肝癌细胞中热休克蛋白27相互作用蛋白的分离和鉴定

目的:筛选肝癌中热休克蛋白27(Heat shock protein,HSP27)相互作用蛋白.方法:采用免疫共沉淀技术富集肝癌HepG2.2215细胞的HSP27结合蛋白,直接酶解后进行液相色谱-电喷雾离子阱串联质谱分析(LC-ESI-IT MS/MS),通过相应的肽序列标签,(Peptide sequence tags,PST)在SWISS PROT数据库中搜索蛋白质.并用免疫共沉淀和蛋白质印迹分析技术对所鉴定的HSP27相互作用蛋白之一HSP90进行了验证.结果:通过搜索数据库在肝癌细胞系中首次鉴定了12个HSP27结合蛋白,分别是HSP90、HSP70、特异性下调葡萄糖调节蛋白78(GRP-78)、赖氨酰羟化酶(Lysyl hydroxylase)、细胞角蛋白9(Keratin9)、细胞角蛋白10(Keratin 10)和细胞角蛋白1(Keratin 1).所鉴定的7个结合蛋白可以划分为3个作用范畴,分别是:分子伴侣、细胞骨架组织和代谢酶类.结论:HSP27在肝癌组织中参与了相关蛋白的调节,通过与一些多肽或小分子蛋白质的相互作用,而参与调控肿瘤发生发展.     

血浆肿瘤坏死因子受体相关因子-4升高对炎症性肠病的临床意义

目的 分析血浆肿瘤坏死因子受体相关因子-4(tumor necrosis factor receptor-associated factor-4,TRAF4)水平对于炎症性肠病的诊断价值以及与内镜下疾病活动性的相关性.方法 应用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析炎症性肠病患者和正常对照者血浆中TRAF4蛋白的表达,受试者工作特征曲线(receiver-operating characteristic,ROC)分析血浆TRAF4水平对于克罗恩病和溃疡性结肠炎的诊断价值,应用Pearson相关分析研究血浆TRAF4水平与内镜下疾病活动性的相关性.数据处理使用GraphPad Prism 5.结果 克罗恩病患者和溃疡性结肠炎患者血浆TRAF4水平均显著高于正常对照者(P＜0.05);克罗恩病患者和溃疡性结肠炎患者血浆TRAF4表达水平和内镜下疾病活动指数均无显著的相关性(P＞0.05).结论 炎症性肠病患者血浆TRAF4水平增高,对区分炎症性肠病患者和正常对照者具有诊断价值,但血浆中TRAF4的水平不能反映内镜下疾病活动程度.     

凋亡蛋白Daxx与TRAF3相互作用的筛选及相互作用位点的鉴定

目的:利用酵母双杂交技术在成人肝文库中筛选能与死亡结构域相关蛋白(Daxx)相互作用的蛋白,并用哺乳动物细胞中进行了免疫共沉淀验证,以进一步了解Daxx的功能. 方法: 利用PCR在成人肝cDNA文库中扩增Daxx全长ORF,构建pDBLeu-Daxx载体. 转化MaV203,检测细胞毒性和自激活作用,确定His基础表达的3AT浓度. 依次转化成人肝cDNA文库. 在营养缺陷型培养基上挑取三阳性克隆. 进行回转实验和免疫共沉淀验证,并利用β-gal分析进行了相互作用结构域的鉴定. 结果: 筛库转化效率达到5.8×106个克隆. 筛选到了一株能与Daxx相互作用的阳性克隆,DNA序列分析和同源检索表明该阳性克隆为肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3).通过回转及co-IP证实了TRAF3能与Daxx相互作用,β-gal分析发现TRAF3通过TRAF Domain与Daxx相互作用. 结论: TRAF3通过TRAF Domain与Daxx相互作用,可能参与了Daxx的调控和功能,为进一步了解Daxx作用的分子机制奠定了基础.     

