1株肠道病毒71型南京分离株的全基因组序列的测定及遗传进化分析

［摘要］目的: 对肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）南京分离株EV71-NJ2012全基因组核苷酸序列进行测定,并与基因库中的代表性序列进行分析比对。方法: 登录基因库,选取不同国家和地区的EV71全基因组序列,设计8对覆盖病毒整个基因组且首尾部分重叠的引物,采用RT-PCR扩增出8个基因片段,通过测序和拼接获得全基因组序列,并与国内外其他EV71分离毒株一起用MEGA 4.0软件进行进化树分析,用DNAStar进行同源性分析。结果： EV71-NJ2012株的基因组长度为 7 404 bp, 其中5′非编码区(UTR)长742 bp, 3′UTR长82 bp,病毒基因组开放阅读框(ORF) 全长6 582 bp, 编码一个含有2 193个氨基酸残基的多聚蛋白。病毒序列在分型上属于C4a基因型,与上海株的核苷酸同源性最近,而与我国台湾、湖北等分离株的核酸序列差异较大。结论： EV71-NJ2012株基因组的组成和结构符合肠道病毒特征,与上海株亲缘关系最近,而与我国台湾、湖北分离株的差异较为明显。EV71-NJ2012株可能与上海株来源于EV71病毒株的同一种系。     

重庆地区2009年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征

目的 对2009年重庆市手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)患儿粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将47例手足口病患儿临床标本接种人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma,RD)进行分离培养,采用EV、EV71、Cox A16特异性引物对出现细胞病变的细胞上清进行PCR鉴定,同时电镜观察病毒颗粒形态,将鉴定的病毒基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析,绘制进化树.结果 在47例HFMD患儿临床标本接种RD细胞培养中,有7份观察到明显的细胞病变,通过RT-PCR检测有3份呈EV特异性引物及EV71特异性引物阳性,而所有标本Cox A16特异性引物检测为阴性,EV71特异性引物的PCR产物测序结果证实为EV71病毒,同时用电镜观察形态病毒感染的RD细胞,为圆形无包膜病毒颗粒,证实所分离病毒为EV71.测序获得的3株EV71病毒基因组全长分别为7 409、7 406 nt和7 404 nt,其VP1氨基酸序列同源性达99%以上.Blast分析表明重庆毒株Chongqing-2-09-China(GQ994990.1)、Chongqing-3-09-China (GQ994991.1)均与安徽阜阳2008年分离的3株EV71毒株同源性较高,重庆毒株Chongqing1-09-China (GQ994989.1)与2005年台湾分离984 polyprotein、1235 polyprotein序列毒株同源性最高,进化分析表明属于C4基因亚型.结论 新分离的重庆EV71毒株基因组序列符合肠道病毒特征,与国内2008年安徽阜阳及台湾2005年分离的EV71病毒可能具有相同来源.     

2010年云浮市手足口病病原学监测结果分析

目的对2010年云浮市哨点医院手足口病（HFMD）监测结果进行分析,了解云浮市手足口病的病原学特征,为云浮市手足口病的防治提供科学的依据。方法收集73例监测哨点医院手足口病病例送检的粪便标本,应用Real time—PCR技术检测肠道病毒7l型（EV71）、柯萨奇病毒A组16型（CAl6）、非EV7l和CAl6的其它肠道病毒核酸。结果 73例手足口病患者中42例为肠道病毒核酸阳性,阳性率为57.5%,其中EV71病毒、CAl6病毒以及非EV7l和CAl6的其它肠道病毒分别占总阳性数的71.4%、7.1%、21.4%。三种不同型别肠道病毒在全年中交替变更;病毒检出高峰出现在5～6月,病例人群男性高于女性（1.92：1）,4岁以下儿童病例阳性率最高。结论云浮市2010年手足口病疫情发病高峰为5-6月,4岁以下儿童病例发病数最多,肠道病毒EV71型是2010年云浮市手足口病流行的主要毒株类型。开展手足口病流行病学和病原学研究,将有助于提出更好的预防和控制措施。     

