番禺地区RhD阴性献血者Del表型的基因分型研究

目的 研究分析番禺地区RhD阴性献血者Del表型的基因分型特征.方法 采用120孔微量板法对参加无偿献血的样本进行RhD阴性筛查;采用抗人球蛋白法进行确认,采用吸收放散实验进行Del表型筛选;采用RH基因变异体基因分型检测试剂盒(PCR-SSP法)对确认阴性样本进行RH DEL基因分型.结果 在26 172例献血者中筛选出60例RhD阴性,经确认59例为RhD阴性,阴性频率为0.23％;吸收放散实验检出10例Del表型;基因分型检测出10例RHD 1227A DEL基因型.结论 番禺地区RH DEL发生频率约为16.9％(10/59),以RHD 1227A DEL为主.吸收放散实验联合PCR-SSP法检测,能进一步提高RH DEL鉴定的准确性.     

采用熔解曲线法进行RHD c.1227G>A基因检测研究

目的：建立用于RHD c.1227G>A基因检测的熔解曲线分析方法。方法：根据RHD c.1227G>A基因位点设计并合成序列特异性引物,在荧光定量PCR反应后对产物进行熔解曲线分析,根据熔解曲线峰值的差异进行基因检测结果判断,并与常规序列特异性引物PCR（PCR?sequence specific primer,PCR?SSP）RHD c.1227G>A基因分型方法进行比较;对与血清学结果不一致的标本进行测序分析。结果：在87例血清学初筛为RhD阴性表型的标本中,采用熔解曲线分析法,检测出16例含有RHD c.1227G>A,占比18.4%;与常规PCR?SSP分型结果一致。对1例与血清学吸收放散结果不一致的标本进行RHD exon 9测序分析,证实均为1227A纯合子。熔解曲线分析法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和总符合率均为100%,约登指数为1.0。结论：成功建立用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的熔解曲线分析方法,可以高效、快速地进行RHD c.1227G>A基因检测研究。     

山东临沂地区RhD阴性无偿献血人群中RHD基因变异体的分析

目的 探讨临沂地区RhD阴性无偿献血人群RHD基因的变异体及其分子背景。方法 2011年采集24875人份全血,获得RhD初筛阴性标本111例,提取DNA后,采用序列特异性引物-多聚酶链反应(SSP PCR),进行以下三步实验：① 检测出缺失RHD基因的RhD阴性、DEL1227G＞A突变以及其他变异体;② 鉴定其他变异体的具体类型;③ 对有突变位点未检出型别的变异体进行测序。结果 临沂地区无偿献血人群中RhD阴性比例为0.45%,在111例RhD初筛阴性标本中,检测到1～10外显子全缺失76例,2～9外显子缺失9例,845G＞A突变3例,3～6外显子缺失3例,1227G＞A 突变18例,RHD(711DELC) 1例,Dva(Hus)1例。结论 临沂地区常规血清学筛查RhD阴性无偿献血人群中RHD基因存在多态性。     

RHD1227A型弱D的D抗原表位分析

目的分析携带RHD1227A等位基因的Rh血型弱D型个体的红细胞D抗原表位。方法采用常规血清学方法检测Rh血型D、C、c、E和e抗原表型,间接抗人球蛋白试验(IAT)确认D抗原,序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)测定RHD基因,并检测RHD杂合型。对确认的弱D型,使用12种抗-D抗原不同表位的单克隆抗体,分析红细胞D抗原表位。结果血清学筛选和PCR-SSP检测鉴定出3例携带RHD1227A等位基因的弱D型样本,Rh小因子均为C+c+E-e+,RHD合子型鉴定均为RHD+/RHD-杂合型,提示3例个体基因型为CDe/cde。3例个体红细胞D抗原表位分析显示均具有基本完整D抗原表位,与Rh(D)阳性对照样本相同。结论发现3例RHD1227A型弱D型;不管RHD1227A等位基因表达DEL型或弱D型,其D抗原表位近似,均表达基本完整D抗原,提示该等位基因不同量的表达可能与其它调节因素有关。     