亲和纯化技术联合质谱鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白

目的：利用亲和纯化技术联合质谱分析筛选鉴定与S100A8和S100A9相互作用的蛋白,为探讨S100A8和 S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供线索。方法：构建含有S100A8和S100A9 CDS区和Flag亲和标 签的真核表达载体p3×Flag-CMV-S100A8和p3×Flag-CMV-S100A9,将其转染至HEK293细胞中,48 h后收集蛋白。运用标 签分离纯化S100A8和S100A9蛋白,液相质谱/质谱分析技术(liquid chromatography mass spectrometry/mass spectrometry, LC-MS/MS)鉴定S100A8和S100A9的相互作用蛋白,通过生物信息学的方法(GO分析)归纳分析相互作用蛋白,免疫共 沉淀实验鉴定S100A8和S100A9的相互作用蛋白。结果：通过标签纯化联合质谱分析成功鉴定出PKM,NPM1,eIF5A 等14个与S100A8相互作用的蛋白,鉴定出14-3-3ε,PKM等6个与S100A9相互作用的蛋白。对所鉴定的相互作用蛋白进 行生物信息学分析,发现与S100A8和S100A9相互作用的蛋白参与糖代谢、细胞黏附、正向调控NF-κB转录因子活性、 抗凋亡等在内的生物信号通路,并利用免疫共沉淀证实PKM2与S100A8和S100A9发生相互作用,14-3-3ε与S100A9发生 相互作用。结论：利用免疫共沉淀结合质谱技术筛选鉴定的S100A8和S100A9相互作用蛋白PKM2和14-3-3ε,可能为阐 明S100A8和S100A9在结肠炎相关性结肠癌发生发展中的作用机制提供重要线索。     

HeLa细胞膜上日本脑炎病毒受体候选分子的初步鉴定

目的寻找HeLa细胞膜上可与日本脑炎病毒(JEV)结合的分子。方法采用免疫共沉淀(Co-IP)技术,分离HeLa细胞膜上可与JEV特异结合的分子,对SDS-PAGE特异条带进行质谱分析,并经Western blotting和酶联免疫吸附试验(ELISA)验证其与JEV的特异结合。结果 Co-IP复合物经SDS-PAGE分离出多个条带,选择最明显的3条带进行了质谱分析,结果显示分别为真核细胞翻译延长因子2(eEF2)、热休克蛋白90β(HSP90β)和微管蛋白α6。利用兔抗人HSP90β单克隆抗体进行Western blotting和ELISA实验,证实了细胞膜中确有HSP90β且可与JEV特异性结合。结论 HSP90β是HeLa细胞膜JEV受体的候选分子。     

HSP90高表达细胞系的建立及其对底物蛋白结合能力的影响

目的建立HSP90稳定高表达细胞系,探讨HSP90在应激适应中的作用及其机制。方法含人类HSP90β全长基因的质粒pSmycHSP经酶切鉴定、大肠杆菌转化、质粒提取纯化后,以电穿孔转染,G418筛选建立HSP90稳定高表达的小鼠成纤维细胞系。通过免疫共沉淀方法,观察HSP90表达与底物蛋白HSP70、Raf-1的结合情况。结果经G418筛选的阳性克隆HSP90clone细胞HSP90胞膜、胞核强染。免疫共沉淀结果表明,细胞内HSP90含量、HSP90结合的Raf-1量、HSP90结合的HSP70量变化趋势为外源性HSP90转染细胞>对照。结论HSP90高表达导致HSP90蛋白与部分底物蛋白的结合性改变。提示细胞可通过HSP90分子伴侣功能,抗衡应激反应中蛋白质变性引起的细胞损伤。     

人胃癌细胞中HSP27高表达与长春新碱耐药的关系

目的探讨长春新碱耐药的人类胃癌细胞株SGC7901/VCR发生多药耐受(MDR)的机制。方法采用比较蛋白质组学方法、反义寡核苷酸(ASOs)抑制法、质谱分析(MS)和免疫共沉淀(IP)法,对长春新碱耐药的SGC7901/VCR细胞系及其母细胞系SGC7901的总蛋白提取物进行测定,分析热休克蛋白27(HSP27)与MDR的关系,并对HSP27的相互作用组图进行综合研究。结果 HSP27作为一种与MDR相关的蛋白得到鉴定,并鉴定出25种HSP27相互作用蛋白。HSP27ASOs对HSP27表达的抑制可加强SGC7901/VCR对长春新碱和阿霉素的化疗敏感性。结论胃癌中HSP27与长春新碱耐受机制相关。     

