8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞凋亡中P38和Caspase-3表达的影响

目的 探讨8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞凋亡中P38、Caspase-3表达的影响.方法将贴壁培养的Eca-109细胞随机分为3组①对照组只加DMEM(Sigma)培养液(含体积分数10%胎牛血清)培养48 h.②Br组终浓度为2×10-5 mol/L 8-Br-cAMP的培养液培养48 h.③Q组终浓度为43 μmol/L槲皮素的培养液培养48 h.对以上3组细胞以TUNEL法染色计数细胞凋亡率.以免疫组化方法观察3组细胞的P38 MAPK-IR和Caspase-3-IR反应性.结果Br组及Q组细胞凋亡率高于对照组;Br组及Q组细胞的P38 MAPK-IR高于对照组;Br组及Q组细胞的Caspase-3-IR亦高于对照组.P38 MAPK-IR与Caspase-3-IR呈正相关.P均<0.05.结论P38 MAPK及Caspase-3参与了8-Br-cAMP及槲皮素诱导的Eca-109细胞的凋亡.     

8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞相关基因的DNA拷贝和基因表达的影响

目的探讨8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞wtp53、c-myc、bcl-2基因的扩增、表达以及VEGF表达的影响.方法将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组不加任何药物,只加入新培养液培养.3组细胞同时培养48h.以cDNA 阵列技术显示Eca-109细胞凋亡中wtp53、c-myc、bcl-2 DNA拷贝和mRNA的表达,以免疫组化法显示VEGF的表达.结果Br组和Q组与C组相比wtp53 DNA拷贝和mRNA信号较强,c-myc、bcl-2 DNA拷贝和mRNA信号较弱,VEGF表达较弱.结论8-Br-cAMP和槲皮素皆可通过上调wtp53,下调bcl-2、c-myc基因的扩增和表达,下调VEGF的表达,而诱导Eca-109细胞凋亡.     

8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞内游离钙离子浓度的影响

目的观察8-Br-cAMP和槲皮素对人食管癌Eca-109细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的影响.方法将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组不加任何药物,只加入新培养液培养.3组细胞同时培养48 h,用激光共聚焦显微镜观察3组细胞内钙离子的荧光强度.结果对照组细胞内游离钙离子荧光强度为59.2±8.1,Br组细胞内游离钙离子荧光强度为63.3±8.5,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);Q组细胞内游离钙离子荧光强度为113.3±12.5,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论提示Br和Q诱导细胞凋亡的信号传导途径可能存在一定差异.     

8-Br-cAMP和槲皮素单独和联合应用对Eca-109细胞凋亡和Bcl-2、Bax、XRCC1等凋亡相关蛋白的作用

目的探讨8-Br-cAMP和槲皮素联合应用对Eca-109细胞的凋亡和Bcl-2、Bax、XRCC1等凋亡相关蛋白的作用.方法将Eca-109细胞随机分为4组①8-Br-cAMP组(Br组); ②槲皮素组(Q组); ③(Br+Q)组; ④不加药物的对照(C)组.同时培养48 h,对以上4组细胞制备细胞滴片及硝酸纤维素膜(NCM)滴膜2种标本,分别进行Bcl-2、Bax、XRCC1的免疫组化和免疫斑点印迹实验,并以TUNEL法检测各组细胞凋亡率.结果细胞凋亡率,C组为4%,(Br+Q)组为70%,Br组为42%,Q组为35%,(Br+Q)组>Br组或Q组>C组,P<0.001.Br、Q及(Br+Q)组与对照组相比,Bcl-2-IR及XRCC1-IR皆低于C组,P<0.001,而Bax-IR则高于C组,P<0.001;Br组Q组或Br组(Br+Q)组,P>0.05.Bcl-2-IR与XRCC1-IR呈显著正相关,与Bax-IR和Bax-IR与XRCC1皆呈显著负相关.结论Br与Q联合用药与单独用药皆可下调Bcl-2及XRCC1表达,上调Bax表达;联合用药的细胞凋亡率显著高于单用Br或Q.提示,中西医联合用药可能更具有临床治疗意义.     

8-Br-cAMP和槲皮素单独和联合应用对Eca-109细胞POLB及多药耐受相关蛋白的影响

目的探讨8-Br-cAMP和槲皮素单独和联合应用对Eca-109细胞耐药性的影响.方法将培养的Eca-109细胞随机分为4组①8-Br-cAMP组(Br组); ②槲皮素组(Q组); ③(Br+Q)组; ④不加药物的对照组(C)组.同时培养48 h,对以上4组细胞制备细胞滴片及硝酸纤维素膜(NCM)滴膜2种标本,分别进行MRP和POLB的免疫组化染色和免疫斑点印迹阵列及TLC扫描.结果免疫组化染色显示 C组的MRP-IR、POLB-IR强于Br组、Q组或(Br+Q)组,P<0.01.TLC扫描OD值C组MRP-IR高于Br、Q(Br+Q)组约3倍;POLB-IR高于Br、Q或(Br+Q)组约2倍;MRP与POLB呈显著正相关r=0.983 8,P<0.01.结论8-Br-cAMP和槲皮素联合用药或单独用药均可降低Eca-109细胞的多药耐受性而提高药物的敏感性,可有利于提高临床疗效.     