45例有生育史Rh阴性妇女抗-D抗体和RHD基因分析

目的 研究45例多次妊娠Rh阴性妇女产后半年免疫状况和RHD基因背景.方法 常规血清学方法检测Rh(D)抗原, 抗人球蛋白试验(IAT)对Rh(D)抗原确认和IgG抗-D筛查,热吸收放散确认D放散型(DEL); 先后采用商品化试剂盒、序列特异性引物PCR(sequence-specific primer-polymerase chain reaction,SSP-PCR)技术以及DNA序列分析技术,分析样本的RHD基因.结果 45例样本抗人球蛋白试验检测出IgG抗-D阳性5例占总数的11.1%,占真实Rh(D)阴性的16.1%.DEL检出14例(31.1%),抗-D抗体全部为阴性.D基因分析结果显示以DEL(1227A)等位基因为主,同时呈现多态性.结论 真实Rh(D)阴性妇女多次生育存在较高的同种免疫风险易导致新生儿溶血病,必须做好围生期胎-母免疫预防保护,但DEL型妇女或可免除防护.     

1例DEL型个体家系的基因型检测调查

DEL型是人们近年来被重视的RH特殊表型，而在中国人群中首先发现的也是频率最高的DEL型等位基因是第9外显子中存在1227G—A的碱基突变。我们采用PCR—SSP方法对l例DEL型个体的家系进行了调查研究，现将结果报告如下。     

RhD阴性个体遗传多态性与抗-D同种免疫关系研究

目的：研究血清学RhD阴性个体的基因多态性与抗-D同种免疫的关系,探讨不同基因型个体的个性化输血策略。方法用盐水法及间接抗人球方法（IAT）确定RHD阴性个体,采用序列特异性引物（SSP-PCR）技术分析样本的RHD基因同时进行抗体筛选和抗体鉴定确定产生抗-D的样本。结果在有免疫史的336例入组者样品中,249例（74.1%）个体完全缺失RhD基因,l68例（20.2%）个体携带RHD1227A等位基因,19例（5.6%）携带RHD-CE（2-9）-D融合基因。抗体鉴定产生IgG抗-D的个体68例,63例（92.6%）完全缺失RhD基因,5例（7.4%）携带RHD-CE（2-9）-D融合基因,携带RHD1227A等位基因未检出产生抗-D的个体。结论血清学确定RhD阴性个体的RHD基因型具有丰富的多态性和不同的遗传学背景。真实RhD阴性和部分D个体有D抗原免疫时存在同种免疫风险,作为受血者应输用阴性血。基因型为RHD1227A患者不会产生抗-D,在输血时可输用阳性血。     

RhDel表型与RHEC表型的相关性研究

目的分析广东汉族人群RhD阴性个体中,RhDel表型个体RHEC表型的分布情况和两者的相关性,以及PCR—SSP技术在RhDel基因检测中的应用价值。方法对400份广东汉族人群中血型血清学检测为RhD阴性的标本。采用血型血清学方法对RhDel表型和RHEC表型进行检测,并采用PCR—SSP方法进行RHD1227G〉A基因检测。结果在400份RhD阴性标本中,89例（22．25％）检测到RhDel表型,主要分布在CCee、CeEe和Ccee表型的个体,在CCEe、ccEE、ccEe和ccee表型中未发现。在RhDel表型的标本中,同时检测到RHD1227G〉A基因。结论RhDel表型与RHEC表型具有一定的相关性;应用PCR—SSP技术能够对RhDel基因进行检测;与传统的间接抗人球蛋白实验和吸收放散实验相比,PCR．SSP技术能够快速、便捷筛查RhDel献血者和受血者,避免抗．D抗体引发的同种免疫反应和RhD阴性血液的浪费。     