维生素D及其受体对RIP1调控作用的研究

目的 探讨维生素D及其受体对受体相互作用蛋白(RIP)1表达的影响及其作用机制。方法 采用实时定量PCR和Western blot技术,检测维生素D刺激对RIP1的m RNA和蛋白表达水平的影响,采用免疫共沉淀的方法探讨维生素D及其受体对RIP1的调节机制。结果 维生素D及其受体能够显著降低RIP1的m RNA及蛋白水平表达,抑制HSP90与RIP1复合物的形成。结论 维生素D及其受体通过调节HSP90与RIP1的相互作用调控RIP1的表达,为维生素D及其受体抑制肿瘤的发生提供了新的理论依据。     

建立BioID-质谱联用技术筛选细胞内蛋白质相互作用

目的 通过BioID-质谱联用技术建立一种新的蛋白质相互作用的筛选系统,并采用免疫共沉淀-蛋白质印迹法验证与Yes相关蛋白1(YAP1)相互作用的蛋白质.方法 构建YAP1-BirA*融合表达质粒,将质粒转染进293T细胞后,在细胞培养基中加入50μmol/L生物素,继续培养24 h后提取细胞总蛋白质.利用YAP1特异抗体,采用蛋白质印迹法检测YAP1-BirA*融合蛋白的表达.利用HRP偶联的亲和素检测细胞内蛋白质被生物素标记的水平.通过亲和素磁珠对细胞内生物素化的蛋白质进行亲和纯化,多次洗涤去除亲和素磁珠上非特异性结合的蛋白质后对亲和素磁珠纯化的蛋白质进行溶解.取40μg总蛋白行SDS-PAGE,然后采用蛋白质银染试剂盒对凝胶中的蛋白质进行染色,确定亲和素磁珠对生物素化蛋白的纯化效果.用非标记定量质谱法鉴定生物素化的蛋白质.针对鉴定得到的蛋白质,采用蛋白质印迹法对生物素化的SMAD家族成员3(SMAD3)进行验证.通过YAP1的免疫共沉淀-蛋白质印迹法确定SMAD3能否与YAP1相互作用.结果 成功构建YAP1-BirA*融合表达质粒,该质粒在293T细胞中能够高效表达融合蛋白.在生物素存在的情况下,YAP1-BirA*融合蛋白能够利用生物素标记细胞内与YAP1-BirA*融合蛋白邻近的蛋白质.在细胞裂解后,这些在细胞内被生物素标记的蛋白质能够被偶联亲和素的磁珠纯化,经过多次洗涤,能够富集生物素标记的蛋白质.质谱鉴定显示,能够获得细胞内与YAP1在空间上相互靠近的蛋白质.免疫共沉淀-蛋白质印迹法结果证明SMAD3蛋白能与YAP1相互作用.结论 BioID-质谱联用方法是一种能用于蛋白质相互作用筛选的简单、高效技术,与免疫共沉淀-蛋白质印迹法联合使用可以成为一种新的蛋白质相互作用研究体系.     