8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞核基质蛋白的影响

目的探讨8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞核基质蛋白的影响.方法将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组不加任何药物,只加入新培养液培养.同时培养48 h,应用SDS-PAGE技术分析3组细胞核基质蛋白成分.结果实验组(Br组与Q组)与对照组(C组)比较,相对分子质量64 000、66 000、58 000为增加的条带,14 000、17 000、18 000为增强的条带,92 000是减弱的条带.2个实验组相比,以Br组变动显著.结论8-Br-cAMP和槲皮素可以诱导Eca-109细胞核基质蛋白成分改变,可能对肿瘤细胞基因表达调控、分化及凋亡起重要作用.     

8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞p16基因启动子DNA结合蛋白及其mRNA表达的影响

目的应用Southwestern技术研究8-Br-cAMP和槲皮素(quercetin)对Eca-109细胞DNA结合蛋白与p16基因启动子区的结合调控mRNA表达的影响.方法将贴壁培养的Eca-109细胞随机分成3组,Br组加8-Br-cAMP至终浓度为2×105 mol/L;Q组加槲皮素至终浓度为43 μmol/L;C组不加任何药物,只加入新培养液培养.同时培养48 h,应用质粒提取及限制性酶切回收目的DNA片段,采用生物素随机引物标记探针;应用DNA斑点印迹技术检测探针的灵敏度后以Southwestern印迹技术检测与p16基因启动子区特异性结合的DNA 结合蛋白(DBP);以原位杂交检测p16基因mRNA的表达情况.结果实验组条带强于对照组,Br组强于Q组;核基质DNA结合蛋白主带位于Mr66 000、58 000和20 000;核外DNA结合蛋白主带位于Mr40 000、28 000和20 000;2者中20 000是共同成分.原位杂交技术显示p16基因mRNA蓝紫色信号颗粒位于胞质,杂交信号以实验组较强.结论8-Br-cAMP和quercetin尤其是前者作用于人食管癌Eca-109细胞,诱导产生与p16基因启动子结合较强的DBP,启动p16基因表达.     

8-Br-cAMP和槲皮素联合应用对Eca-109细胞增变基因表型的影响

目的:探讨8-Br-cAMP和槲皮素联合应用对Eca-109细胞增变基因表型变动的影响。方法:将Eca-109细胞分为4组:①8-Br-cAMP组(Br组);②槲皮素组(Q组);③(Br+Q)组;④不加药物的对照组(C)。同时培养48 h,对以上4组细胞制备细胞滴片及硝酸纤维素膜(NCM)滴膜2种标本,分别进行Bcl-2、Bax、XRCC1、MRP和POLB的免疫组化和免疫斑点印迹实验,并以TUNEL法检测各组细胞凋亡率。结果:细胞凋亡率,C组为4%,(Br+Q)组为70%,Br组为42%,Q组为35%,(Br+Q)组>Br组或Q组>C组,(P<0.001)。Br、Q及(Br+Q)组与对照组相比,Bcl-2-IR及XRCC1-IR皆低于C组(P<0.001),而Bax-IR则高于C组(P<0.001);Br组:Q组或Br组:(Br+Q)组(P>0.05)。Bcl-2-IR与XRCC1-IR呈显著正相关,与Bax-IR和Bax-IR与XRCC1皆呈显著负相关。C组的MRP-IR、POLB-IR强于Br组、Q组或(Br+Q)组(P<0.01。)TLC扫描OD值:C组MRP-IR高于Br、Q或(Br+Q)组约3倍;POLB-IR高于Br、Q或(Br+Q)组约2倍;MRP与POLB呈显著正相关r=0.9838(P<0.01)。结论:Br与Q联合用药或单独用药皆可下调Bcl-2,XRCC1,MRP与POLB的表达,上调Bax的表达,提示Br与Q联合用药与单独用药皆可下调Eca-109细胞的增变基因表型。     