RhDel型与RhC抗原的相关性研究

目的 研究RhDel型与RhC抗原之间的相关性,为临床鉴别RhDel型提供一种更为简便的方法.方法 收集137份样本,血清学方法检测Rh抗原,吸收放散实验鉴定RhDel型,PCR-SSP技术检测RHD1227多态性.结果 137例RhDel型样本中,RhC抗原阳性比例为84.67％ (116/137),RhDel型与RhC抗原具有显著的相关性(P＜0.05).RHD1227A等位基因在RhCcee和RhCCee表型所占的比例分别为65.52％ (76/116)和18.10％(21/116).结论 RhDel个体与RhC阳性表型具有相关性,将RhC表型检测和RHD1227A联合检测用于RhDel型的鉴定,是一种临床可行的方法.     

PCR-SSP RHD基因定型方法的初步应用

目的采用序列特异性引物PCR技术(PCR-SSP)进行RHD基因定型.方法采用新近报道的PCR-SSP RHD定型方法检测10例RhD阳性个体,包括2例哈萨克族人、2例蒙古族人、2例藏族人和4例维吾尔族人,以及11例RhD阴性个体(汉族10例、维吾尔族人1例),并通过测序和内含子检测分析1例汉族个体的RHD基因型.结果全部样品的PCR-SSP检测结果与血清学表型相符,1例汉族RhD阴性个体鉴定为D放散型,携带RHD1227A等位基因,1例个体的检测结果提示携带融合RHD基因.测序分析显示该融合基因的第1、2和第10外显子序列与正常RHD基因相应外显子相同,而缺失其余外显子,由于RHD基因和RHCE(e)基因的第2外显子序列相同,笔者采用PCR方法检测RHD基因第2内含子,结果为阴性,说明该个体携带的融合基因为RHD-CE(2-9)-D2等位基因.结论 PCR-SSP可用于中国人Rh血型D抗原基因定型.     

安徽地区RHD(-)个体D基因外显子多态性检测

目的分析安徽地区RHD(-)个体的D基因的多态性。方法用PCR-SSP技术,对50例经血清学试验证实的真实RHD(-)个体3例弱D表现型个体15例DEL型个体进行外显子检测。结果发现本地区RHD(-)个体D基因外显子存在明显的多态性:15例DEL型个体D基因外显子均全部完整存在;3例弱D型个体中有2例存在完整的D基因,1例为缺失大部分外显子的DVIⅢ型;50例真实RHD(-)个体中,90%为外显子完全缺失,4%为外显子完整存在,但不表达D抗原;4%为缺失大部分外显子(存在第1、10外显子),不表达D抗原;另有2%为缺失两边外显子(存在第3、4、5外显子),不表达D抗原。结论PCR-SSP技术可用于RHD基因的研究,在本地区血清学鉴定的RHD阴性个体中存在较高比例的DEL型个体,同时,常规血清学RHD(-)个体D基因存在多态性。     

安徽地区RHD（-）个体D基因外显子多态性检测

目的分析安徽地区RHD（-）个体的D基因的多态性。方法用PCR—SSP技术，对50例经血清学试验证实的真实RHD（-）个体3例弱D表现型个体15例DEL型个体进行外显子检测。结果发现本地区RHD（-）个体D基因外湿子存在明显的多态性：15例DEL型个体D基因外显子均全部完整存在；3例弱D型个体中有2例存在完整的D基因，1例为缺失大部分外显子的D^Ⅵ Ⅲ型；50例真实RHD（-）个体中，90％为外显子完全缺失，4％为外显子完整存在，但不表达D抗原；4％为缺失大部分外显子（存在第1、10外显子），不表达D抗原；另有2％为缺失两边外显子（存在第3、4、5外显子），不表达D抗原。结论PCR—SSP技术可用于RHD基因的研究，在本地区血清学鉴定的RHD阴性个体中存在较高比例的DEL型个体，同时，常规血清学RHD（-）个体D基因存在多态性。     