建立BioID-质谱联用技术筛选细胞内的蛋白互作

目的 通过BioID-质谱联用建立一种新的蛋白相互作用的筛选系统;通过免疫共沉淀-Western blot验证YAP1相互作用的蛋白。 方法 构建BirA*-YAP1融合表达质粒;将质粒转染进293T细胞后,在细胞培养液中加入生物素,继续培养24小时后,提取细胞总蛋白。利用YAP1特异抗体,通过Western Blot检测BirA*-YAP1融合蛋白的表达;通过HRP-亲和素,检测细胞内蛋白被生物素标记的水平;通过亲和素磁珠,对细胞内生物素化的蛋白进行亲和纯化,并多次洗涤亲和素磁珠上非特异性结合的蛋白后,对亲和素磁珠纯化的蛋白进行溶解。取40 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,通过蛋白银染试剂盒对PAGE凝胶中的蛋白进行染色,确定亲和素磁珠对生物素化蛋白的纯化效果。通过Label-free质谱法对生物素化的蛋白进行鉴定。针对鉴定得到的蛋白,通过Western Blot对生物素化的SMAD3进行验证。通过YAP1的免疫共沉淀,确定SMAD3能与YAP1相互作用。 结果 成功构建BirA*-YAP1融合表达质粒,该质粒在293T细胞中能够高效表达融合蛋白;在生物素存在的情况下,BirA*-YAP1融合蛋白能够利用生物素标记细胞内与BirA*-YAP1融合蛋白相互靠近的蛋白。在细胞裂解后,这些在细胞内被生物素标记的蛋白,能够被偶联亲和素的磁珠纯化,经过多次洗涤,能够富集生物素标记的蛋白。通过质谱鉴定,我们能够获得在细胞内与YAP1在空间上相互靠近的蛋白类型。通过免疫共沉淀-Western Blot技术,我们证明SMAD3能够与YAP1相互作用。 结论 Bio-ID-质谱联用的方法是一种用于蛋白互作筛选的简单、高效的技术,与后续的免疫共沉淀-Western Blot联合使用,可以成为一种新的蛋白互作研究体系。     

TRAF2在乳腺癌中的表达及与乳腺癌侵袭性的关系

目的研究肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）在乳腺癌中表达的变化情况,分析其与乳腺癌侵袭性的关系。方法应用免疫组化及Western blot方法检测TRAF2在不同侵袭性乳腺癌、不同转移潜能乳腺癌细胞系中的表达。结果TRAF2在正常乳腺组织中不表达,在乳腺癌中有表达。TRAF2在高、中转移性乳腺癌细胞系的表达量明显高于低转移细胞系,在低转移性乳腺癌细胞系的表达明显高于正常乳腺上皮细胞系。结论TRAF2表达随乳腺癌侵袭及转移性升高而呈上升趋势,提示TRAF2过表达与乳腺癌侵袭、转移有关。     

TRAF1蛋白在乳腺癌中的表达及意义

目的：探讨肿瘤坏死因子受体相关因子1（tumor necrosis factor receptor-associated factor 1,TRAF1）在正常乳腺组织、乳腺癌组织及不同侵袭能力乳腺癌细胞系中的表达情况,并分析其与微血管密度的关系。方法：应用免疫组化方法分别检测TRAF1和CD34在70例乳腺癌组织和14例正常乳腺组织中的表达,并计数微血管密度。应用Western blot方法检测TRAF1在乳腺癌细胞系MDA-MA-231（高侵袭）和MCF-7（低侵袭）中的表达。结果：TRAF1在正常乳腺组织中不表达。其细胞浆阳性表达率在非浸润性导管癌（17.14%）中高于正常乳腺组织,但差异无统计学意义（P〉0.05）。在浸润性导管癌（40%）中明显高于正常乳腺组织和非浸润性导管癌（P〈0.05）。TRAF1在乳腺癌高侵袭细胞系中的表达量高于低侵袭细胞系,但差异无统计学意义（P〉0.05）。乳腺浸润性导管癌中,TRAF1阳性表达的微血管密度明显高于阴性表达组（P〈0.05）。结论：TRAF1在乳腺癌组织中表达明显升高,与乳腺癌侵袭性相关。在浸润性导管癌中,TRAF1表达与微血管密度相关。     

