亡的影响作用及其机制?【方法】 以胰腺癌细胞SW1990及永生化胰腺导管上皮细胞H6C7为研究对象,设3-MA处理组及PBS对照组,采用软琼脂克隆培养法及Poly-HEMA悬浮培养法筛选抵抗失巢凋亡的细胞?Annexin V-FITC/PI双染和TUNEL试剂盒法检测细胞凋亡;免疫荧光法及透射电镜检测细胞自噬;CCK-8法检测细胞增殖; Transwell小室检测细胞迁移能力?【结果】永生化胰腺导管上皮细胞H6C7处理组及对照组均无集落形成,胰腺癌细胞SW1990处理组形成(2.3 ± 2.63)个集落,对照组形成(9 ± 3)个,与H6C7 相比,SW1990具有较强的抵抗失巢凋亡的能力 (P < 0.05)?3-MA可抑制胰腺癌SW1990细胞自噬(P < 0.05)并抑制其增殖及迁移能力(P < 0.01)且诱导失巢凋亡(P < 0.01)?【结论】 3-MA可诱导胰腺癌细胞SW1990失巢凋亡,其机制可能与细胞自噬受抑有关?     

胰腺癌耐药细胞株SW1990/FU的建立、鉴定及生物学特性

目的建立胰腺癌耐药细胞株,鉴定并分析耐药细胞株的生物学特性.方法选择人胰腺癌细胞株SW1990,采用5-氟尿嘧啶(5-FU)浓度梯度递增法建立胰腺癌耐药细胞株SW1990/FU;电镜观察超微结构;染色体核型分析对比耐药和亲本细胞株在遗传学上的变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线,计算倍增时间;流式细胞仪(FACS)测定细胞周期;MTT法计算4种药物的耐药指数(RI);酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肿瘤标记物CEA和CA19-9浓度;BHLB/c-m裸鼠种植瘤实验观察肿瘤形成的时间和大小.结果胰腺癌耐药细胞株具有特殊的形态学变化,明显区别于亲本细胞.染色体核型分析显示,SW1990/FU具有特异的18号染色体四倍体核型.与亲本细胞株相比,SW1990/FU生长缓慢(P＜0.05),倍增时间延长(P＜0.05),大部分肿瘤细胞集中在G0-G1期.MTT结果表明,SW1990/FU对5-FU、阿霉素(ADM)、丝裂霉素(MMC)和吉西他滨(GEM)的耐药指数分别为132.7、3.2、1.5和4.7.ELISA实验表明,在细胞数和培养时间相同的条件下,SW1990/FU分泌的CEA和CA19-9明显高于SW1990(P＜0.05).裸鼠种植瘤实验显示,第4周时耐药细胞株肿瘤直径为(1.5±0.30)cm,明显高于亲本细胞株的(0.8±0.15)cm(P＜0.05).结论5-FU浓度梯度递增法诱导建立的胰腺癌耐药细胞株具有独特的形态学、生物学及遗传学特点.SW1990/FU的建立可作为体外细胞实验模型用于探索在胰腺癌化疗中产生获得性耐药的机制,并为寻找克服肿瘤耐药的方法提供实验基础.     

塞来昔布与吉西他滨合用对胰腺癌的抑制作用及其机制

目的探讨环氧合酶2(COX2)选择性抑制剂塞来昔布和吉西他滨抑制胰腺癌生长的影响及其机制。方法观察塞来昔布与吉西他滨联合作用对裸鼠SW1990胰腺癌细胞移植瘤生长的影响,并与两者单独应用作比较,免疫组织化学染色观察肿瘤组织增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白D1表达的变化;四唑蓝法、克隆形成试验观察塞来昔布和吉西他滨体外对SW1990细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期变化;Western印迹检测细胞周期蛋白D1、A和B1表达的变化。结果药物作用于裸鼠移植瘤32d后,对照组、吉西他滨组、塞来昔布组和联合组肿瘤体积分别为(2.31±0.41)cm3、(0.41±0.12)cm3、(1.56±0.17)cm3、(0.05±0.04)cm3,塞来昔布和吉西他滨联合可明显抑制胰腺癌移植瘤的生长,对照组PCNA、细胞周期蛋白D1呈强阳性表达,吉西他滨组PCNA、细胞周期蛋白D1阳性细胞数明显减少,塞来昔布组PCNA阳性细胞数较对照组略有减少,细胞周期蛋白D1阳性细胞数则无明显减少,而联合组中PCNA、细胞周期蛋白D1阳性细胞数较前3组明显减少。塞来昔布和吉西他滨剂量依赖性抑制SW1990细胞增殖,两药联合应用,对细胞增殖的抑制有增强作用。药物作用24h或72h后,塞来昔布组和联合组凋亡细胞数较对照组及吉西他滨组明显增加(P<0.05)。药物作用24h后,塞来昔布组和联合组G0/G1期细胞比例明显增加,G2/M期细胞明显减少,吉西他滨组G0/G1期细胞明显减少,而S期和G2/M期细胞明显增加,药物作用72h后,塞来昔布组和联合组G0/G1期细胞进一步增加,S期细胞明显减少,G2/M期细胞进一步减少,而联合组在作用24h和72h,G2/M期细胞比例均为0。细胞周期素的表达与细胞周期的分布相一致。结论COX2选择性抑制剂塞来昔布可增强吉西他滨对胰腺癌增殖的抑制作用,其机制可能部分通过调节细胞周期素的表达,诱导细胞周期阻滞和胰腺癌细胞凋亡而实现的。     