ABO疑难血型基因分型研究

目的:研究ABO血型基因分型的意义。方法:采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)基因定型方法对ABO疑难血型进行检测。结果:本研究建立了稳定的PCR-SSP基因分型方法,对10例疑难标本准确进行了基因分型。结论:ABO型基因分型技术可以应用于ABO血型疑难样本检测。     

鲑鱼精DNA提高人工突变质粒模板中单核苷酸多态性位点识别的特异性及其应用

目的探讨等位基因特异性聚合酶链反应（AS-PCR）检测单核苷酸多态性（SNP）的方法,研究鲑鱼精DNA对优化等位基因特异性引物的作用。方法对鲑鱼精DNA设一系列浓度梯度,分别进行AS-PCR后观察电泳结果。结果鲑鱼精DNA能显著提高识别基因SNP位点的特异性,在25μl的质粒检测系统中加入50 ng的鲑鱼精DNA结果最佳。结论鲑鱼精DNA加入到质粒检测系统中可有效测试所设计的检测引物的特异性,达到模拟基因组DNA的目的 。     

Molecular basis of weak D and DEL in Han population in Anhui Province, China

Background  Rh blood group system is the most complex and immunogenetic blood group system. Prevalent RHD alleles varied in different populations. The purpose of this study is to determine the molecular basis of weak D and DEL phenotype in Anhui Chinese Han population.

Methods  The D antigen was determined with IgM monoclonal anti-D conformed to the guidelines for donor testing in China. Weak D samples were identified by an indirect antiglobulin test. DEL phenotype was determined by adsorption and elution test. All the RHD 10 exons were screened by PCR with sequence-specific priming or sequenced for the first-time donors who typed weak D, DEL or D negative by serologic test.

Results  Of all the 30 799 blood donors, 155 blood samples were found D negative with IgM anti-D; 34 blood samples were found D positive by indirect antiglobulin test or absorption elution test. RHD alleles were identified by nucleotide sequencing. Total 4 RHD alleles were found including two new. One hundred and twenty of 155 (77.4%) of the serologically D negative samples lacked the RHD gene. One D negative was RHD(615del2). Thirty-two of 155 (20.6%) carried RHD(K409K) among them one carrying 1227G>A and 845G>A. Two of 155 (1.3%) was weak D type 15.

Conclusions  In this study at the molecular level, all DEL phenotype is RHD(K409K); weak D type 15 is the prevalent weak D allele in Anhui Chinese Han population. Additionally, an improved more efficient method was adopted to amplify all the RHD exons in one PCR program. Our study added to the understanding of molecular mechanisms underlying D antigen expression in Anhui Han population and provided useful information for adopting suitable genotyping strategies in routine use.     

蚌埠地区124例RhD阴性献血者的RHCE表型及DEL型的分布与基因研究

目的研究蚌埠地区RhD阴性献血者的RHCE表型,DEL的表型、分布和RHD基因的外显子存在情况。方法通过使用抗-D（IgM）试剂筛查出RhD（IgM）阴性献血者;再使用3个厂家或不同批号的抗-D（IgG）试剂,经间接抗人球蛋白试验（IAT）确认RhD阴性样本;然后采用吸收放散试验筛选其中的DEL型,同时检测其表现型,并对15份DEL型样本采用PCR方法进行基因扩增和产物分析。结果124例RhD阴性献血者中ccee表型为77例（62．1％）,Ccee为38例（30．6％）,CCee为8例（3．3％）,ccEe为1例（0．1％）;DEL型共15例占RHD阴性样本的12．1％,其中ccee2例,Ccee11例,Ccee2例;并检测出15例DEL型样本的5、4、5、6、7、9、10共7个特异性外显子。结论蚌埠地区RhD阴性献血者中Rh表型存在多态性,eeee表型的比例达62．1％;DEL型的比例低于相关报道,DEL型具有全部RHD基因外显子。     