正常和肿瘤组织中ZNF165 mRNA的表达及其自发性抗体检测

目的:分析正常和肿瘤组织中ZNF165的表达及其在肝癌患者体内诱导产生的自发性体液免疫反应.方法:采用RT-PCR和定量PCR方法检测16种正常和4种肿瘤(肝癌、胃癌、结肠癌、肺癌)组织中ZNF165 mRNA及表达丰度;将ZNF165基因在原核细胞中进行蛋白表达,亲和层析法纯化重组ZNF165蛋白.Western blot方法对ZNF165在82例肝癌患者体内诱导的自发性抗体进行检测.结果:正常组织中ZNF165 mRNA只在睾丸组织表达,肝癌、胃癌、结肠癌和肺癌组织中ZNF165 mRNA阳性率分别为52.4%、 42.8%、 42.8%和21.4%.定量 PCR结果显示ZNF165 mRNA以高水平在肝癌组织与睾丸组织中表达,而在配对的癌旁组织与其他正常组织中仅存在很低水平的表达(P均＜0.01).82例肝癌患者血清中4例与ZNF165蛋白出现免疫反应,阳性率4.9%;36例正常人血清均为阴性.结论:ZNF165是一个新的肿瘤-睾丸抗原基因,它在机体内可诱导体液免疫反应,有可能作为肿瘤免疫治疗的候选抗原.     

TRAF3在肝细胞肝癌中的表达及意义

目的探讨肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)在肝细胞癌(简称肝癌)发生、发展中的意义。方法采用免疫组化方法检测50例原发性肝癌组织、12例癌旁肝组织及10例正常肝组织中TRAF3蛋白的表达,分析其与肝癌的临床病理参数的关系。Western blot法检测TRAF3在肝癌高分化细胞系HepG2、低分化细胞系SMMC7721和人正常肝细胞系L-02中的表达差异。结果 TRAF3主要定位于细胞质,其阳性率在正常肝组织(100%)及癌旁组织(91%)明显高于肝细胞癌组织(52%)。TRAF3在肝癌的表达与临床分期相关,与患者性别、年龄、癌灶数目、肿瘤大小、瘤栓有无、乙肝表面抗原(HBsAg)阴阳性、甲胎蛋白(AFP)、肿瘤包膜是否完整均无关。TRAF3总蛋白在正常肝细胞系中的表达量明显高于肝癌细胞系,且在肝癌高分化的细胞系中表达量高于低分化细胞系。结论 TRAF3在肝癌中的表达明显下调,且在肝癌中的表达水平与肝癌的侵袭程度相关,提示TRAF3可能抑制肝癌的浸润和转移。     

不同临产状态的子宫平滑肌组织中与#br# NF-κB相互作用差异蛋白质的分析

目的：分析不同临产状态子宫下段平滑肌组织中与NF-κB相互作用的差异蛋白质,为分娩机制的研究提供新的实验及理论依据。方法：分别采集足月未临产、自然临产和前列腺素E2栓诱导临产(药物临产组)的孕妇子宫下段平滑肌组织。Western印迹验证NF-κB P65表达;联合免疫共沉淀、SDS-PAGE、电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)和蛋白质生物信息分析等技术,分析不同临产状态子宫平滑肌组织中与NF-κB相互作用的差异蛋白质,并利用Western印迹进行验证。结果：人类临产前后子宫下段平滑肌组织中NF-κB表达均为阳性,与NF-κB P65相互作用的差异蛋白,自然临产前后鉴定出9个,药物临产前后鉴定出5个,其中不同临产状态共同差异表达的蛋白3个,分别为热休克蛋白70(heat shock 70 kD protein,HSP70)、膜联蛋白A6和结蛋白,经Western印迹验证与蛋白表达相符。这些差异蛋白分别属于分子伴侣、信号转导、细胞骨架和能量代谢相关的蛋白质。结论：子宫平滑肌细胞中NF-κB通过与分子伴侣、信号传导、细胞骨架和能量代谢等相关的多种蛋白质相互作用,参与分娩的启动或调节。     

HSP60 HSP70 HSP90α在结直肠癌癌旁组织的表达及与病理分级的关系

目的研究结直肠癌、癌旁正常组织中HSP60、HSP70、HSP90α蛋白的表达情况,并分析其与病理分级的关系。方法采用免疫组化法测定49例结直肠癌及其癌旁组织HSP60、HSP70、HSP90α的表达情况。结果免疫组化结果表明结直肠癌组织中HSP60、HSP70和HSP90α表达率及过表达率较其癌旁组织中均有明显差异。HSP60、HSP70、HSP90α在结直肠癌高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌的表达率和过表达率均无明显差异。结论HSP60、HSP70、HSP90α三种蛋白表达水平在结直肠癌组织均明显高于癌旁组织,但是其与病理分级无相关关系,证明这三种蛋白在结直肠癌的发病机理中具有普遍意义,为进一步探索HSPs在结直肠癌发病中作用及机制提供了依据。     

