Bcl-2shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用分子克隆技术,针对人bcl-2目的基因设计3个siRNA靶点和一个阴性对照序列,构建4对shRNA重组慢病毒表达载体,并进行测序验证鉴定。方法:以设计的有效靶序列进行引物合成,将单链引物退火成双链oligo序列,连接入经Age I和EcoR I双酶切线性化的慢病毒RNA干扰载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性转化子,采用PCR扩增和DNA测序分别鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳后阳性克隆得到335bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含有设计合成序列。结论:成功构建4对bcl-2shRNA重组慢病毒表达载体,为研究靶向bcl-2 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

人NHE-1基因miRNA干扰载体构建、鉴定及干扰效应评价

目的构建人钠氢交换蛋白-1（NHE-1）基因的miRNA特异性干扰表达载体并转染293细胞,筛选其有效性。方法设计4对miRNA oligo,依次通过退火、连接,构建含NHE-1前体miRNA的重组干扰质粒pcDNATM 6.2-GW/NHE-miR和阴性对照质粒pcDNATM 6.2-GW/neg-miR,并转染293细胞,经Re-al-Time PCR评价干扰效应,筛选出干扰效应最佳的靶序列。结果测序证实目的片段正确插入载体中,成功构建4个人NHE-1基因miRNA干扰载体;Real-Time PCR证实完成干扰效应评价,并根据NHE-1基因转录调控区及其蛋白分子结构功能区评价结果,得到NHE1-4是最佳干扰片段。结论成功构建针对人NHE-1基因的miRNA特异性有效干扰质粒,为后续NHE-1基因腺病毒miRNA表达载体的构建及其在调控APP裂解相关酶类的功能研究奠定了基础。     

RAGE、NF-κB反义RNA单/双基因共表达载体的构建及序列测定

目的构建晚期糖化终产物受体(RAGE)、核因子-κB(NF-κB)反义RNA单／双基因共表达载体。方法从人脐静脉内皮细胞ECV304中提取总RNA,RT-PCR扩增RAGE基因片段；从糖尿病人外周血单核细胞提取总RNA,RT-PCR扩增NF-κB p65基因片段。分别克隆入PGEM-T载体，酶切鉴定阳性克隆。再经PCR反应获得多量的RAGE，NF-κB基因片段。反向插入双启动子真核表达载体pBud CE4．1。构建RAGE、NF-κB反义RNA单／双基因共表达载体。结果RT-PCR扩增出RAGE基因片段328bp，扩增出NF-κB p65基因片段364bp。测序分析证实目的基因片段正确反向插入3个重组载体。结论RAGE、NF-κB反义RNA单／双基因共表达载体构建成功。     

NF-κB基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建转录因子NF-κB的RNA干扰(RNAi)质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路及以其为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi质粒。方法设计针对NF-κB的shRNA特异性序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer 1.0-U6表达载体,EcoRⅠ和ApaⅠ双酶切及DNA测序鉴定重组克隆;脂质体转染RNAi重组载体至前列腺癌细胞PC-3后,Western blot分析各组NF-κB蛋白表达水平。结果双酶切和DNA测序证实shRNA正确插入pSilencer 1.0-U6质粒;Western blot结果显示与空质粒对照组比较NF-κB转染组细胞NF-κB表达明显下调。结论成功构建人NF-κB基因RNAi质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路提供了稳定转染细胞的干扰质粒,为靶向NF-κB的基因治疗提供了有力工具。     

Survivin基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和测序

目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以survivin为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定. 方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer3.1-H1-hygro中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定. 结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列. 结论:Survivin靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,可利用所得的小RNA序列干扰survivin基因的mRNA转录,供抗肿瘤研究参考.     

重组腺病毒介导siRNA抑制大鼠肝细胞NF-κB p65的表达

目的构建重组腺病毒Ad-NF-κB p65-siRNA，并观察其抑制大鼠肝细胞NF-κB p65表达的效果。方法（1）筛选针对大鼠NF-κB p65特异性siRNA靶序列，设计合成其对应的双链DNA，插入到pShuttle—H1中，得到psiRNA—NF-κB p65质粒。将构建好的psiRNA—NF-κB p65质粒与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行重组，酶切鉴定、293A细胞包装、扩增，得到重组腺病毒Ad—NF-κB p65-siRNA。（2）将构建好的Ad—NF-κB p65-siRNA转染大鼠肝细胞株BRL，48h后，采用RT-PCR和Western blot检测NF-κB p65表达。结果成功地构建了重组腺病毒Ad—NF-κB p65-siRNA；Ad—NF-κB p65-siRNA转染大鼠肝细胞48h后，NF—κB的mRNA水平下降了81％，细胞内的NF—κB蛋白浓度下降了71％。结论腺病毒介导的RNAi技术体外显著地抑制大鼠肝细胞NF-κB p65的表达。     