2012年贵阳地区住院患儿手足口病的病原学研究

目的：了解2012年贵阳地区儿童手足口病住院患者的病原体分布情况,为手足口病的诊断、治疗及预防提供依据。方法收集3179例手足口病患儿资料,用荧光定量PCR法进行肠道病毒通用型、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）定量分型。结果共检测手足口病病例标本3179份,CA16阳性151份,占4．75％;EV71型331份,占10．41％;CA16和EV71混合感染7份,占0．22％;其他型肠道病毒897份,占28．22％。全年有2个发病高峰,分别为4～7月及10～11月,发病年龄主要集中在5岁以下儿童,其中0～3岁发病最高;男性患儿多于女性。结论2012年贵阳地区儿童手足口病住院患者的病原学分布以其他型肠道病毒和EV71型为主。     

肠道病毒71型河南分离株2株全基因组序列分析

目的:了解2011年河南洛阳和南阳地区流行的肠道病毒71型(EV71)基因特征。方法:分离洛阳和南阳地区EV71病毒各一株,分别进行全基因测序和基因进化分析。结果:EV71/Luoyang2011和EV71/Nanyang2011的VP1区序列在进化树上均属于C4亚型,与国内流行株都具有较高同源性,与2008年广东流行株亲缘关系最近。这2株全基因核苷酸序列同源性为99.3%,氨基酸序列同源性为97.6%,并且氨基酸均没有发生明显改变。结论:EV71/Luoyang2011和EV71/Nanyang2011属于C4亚型,与我省及我国既往流行株相比,未发生大的变异。     

2010年聊城地区手足口病病原学检测结果分析

目的 了解聊城地区2010年手足口病病原情况.方法 2010年6月采集聊城地区240例手足口病病人(包括27例重症病人)咽拭子并提取病毒RNA.采用Real-time RT-PCR方法,以肠道病毒5'UTR区通用引物及探针对240份临床标本进行初步筛查,初筛阳性标本进一步采用CA16及EV71 VP1区特异性引物及探针...     

2010年天津市流行的肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型VPl区域序列分析

【目的】研究2010年天津市手足口病患者中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型的VPl基因特征。【方法】采集60例天津地区2010年手足口病流行期间患儿的粪便标本,分别用EV71和CoxAl6的VPl区域引物对粪样中病毒RNA进行PCR检测。同时选取11株EV71扩增阳性和4株CoxAl6扩增阳性的样本,对其扩增产物的VPl区进行核苷酸序列测定,比照EV71和CoxAl6各基因型进行同源性分析,并构建系统发生树。【结果】从60例手足口病患儿粪便标本共检测出27例EV71阳性和4例CoxAl6阳性。经VPl区测序,11例EV71阳性与EV71C4基因型同源性94．4％～94．8％;4例CoxAl6阳性与CoxAl6C基因型同源性93．4％-94．7％。在系统发生树上,这11株EV71均属于EV71C基因型,与c4亚型属于同一分支;4株CoxAl6均属于CoxAl6的C基因型。【结论】2010年天津市手足口病患者粪便样本中检测出的EV71毒株属于EV71C4亚型,CoxAl6毒株属于CoxAl6C基因型。     

菏泽市2013～2017年手足口病病毒学监测分析

目的 探讨菏泽市2013～2017年手足口病流行病毒类型,为菏泽市手足口病疫情的防控和实施策略提供科学依据。 方法 2013～2017年菏泽市各县区手足口病定点医疗单位收集的临床诊断病例的粪便或肛拭子标本,提取病毒核酸,应用实时荧光定量PCR进行病毒的核酸检测;用描述性流行病学方法分析流行病学特征。 结果2013～2017年共收集样本2751份,其中阳性样本2294份,阳性率为83.39%;EV71阳性样本1111份,阳性率为40.39%;CA16阳性样本387份,阳性率为14.08%;其他肠道病毒阳性样本796分,阳性率为28.93%。2013年、2015年优势株为EV71;2014年优势株为CA16;2016、2017年以其他肠道病毒型为优势株。不同年龄组、性别、季节分布差异有显著性（P<0.05）。各年手足口病毒型别分布差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 2013~2017年菏泽市手足口病流行病毒类型从高到低分别是EV71、其他肠道病毒和CA16。EV71是引起重症病例的主要病原体。在高发季节前,应加强托幼机构及散居儿童的卫生健康教育和防控力度,提前做好低幼儿童的疫苗宣传及接种工作;强化手足口病监测力度。     