热休克蛋白在肺腺癌细胞及组织中的表达

目的:探讨热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)在肺腺癌A549细胞及组织中的表达情况.方法:分别以正常人支气管上皮(human bronchial epithelium,HBE)细胞和正常肺组织为对照,采用免疫印迹及RT-PCR的方法,从细胞水平和组织水平观察HSP86,HSP70及aB晶状体蛋白在肺腺癌A549细胞及组织中的表达情况.结果:与HBE细胞及正常肺组织比较,A549细胞及癌组织中HSP86,HSP70及aB晶状体蛋白的mRNA与蛋白质表达均显著增加(P＜0.05),其中以HSP70的增加最为显著(P＜0.01).结论:肺腺癌细胞及组织中HSPs的表达量高于HBE细胞及正常肺组织,其中以HSP70的增加最为显著.     

细粒棘球蚴热休克蛋白70重组抗原的免疫学特性研究

目的鉴定纯化的重组细粒棘球蚴热休克蛋白70(EgHSP70)的免疫学特性。方法对已构建的阳性表达菌EgHSP70/pGEX-6P-1进行大量诱导表达后纯化,用EgHSP70和HSP70/GST作抗原制剂分别免疫小鼠,制备抗血清,通过ELISA法和Western blot法对重组EgHSP70的免疫学特性进行鉴定。结果ELISA法检测结果表明,原头蚴、囊液等天然抗原均可被免疫小鼠血清识别,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);Western blot显示免疫小鼠血清能够有效识别重组蛋白,同时重组EgHSP70也可被免疫兔血清识别。结论纯化后的重组蛋白EgHSP70具有较好的免疫原性和抗原性,可望作为包虫病疫苗候选分子,值得进一步深入研究。     

膀胱癌组织中Plk1的表达和临床意义

目的:探讨Plk1蛋白在正常膀胱组织和膀胱癌中的表达,及其与临床分期和病理分级的关系。方法:应用western blot和链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法检测21例正常膀胱组织、90例膀胱癌组织中Plk1的表达情况及其与膀胱癌各临床病理参数的关系。结果:western blot显示膀胱癌和癌旁正常组织中均有Plk1的表达,但在膀胱癌中的表达量明显高于癌旁正常组织的表达量且具有统计学意义。免疫组化显示膀胱癌组织中Plk1蛋白表达总阳性率为64.44%(58/90),显著高于正常膀胱组织的38.10%(8/21),而且与肿瘤病理分级及肿瘤临床分期具有显著的相关性。结论:Plk1蛋白的阳性表达与膀胱癌的发生、发展密切相关,可以为膀胱癌的良、恶性分析及判断肿瘤的生物学行为提供理论依据。     

热休克蛋白60在子宫颈癌组织中的表达及其临床意义

目的研究热休克蛋白60(heat shock protein,HSP60)在子宫颈癌中的表达及意义。方法应用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹分析法检测子宫颈癌手术切除组织57例,正常子宫颈组织57例,观察热休克蛋白60的表达与子宫颈癌发生发展的关系。结果①正常子宫颈组织HSP60 mRNA表达明显少于子宫颈癌组织(t=2.65,P<0.05)。②57例子宫颈癌组织和57例正常子宫颈组织中,HSP60的表达阳性检出率分别为:82.5%、19.3%;HSP60的过表达率为57.9%、7.0%。③HSP60在子宫颈癌组织的不同分期中表达差异无显著性(P>0.05)。④子宫颈正常组织HSP60蛋白的表达水平明显低于子宫颈癌组织(t=3.132,P<0.05)。结论HSP60的表达与子宫颈癌组织的发生密切相关。HSP60的表达与子宫颈癌组织的不同分期无关。