人可溶性TRAIL cDNA的设计、合成与克隆

目的:合成可溶性的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的cDNA,并构建其原核表达载体.方法:根据大肠杆菌密码子偏好性和表达载体多克隆位点限制性内切酶要求,设计基因拼接引物,合成TRAIL基因胞膜外段双链cDNA序列,将其连接于克隆载体pMD18-T中;将酶切、纯化的TRAIL基因与经相同处理的载体PSC相连接,转化感受态大肠杆菌JM109,筛选阳性重组子.结果:成功获得了包含TRAIL基因胞膜外段的双链cDNA序列,并成功构建了TRAIL胞膜外段原核表达载体PSC/TRAIL 111-281.结论:采用PCR的方法,实现合成寡核苷酸片段的一次性组装,方便了进一步的克隆.     

DNMT1靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

目的:本研究利用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术,以DNMT1(DNAmethyltransferase 1)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础.方法:设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体,转化JM109菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列.结论:DNMT1靶向RNA干扰重组体的成功构建和序列分析,可进一步利用克隆所得的小RNA序列干扰DNMT1的mRNA转录,从而达到治疗肿瘤的目的.     

NF-κB基因RNA干扰载体的构建

目的:构建核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)基因的RNA干扰载体,观察其抑制NF-κB蛋白的效率.方法:分别构建大鼠NF-κB基因的pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-NF-κB重组真核表达载体和pSilencer 1.0-U6-siRNA-NF-κB重组载体,用两种重组载体转染COS-7细胞,在荧光倒置显微镜下观察大鼠NF-κB-绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western免疫印迹方法检测.结果:荧光倒置显微镜观察及Western免疫印迹检测结果均显示随着pSilencer 1.0-U6-siRNA-NF-κB重组载体浓度的增加,NF-κB-绿色荧光融合蛋白表达量逐渐减少.结论:成功构建NF-κB基因的RNA干扰载体.     

人组织因子基因RNA干扰载体的构建与鉴定

目的 构建人组织因子基因RNA干扰载体,为达到阻止凝血过程的启动打下基础.方法 利用Invitrogen公司在线软件设计人组织因子基因(NM 001993)干扰片段,合成shRNA序列,再制备双链寡核苷酸(ds oligo),退火后形成的ds oligo双链克隆到pENTRTM/U6载体的粘性末端,连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒DNA小提、测序.将构建的载体转染到脐静脉内皮细胞,应用RT-PCR和免疫荧光验证载体对目的基因的干扰情况.结果 测序证实阳性克隆为pENTRTM/U6-TF-shRNA,转染到脐静脉内皮细胞后组织因子的表达受到明显抑制.结论 成功构建出凝血途径的人组织因子基因RNA干扰载体,为研究组织因子基因RNA干扰载体在凝血疾病中的应用提供了稳定的转染细胞载体.     

人上皮细胞黏附分子shRNA表达载体的构建及鉴定

目的以人上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,Ep CAM)基因为靶基因,构建shRNA重组表达载体。方法根据Gen Bank中Ep CAM序列(BC014785.1)的mRNA设计4组shRNA序列,插入p SGU6/GFP/Neo载体,构建重组载体,转化至Top10感受态细胞,经卡那霉素筛选并挑取阳性克隆,进行PCR鉴定及DNA测序分析。结果 PCR鉴定及DNA测序结果显示重组载体Ep CAM-p SGU6/GFP/Neo-shRNA构建成功。结论成功构建了干扰人Ep CAM基因的重组表达载体,为研究Ep CAM分子的生物学功能打下基础。     

核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.     

针对MTA1基因siRNA载体构建和沉默效应

目的 构建针对人MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,观察RNA干扰对食管癌细胞MTA1基因表达的抑制作用.方法 设计MTA1的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后重组入pRNAT-U6.2载体,转化扩增后进行序列测定.用脂质体包裹转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR和Western blotting分别检测MTA1基因mRNA和蛋白表达的变化.结果 把针对MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析,插入片段正确;RT-PCR和Western blotting检测显示,MTA1基因的表达水平明显降低,其中以481-499(GACCCT GCTGGCAGATAAA)为靶序列的siRNA沉默作用最强,MTA1蛋白几乎完全不表达.结论 成功构建出沉默食管癌细胞MTA1基因表达的siRNA载体,为通过沉默MTA1基因的表达来减少恶性肿瘤侵袭转移提供了实验基础.     