湘潭市手足口病病原学实验室检测分析

目的:根据手足口病病原学检测结果分析该病流行特征,同时评估从不同部位采集样品的阳性检出率,为手足口病的防控提供科学依据。方法:临床诊断为手足口病例的咽拭子标本,疱疹液标本,粪便标本,采用实时荧光(定量)PCR进行检测,对总肠道病毒阳性的标本,进行EV71和CA16分型,检测结果分组统计分析。结果:在652份监测病例样品中,总肠道病毒阳性样品446份,其中EV71阳性199份,占44.52%;CA16阳性176份,占39.37%;其它型肠道病毒阳性71份,占15.97%。在103份重症病例样品中,总肠道病毒阳性91份,其中EV71阳性77份,占84.62%,CA16阳性3份,占3.29%,其它型肠道病毒阳性10份,占10.10%。结论:湘潭市手足口病流行病原以EV71型和CA16型交替流行;重症病例主要由EV71引起;疱疹液,粪便标本的阳性检出率高于咽拭子。     

新疆2011-2013年肠道病毒71型VP1区基因特征分析简

目的了解新疆肠道病毒71型（EV71）分离株VP1区基因特征。方法选取2011-2013年新疆部分地州手足口病病例标本,临床标本或其病毒培养物经实时荧光PCR鉴定后,通过RT—PCR法进行VP1区编码基因扩增,并对扩增产物进行序列测定,所得序列用ChromasPro1．7．4,BioEdit7．1．11和MEGA5．1软件进行序列校正、拼接、整理和分析,并与EV71各型及亚型参考序列构建基于VPl序列的系统进化树。结果新疆EV71分离株之间核苷酸和氨基酸序列同源性在92．8％～100．0％和97．9％～100．0％,22株病毒株与安徽阜阳和山东临沂C4a基因参考株最为相近,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在93．9％～98．6％和98．6％～99．6％。而与A、B基因型参考株差异较大,核苷酸和氨基酸序列序列同源性在82．1％～84．8％和95．9％～98．3％。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定的阳性率为30．0％,低于用病毒培养物的阳性率（100．0％）。结论2011—2013年新疆EV71分离株均为C4a基因型,与安徽和山东分离的EV71毒株可能有相同的起源。直接用临床标本进行核酸提取、扩增和序列测定可用于肠道病毒的分型鉴定。     

惠州地区2010年手足口病实验室检测分析

目的了解惠州市手足口病例肠道病毒的感染情况,为制定预防和控制肠道病毒感染策略提供依据。方法采集2010年5月至12月惠州市中心人民医院、惠州市第一人民医院等全市各大医院的998例疑似手足口病患者的疱疹液、脑脊液、咽拭子、粪便等标本,采用实时荧光RT-PCR技术检测样本中的肠道病毒（EV）、肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒A组16型（CA16）。结果在检测的682份EV阳性标本中,EV71阳性率偏高,为总数的48.9%,而CA16阳性率较低,为总数的5.71%;在998例疑似手足口病患者中,男性患者居多,占62.12%,女性患者相对较少,占37.88%;0～4岁的儿童是手足口病的高发人群,占所有患者的92.99%;5～7月的夏季为手足口病感染的高峰期,其阳性率占98.9%。结论惠州市2010年5月～12月手足口病的病原体以肠道病毒71型为主,0～4岁的男性儿童是感染肠道病毒的高危人群,5～7月的夏季较为高发。     

肠道病毒71型特异性单克隆抗体的制备及其在病毒鉴定中的应用

目的：建立肠道病毒71型（ EV71）特异性检测的免疫荧光方法用于病毒分离培养后的EV71鉴定,为EV71生物学特征研究和疫苗株的筛选奠定基础。方法：以EV71 VP1为免疫原制备单克隆抗体,用经测序鉴定的肠道病毒毒株建立EV71特异性免疫荧光方法;将不同地区收集的手足口病患儿的临床标本进行病毒分离,利用EV71特异性单抗进行分离培养后的病毒鉴定。结果：制备获得2株单抗,经鉴定其中1株3 E12为EV71特异性单抗;以此单抗建立的免疫荧光方法对EV71感染细胞呈阳性反应,而与柯萨基病毒A16和埃可病毒6等非EV71肠道病毒不反应。从104份手足口病临床标本中共分离到35株病毒,产生肠道病毒典型的细胞病变;用3E12特异性单抗免疫荧光鉴定分离病毒,其中29株为EV71,与RT-PCR验证结果完全一致。结论：成功制备获得EV71特异性单克隆抗体,以此单抗建立的EV71特异性免疫荧光方法敏感性高、特异性强,可用于分离培养EV71的鉴定。     