8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞DNA polβ基因及相关基因表达的影响

目的探讨8-Br-cAMP及槲皮素等分化诱导剂对Eca-109细胞DNA polβ基因及相关基因表达的影响.方法将培养的Eca-109细胞分为3组①加8-Br-cAMP组(Br组);②加槲皮素组(Q组);③不加任何药物对照组(C组).同时培养48 h,将野生型DNA polβ的cDNA, EGFR cDNA,野生型(wt) p53 cDNA及c-myc cDNA分别制备了生物素/地高辛标记的探针进行原位杂交和RNA斑点印迹阵列.另进行POLB,XRCC1,VEGF及PCNA的免疫组化染色及免疫斑点印迹阵列.结果Br组和Q组的DNA polβ,EGFR,c-myc基因表达下调而wtp53基因表达上调.POLB,XRCC1,PCNA及VEGF免疫斑点印迹减弱.8-Br-cAMP及槲皮素显著下调Eca-109细胞的DNA polβ基因表达及相关癌基因表达,同时上调抑癌基因的表达.作为POLB的异二聚体XRCC1及恶性细胞生物标志的PCNA及VEGF表达下调.结论分化诱导剂下调Eca-109细胞DNA polβ基因表达,提示Eca-109细胞的polβ基因是高表达的;功能调整后的polβ通过相关基因表达的改变尤其是wt p53基因表达的上调在癌细胞分化中可能起重要作用.     

8-Br-cAMP对Eca-109细胞c-myc，wtp53，iNOS基因和EGFR表达的影响

目的探讨8-Br-cAMP对Eca-109细胞c-myc、wtp53、iNOS基因和EGFR表达的影响.方法将贴壁培养的Eca-109细胞随机分为2组①实验组加8-Br-cAMP至终浓度为2×10-5mol/L,培养24 h;②对照组不加8-Br-cAMP,培养24 h.对2组的细胞涂片和硝酸纤维素膜(NCM)标本进行c-myc、wtp53、iNOS基因和EGFR表达检测,并对扫描数值进行统计学处理.结果原位杂交及免疫组化反应信号皆定位于Eca-109细胞的胞质,扫描数值显示①c-myc mRNA实验组为3.38±0.99,对照组为5.18±1.39;②wtp53 mRNA实验组为2.74±0.83,对照组为0.38±0.27;③iNOSmRNA实验组为4.52±0.74,对照组为2.63±0.13;④EGFR-IR实验组为2.37±1.05,对照组为4.38±0.48.以上实验组与对照组比较差异有统计学意义(P均<0.05).结论c-myc、wtp53和NO均可参与8-Br-cAMP诱导癌细胞的分化效应.     

8-Br-cAMP和槲皮素对Eca-109细胞iNOS基因拷贝及Caspase-3表达的影响

目的 :观察 8 Br cAMP和槲皮素对Eca 10 9细胞iNOS基因拷贝及Caspase 3表达的影响。方法 :将贴壁培养的Eca 10 9细胞随机分成 3组 ,Br组 :加 8 Br cAMP至终浓度为 2× 10 5mol/L ;Q组 :加槲皮素至终浓度为 4 3μmol/L ;C组 :不加任何药物 ,只加入新培养液培养。 3组细胞同时培养 4 8h。采用原位斑点印迹法显示iNOS基因拷贝和mRNA的表达 ,采用细胞免疫化学技术显示Caspase 3的表达。结果 :Br和Q组较C组iNOS基因拷贝和mRNA表达信号较强。Br和Q组细胞内Caspase 3免疫反应 (IR)性较强 ,Br和Q组与对照组相比 ,存在显著性差异 (P 0 .0 1) ;Br组的Caspase 3 IR强于槲皮素组 (P <0 .0 1)。结论 :8 Br cAMP和槲皮素皆可上调iNOS基因的扩增和表达 ,最终可都通过上调Caspase 3的表达 ,诱导Eca 10 9细胞凋亡。     

DTT与顺铂诱导对食管癌Eca109细胞磷酸化P38表达的影响

目的:探讨磷酸化P38在顺铂和DTT诱导的食管癌Eca109细胞凋亡中的作用.方法:分别用DTT与顺铂诱导处理食管癌Eca109细胞,未加药组作为对照.采用流式细胞仪技术检测细胞凋亡率;用免疫组化方法检测磷酸化P38的表达情况.结果:与对照组相比,DTT处理组及顺铂处理组细胞凋亡率明显升高.免疫组化结果显示:2处理组磷酸化P38的水平均明显高于对照组(P＜0.05);DTT处理组磷酸化P38大部分位于细胞核内,而顺铂组磷酸化P38则主要弥散于细胞浆内.结论:磷酸化P38在DTT和顺铂诱导的食管癌Eca109细胞凋亡时细胞内分布不同,激活的P38可能通过不同途径参与细胞凋亡.     

8-Br-cAMP对人食管癌Eca-109细胞增殖与分化的效应

在人食管癌Ｅｃａ１０９细胞中加以终浓度为１０－５ｍｏｌ／Ｌ的８ＢｒｃＡＭＰ体外培育２４ｈ后，应用酸解ＤＮＡ及甲绿派洛宁染色技术在同一标本上鉴别增殖型细胞和分化型细胞。结果：８ＢｒｃＡＭＰ处理组增殖型细胞占６３％，分化型细胞占３７％；而对照组增殖型细胞占８３％，分化型细胞占１７％。结果提示：８ＢｒｃＡＭＰ对Ｅｃａ１０９细胞有抑制增殖和促进分化效应