Drug resistance and activity changes of thioredoxin reductase in pancreatic cancer cells strain SW1990 induced by gemcitabine

OBJECTIVE: To establish gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell strain and study the role of thioredoxin reductase (TrxR) in drug-resistant process. METHODS: Gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell strain SW1990/GZ was induced by increasing drug dosage intermittently, then the changes of its biological features and the activity of TrxR were examined. RESULTS: Stable drug-resistant SW1990/GZ cell strain was established by culturing with gemcitabine for 9 months. The morphology and growth characteristics of the cell strain changed remarkably. The cells shrunk and became rounder; its endoplasm expanded; granular substances increased; and the doubling-time was prolonged. Resistance of the cell line to gemcitabine, fluorouracil, adriamycin, and mitomycin significantly increased. The TrxR activity of the drug-resistant cells was increased markedly. CONCLUSION: SW1990/GZ has certain multidrug resistance to some chemotherapy drugs, and TrxR plays a role in the drug-resistant process.     

靶向壳聚糖新型纳米药物体外抗胰腺癌细胞的实验研究

目的 合成靶向表皮生长因子受体（EGFR）壳聚糖吉西他滨纳米粒,研究其在体外胰腺癌细胞的靶向性及对细胞增殖的影响。方法 采用壳聚糖制备EGFR-吉西他滨-壳聚糖纳米粒（G-GC-Dox）、吉西他滨-壳聚糖纳米粒（GC-Dox）。在体外实验研究中将药物作用于EGFR+胰腺癌细胞系SW1990细胞,研究胰腺癌细胞体外摄取实验,并采用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）法观察该体系对胰腺癌SWl990细胞生长增殖的影响。结果 EGFR-吉西他滨-壳聚糖纳米粒组体外SW1990胰腺癌细胞平均摄取纳米药物的量明显强于同一时间点吉西他滨-壳聚糖纳米粒组平均摄取纳米药物的量。G-GC-Dox组处理12、24、48h后细胞存活率（43.14%±2.51%、31.21%±2.37%、18.26%±2.75%）对比GC-Dox组（64.22%±3.11%、45.43%±3.04%、35.23%±3.15%）对肿瘤细胞具有更好的抑制作用（P<0.05）。结论 本实验成功研制了靶向EGFR壳聚糖吉西他滨纳米粒,并证实了该纳米粒能提高药物在体外胰腺癌细胞的靶向性,同时对胰腺癌SW1990细胞增殖具有明显抑制作用,可能为将来靶向治疗胰腺癌提供新的研究思路。     

Assessment of pancreatic carcinoma cell chemosensitivity using a three-dimensional culture system

Background Monolayer cell culture models are the traditional culture models used for in vitro research of pancreatic carcinoma chemosensitivity. However, these models neglect the interactions between tumor cells and the impact of the tumor microenvironment. Such tumor cell monolayers poorly mimic the solid tumor microenvironment. The present study aimed to investigate the chemosensitivity characteristics of pancreatic cancer cells in a three-dimensional culture system by analyzing the differences in drug sensitivity between a scattered cell culture model and a multicellular spheroid culture model. Methods Three pancreatic cancer cell lines （SW1990, ASPC-1 and PCT-3） were cultured in three-dimensional collagen gels as well as in traditional two-dimensional monolayers. The chemosensitivities of the pancreatic carcinoma cells to 5-fluorouracil （5-FU）, gemcitabine, and oxaliplatin in vitro were detected by both the Cell Counting Kit-8 test and the collagen gel droplet-embedded culture drug-sensitivity test. Results In the two-dimensional culture model, differences in the chemosensitivities of the cloned pancreatic carcinoma cells and scattered cells existed for some concentrations of 5-FU, gemcitabine and oxaliplatin. In the three-dimensional culture model, there were significant differences in the chemosensitivities of the pancreatic cancer cells between the scattered cells and multicellular spheroids （P 〈0.05）. Conclusion Pancreatic carcinoma cells exhibit multicellular resistance in three-dimensional cultures.     

长链非编码RNA H19对胰腺癌细胞增殖、侵袭及转移的影响

目的: 探讨下调长链非编码RNA H19的表达对胰腺癌SW1990细胞增殖、侵袭转移能力的影响。方法: 从4种胰腺癌细胞Patu8988、SW1990、Bxpc3、Panc-1中筛选出H19高表达株与低表达株。对高表达H19的SW1990细胞株瞬时转染H19 siRNA(实验组),同时转染阴性siRNA作为对照组。采用qRT-PCR检测转染效率;CCK-8法检测细胞增殖活性;平板克隆法检测细胞克隆形成能力;Transwell试验检测细胞迁移和侵袭的变化;蛋白质印迹法检测细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达。结果： 与对照组相比,实验组H19 mRNA表达明显降低(P<0.05),细胞相对增殖率无变化(P>0.05),但细胞克隆形成数、细胞侵袭及转移能力明显提高,ZEB1 mRNA表达增加,但mir-200家族的表达无明显变化(P>0.05),ZEB1、Snail及PCNA蛋白表达增加,Bcl/Bax比值升高(P均<0.05)。结论： 下调H19表达可提高细胞克隆形成能力,促进细胞侵袭转移。