2011-2012年深圳市重症手足口病的病原学和流行病学分析

目的了解深圳市手足口病(HFMD)重症病例的病原学类型和流行病学特征,为本地区手足口病的预防控制提供理论依据。方法收集2011-2012年深圳市各医院送检的220例手足口病重症病例的粪便样本,应用Real-time RT-PCR技术检测肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)、肠道病毒通用型(EN)。结果 2011-2012年深圳市共发现220例重症手足口病病例,其中,2012年HFMD重症患者数量为2011年的32.53%。220例重症手足口病病例中,EV71型占80.45%,CA16型占5.00%,其他肠道病毒则占13.19%。2011年5、6月为深圳市手足口病重症的高发月份,而2012年5月和7月为高发月份。1岁组重症病例最多有82人,占重症病例总数的37.27%。重症病例人群男性多于女性(1.62∶1)。结论 EV71是引起深圳市手足口病重症病例的最主要原因,其他肠道病毒比CA16更容易引起手足口病重症。     

BD MAX全自动工作站在肠道病毒检测中的优势

目的 比较常规检测方法与BD MAX全自动工作站在手足口病病原学检测中的差异,探讨应用BD MAX全自动工作站检测肠道病毒的可行性。 方法 收集2017年1月—2020年9月昆明市临床诊断为手足口病病例的标本,随机选择136份,以实验室常规采用的实时荧光PCR检测方法和BD MAX全自动工作站方法,对结果进行Cohen′s kappa一致性分析;用无酶水对检测试剂盒提供的U/CA16/EV71假病毒阳性对照做10倍梯度稀释,记录各稀释度检测结果;随机取两份阳性标本,分别用两种方法平行重复检测10次,计算 Ct值的平均值和变异系数,进行重复性分析。 结果 两种方法对肠道病毒U/CA16/EV71的检测结果一致性好,Cohen′s kappa值为0.889,95%置信区间（95%CI）为0.803~0.976;两种方法检测CA16的敏感性一致,常规方法检测EV71和U的敏感性略高于BD MAX方法;在CA16标本的检测中,常规检测方法变异系数CV（通用型）=1.07%、 CV CA16=0.62%,BD MAX方法CV（通用型）=1.63%、CV CA16=2.19%;在EV71标本的检测中,常规检测方法变异系数CV（通用型）=1.28%、 CV EV71=1.20%,BD MAX方法CV（通用型）=2.37%、CV EV71=1.73%。 结论 BD MAX全自动工作站检测结果较为准确,敏感性、重复性好,人工操作少,便于标准化推广,且耗时短,在小批量标本的病原检测及暴发疫情或应急检测中具备较好优势。     

广西746例疑似肠道病毒感染病例病原学监测分析

目的了解广西肠道病毒的感染情况,为制定预防和控制肠道病毒感染策略提供依据。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法,对广西746例疑似肠道病毒感染者咽拭子、疱疹液和粪便标本共1062份进行肠道病毒、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CoxA16）核酸检测。结果共检出485份肠道病毒核酸阳性,阳性率为45.67％,其中EV71核酸阳性187份,阳性率为17.61％,40份为CoxA16核酸阳性标本,阳性率为3.77％。结论1062份标本中EV71核酸的阳性率高于CoxA16;粪便和疱疹液标本的阳性检出率高于咽拭子标本的阳性检出率;CoxA16和EV71是引起儿童手足口病的主要病原体,要加强对CoxA16和EV71的的鉴别诊断。     

肠道病毒71型山东分离株全基因组序列分析

目的 探讨2008年山东省流行的肠道病毒71型(EV71)的基因特征。方法 以2008年山东省分离的一株EV71(JN200804)为样本,采用RT-PCR方法扩增并测定全基因组核苷酸序列,进行同源性比较和种系发生分析。结果 JN200804株的全基因组序列长度为7404个核苷酸,与其他EV71毒株相比,在编码区没有核苷酸的缺失和插入,5′ UTR和3′ UTR的长度和序列有差异。核苷酸同源性比较结果表明,JN200804株与安徽株(Fuyang/17.08/1)、浙江株(Zhejiang08)和北京株(BJ08)的核苷酸同源性均大于95%,与国际标准株BrCr的同源性仅为79.8%。氨基酸同源性比较结果表明,JN200804株与Fuyang/17.08/1同源性高达99.6%,与TW/2086/98同源性最低(94.5%)。根据P1、P2和P3区基因序列构建了种系进化树: JN200804株与C4亚型各毒株(Fuyang/17.08/1、Zhejiang08、BJ08、SHZH03、N3340-TW-02和SHZH98)同属一个分支,核苷酸同源性都在91%以上。结论 JN200804株属于EV71的C4亚型,与AnhuiFY08、Zhejiang08和BJ08的进化关系最为密切。     