45例有生育史Rh阴性妇女抗-D抗体调查和RHD基因分析

目的 研究45例多次妊娠Rh阴性妇女产后半年免疫状况和RHD基因背景。方法 常规血清学方法检测Rh(D)抗原,抗人球蛋白试验（IAT）对Rh(D)抗原确认和IgG抗-D筛查,热吸收放散确认D放散型（DEL）;先后采用商品化试剂盒、序列特异性引物PCR(sequence-specific primer-polymerase chain reaction,SSP-PCR)技术以及DNA序列分析技术,分析样本的RHD基因。结果 45例样本抗人球蛋白试验检测出IgG抗-D阳性5例占总数的11.1%,占真实Rh(D)阴性的16.1%。DEL检出14例(31.1%),抗-D抗体全部为阴性。D基因分析结果显示以DEL(1227A)等位基因为主,同时呈现多态性。结论 真实Rh(D)阴性妇女多次生育存在较高的同种免疫风险易导致新生儿溶血病,必须做好围产期胎－母免疫预防保护,但DEL型妇女或可免除防护。     

高通量红细胞血型基因分型的多重连接依赖的探针扩增技术在一例抗Di~a新生儿溶血病诊断中的应用

目的运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖的探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)辅助诊断一例罕见的由抗Di~a导致的严重核黄疸新生儿溶血病。方法运用传统的血型血清学方法对导致新生儿溶血病相关红细胞血型抗体进行鉴定,运用MLPA对患儿及其父母的超过40种红细胞血型抗原进行基因分型,对鉴定的抗体进行效价分析。结果血型血清学检测表明患儿体内含有针对某种低频抗原的抗体,MLPA基因分析结果提示母婴红细胞MNS血型系统及Diego血型系统抗原不匹配,可能存在抗N或抗Di~a,经进一步的血型血清学检测,证实母亲及患儿血清中存在抗Di~a,并且其母亲血清抗Di~a效价为1:32。结论抗Di~a可引起包括核黄疸在内的严重新生儿溶血病;高通量红细胞血型基因分型的MLPA技术能够协助并有效解决临床疑难样本稀有血型鉴定;针对国人的Di~a阳性的试剂红细胞应该常规应用于日常的抗体筛查工作中。     

献血者Rh(D)阴性DEL表型调查研究

目的通过对Rh（D）阴性献血者的试验检测，了解DEL表型。方法用盐水法、木瓜酶法3家试剂检测RhD（-）及其RhCcDE4个因子；阴性者用谱细胞进行抗体筛查；红细胞用抗-D作吸收放散试验，观察试验结果；吸收前、后抗-D抗体检测其效价。结果无偿献血者16935例，其中Rh（D）阴性75例，占4．42％；吸收放散试验：75例经吸收放散试验检测，阳性标本47例、占62．67％，阴性28例；吸收前、后抗体效价比较：吸收后抗体效价不变的53例，效价下降的有22例。结论在鉴定Rh（D）阴性中，DEL表型应用血型血清学吸收放散的方法正确鉴定；在临床输血中，含有弱D与DEL的个体，反复多次输血后就有产生抗体的可能。含有弱D与DEL的个体，作为供者应该当成阳性．作为受者应该当成阴性，防止因输血产生免疫性抗体，引起输血反应。     

PCR-SSP法HLA-A、B基因分型与血清学分型的比较

目的 比较聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)进行HLA-Ⅰ类A、B抗原位点分型的准确性，并探讨血清学分型错误发生的原因。方法 用PCR-SSP以及单克隆抗体血清学分型技术对HLA-A、B分型并比较。结果 34例样本PCR-SSP基因分型无假阳性和假阴性出现。PCR-SSP法与血清学比较，血清学检出错误或漏检率分别为HLA-A位点23.5％，B位点26．5％。血清学发生错误或易混淆的抗原有：A2和A68、A32和A33，B5、B60和61。结论 PCR-SSP法进行HLA-A、B抗原等位基因分型具有分辨率高、特异性强、重复性好、实验过程简捷快速、分型结果较血清学更加准确可靠的优点。