波形蛋白干扰质粒shRNA Vim的构建及鉴定

目的以波形蛋白基因为靶基因,构建波形蛋白干扰质粒shRNA Vim并验证其干扰效果。方法根据GenBank中大鼠波形蛋白的mRNA序列设计shRNA序列,插入至pSilencer 4.1载体,构建重组质粒,转化到Top 10感受态细胞,经氨苄青霉素筛选挑取阳性克隆并进行测序分析。结果 DNA测序分析显示干扰质粒shRNA Vim构建成功,免疫印迹法显示该干扰质粒能有效地抑制波形蛋白的表达(P<0.001)。结论成功构建波形蛋白干扰质粒shRNA Vim,为研究波形蛋白的生物学功能打下基础。     

凋亡抑制因子Survivin siRNA荧光表达载体的构建

目的构建靶向survivin siRNA真核表达质粒载体，通过RNA干扰技术阻断survivin基因的表达。方法针对目的基因survivin序列设计双链DNA（dsDNA），采用DNA重组技术与载体连接，转化感受态细胞经诱导表达筛选阳性克隆子。结果重组质粒经酶切、测序鉴定，证实插入载体目的基因片段大小与插入方向正确，且转染至肿瘤细胞，可见其发出绿色荧光，转染率为70％-80％。结论靶向survivin—siRNA真核表达载体pGU6／GFP／Neo／survivin—siRNA可用于转染肿瘤细胞、阻断survivin基因表达并诱导细胞凋亡的RNAi实验研究，为肿瘤的基因治疗奠定一定的基础。     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和序列分析

目的 利用pgenesil-1质粒载体,以bcl-2为靶基因,设计构建重组体,以用于后继的RNA干扰研究.方法 设计3对有小发夹结构的两条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pgenesil-1上构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切电泳鉴定后,进行测序分析.结果 将合成的DNA片段退火后克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的 序列.结论 靶向bcl-2基因转录shRNA的重组质粒可以在体外成功构建,为下一步利用该重组体干扰肿瘤细胞中bcl-2的mRNA转录,探索肿瘤基因治疗的新途径打下基础.     

MBD2靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析

目的本研究利用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术,以MBD2(methyl CpG-binding domain 2)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析,为下一步探索肿瘤基因治疗的新途径打好基础.方法设计有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pTZU6 1中构建重组体,转化JM109菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列.结论 MBD2靶向RNA干扰重组体的成功构建和序列分析,为下一步利用该重组体干扰肿瘤细胞中MBD2的mRNA转录,探索肿瘤基因治疗的新途径打下基础.     

抑制人血管内皮生长因子C表达的shRNA逆转录病毒表达载体的构建

目的:构建抑制人血管内皮生长因子C(VEGF-C) 基因表达的RNA干扰(RNAi)逆转录病毒表达载体pSIREN-VEGF-C.方法:根据GenBank中VEGF-C序列,设计、合成靶向VEGF-C基因、编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,退火后用T4连接酶与线性化的pSIREN载体连接,转化感受态大肠杆菌,筛选阳性克隆,抽提质粒,获得重组pSIREN-VEGF-C质粒;BglⅡ和EcoRⅠ双酶切、测序鉴定.结果:重组质粒经双酶切,证实插入片段的大小、方向均与设计的一致;测序显示序列完全正确.结论:成功构建了表达人VEGF-C shRNA的重组质粒载体pSIREN-VEGF-C.     

NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定NSPc1-shRNA慢病毒表达载体,以便应用RNAi技术以及慢病毒感染系统进一步研究NSPc1的功能.方法 设计针对NSPc1mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成带内切酶粘/平末端的双链后,与酶切后的pLentiLox3.7载体片段进行连接、转化.用双酶切及DNA测序鉴定重组克隆.提取阳性克隆质粒并转染293T细胞,收集细胞全蛋白用Western检测RNAi效果.结果 重组克隆经酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,Western检测证实设计的三条RNA干扰序列有效敲低了293T细胞中的内源性NSPc1.结论 3个NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的成功构建为应用基于慢病毒系统的RNAi技术来研究NSPc1基因的功能打下了基础.