东莞市2011年手足口病肠道病毒型别分析

目的了解引起东莞市2011年手足口病疫情的肠道病毒型别。方法采用荧光RT-PCR方法对标本中总肠道病毒、肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16)进行特异性核酸检测。对非EV71非CVA16的其它肠道病毒采用VP4基因测序进行型别鉴定。结果 2011年共检测608份手足口病病例标本,537份为阳性,其中198份为EV71阳性(占36.87%),128份为CVA16阳性(占23.84%),211份为非EV71、非CVA16的其它肠道病毒阳性(占39.29%)。对其它肠道病毒进行VP4基因测序分型,共获得50个可用序列,通过BLAST在线比对确定型别,1例CVA1,43例CVA6,4例CVA10,1例CVA12,1例CVB1。结论 2011年引起手足口病的非EV71非CVA16肠道病毒构成比已超过EV71和CVA16,成为东莞引起手足口病主要病原体之一,其中CVA6构成比较大,值得进一步研究。     

广东五华县手足口病病原学监测研究

目的了解五华县手足口病病原学特征及变化规律,为科学制定防控策略提供可靠依据。方法采集2010--2012年五华县哨点监测医院诊治的普通手足口病病例的粪便标本,使用实时荧光定量PCR法检测总肠道病毒（Ev）、EV71和CoxA16核酸。结果共采集152例病例粪便标本,EV阳性115例,阳性率75．66％,不同年份EV阳性率差异无统计学意义（P〉0．05）;EV71、CoxA16和其他肠道病毒阳性率分别为23．03％、18．42％和34．21％,差异有统计学意义（P〈0．01）。2010年流行优势株为EV71,2011—2012年流行优势株为其他肠道病毒,不同性别、不同年龄EV71、CoxA16和其他肠道病毒阳性率差异均无统计学意义（P〉0．05）。EV71、CoxA16和其他肠道病毒三种型别的肠道病毒全年交替变更流行。结论五华县手足口病流行优势株发生动态改变。加强手足口病病原学监测研究,掌握毒株变化规律,有助于更好地采取预防和控制措施。     

柯萨奇病毒A组16型的研究进展

柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A group 16 strain,CA16)感染在中国很常见,CA16在流行过程中不断发生变异,其致病性与肠道病毒71型有明显差异。CA16可诱导产生多种微小核糖核酸,影响炎性信号通路的传导,导致病理损害的发生。目前已成功建立了小鼠、树鼩、猕猴CA16感染模型,可用于评估抗CA16药物和疫苗效果。检测方面,多重实时逆转录聚合酶链反应可针对手足口病进行高灵敏度检测和快速分型,胶体金免疫层析法可用于现场的快速诊断。多种单价、多价的CA16疫苗在动物实验中诱导出有效的免疫。     

1株肠道病毒71型毒株的分离与鉴定

目的 探讨手足口病病原体肠道病毒71型(EV71)的分离与鉴定方法。方法 采集手足口病疑似病例的咽拭子标本1份接种于人横纹肌肉瘤细胞(rhabdomyosarcoma cell, RD细胞),通过观察病毒的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)来分析EV71的分离效果。分别利用荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫印迹分析(Western Blotting)方法来鉴定EV71病毒特异性核酸和蛋白。扩增EV71VP1区全长基因,对其序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果 手足口病疑似病例咽拭子标本接种RD细胞传代至第2代后出现CPE。RT-PCR和Western Blotting检测结果均显示,感染组RD细胞中有EV71病毒特异性条带,暂命名为EV71分离株2016SHYP001。序列分析结果显示,2016SHYP001株病毒的VP1区核苷酸与C型代表株的同源性较高,为93.1%~98.3%;其中与C4a亚型代表株的同源性最高,为98.3%。进化树分析发现本地流行株与深圳地区流行株的亲缘较近。结论 成功分离出一株新的EV71病毒株2016SHYP001,其株型为C4a亚型。