幽门螺杆菌疫苗候选抗原lpp20基因的克隆表达及其纯化研究

目的克隆表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)lpp20基因,为筛选预防或治疗幽门螺杆菌感染的疫苗保护性抗原奠定基础.方法用PCR方法从临床分离株9806的染色体DNA中扩增出lpp20基因片段,将目的基因插入表达载体pET22b中,重组载体pET22b-Lpp20经DNA测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌E. coli.BL21(DE3),IPTG诱导表达.采用镍离子亲和层析纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果PCR扩增的lpp20基因长度为528bp,经酶切和测序分析,插入到载体的基因片段与GenBank公布的序列相似性达99%,SDS-PAGE显示,经IPTG诱导目的蛋白占总蛋白的19.7%,纯化后,蛋白纯度达80%以上.Western blot检测该蛋白与兔抗Hp的多克隆抗血清发生结合反应.结论成功构建了lpp20表达载体pET22b-Lpp20,并在大肠杆菌中表达.     

幽门螺杆菌UreB基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:为了研制口服幽门螺杆菌疫苗,构建表达幽门螺杆菌的保护性抗原成分UreB蛋白的基因工程菌株.方法:用PCR方法扩增UreB基因片段,将其克隆至pET28a质粒上,转化E.coli BL21(DE3),经IPlG诱导表达,得到rUreB蛋白.结果:经测序,UreB基因片段由1710bp组成,编码569个氨基酸残基.与GenBank报道的脲酶核苷酸序列同源性最高为97%,氨基酸同源性为99%.经SDS-PAGE检测表明,rUreB基因表达的蛋白质相对分子质量约为6.4 kDa,含量占细菌总蛋白的29.5%.经Ni2 柱亲和层析、GSH复性后,rUreB表现了脲酶活性,活性为32.5 U/mg.结论:表达产物确为幽门螺杆菌脲酶B亚基,这为研制幽门螺杆菌口服疫苗打下了基础.     

幽门螺杆菌hp1188基因的原核表达

目的:重组表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)hp1188基因,为研究该基因所编码蛋白在H.pylori的黏附过程中的作用奠定基础.方法:以H.pylori标准株NCTC 11637基因组DNA为模板,PCR扩增hp1188基因片段,克隆至质粒pQE-30中获得重组质粒pQE30-hp1188,经DNA测序确认后将重组质粒转化大肠杆菌DH5 α,IPTG诱导表达.Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化表达蛋白,SDS-PAGE检测表达,Western blot鉴定相应抗原表位.结果:扩增的hp1188基因片段全长810 bp,与基因文库中的hp1188基因同源性达98%.SDS-PAGE显示表达产物相对分子量约为30 600 Dalton,与预期相符;大肠杆菌裂解液中表达产物接近可溶性蛋白总量的一半,但沉淀中仍能检测到表达蛋白.目标蛋白纯化后均一性接近90%,Western blot证实与多克隆抗体有良好结合能力.结论:成功克隆了hp1188基因,并在大肠杆菌DH5α中获得高效表达.     

幽门螺杆菌甲硝唑诱导耐药的研究

目的通过甲硝唑诱导耐药这一方法来分析rdxA基因突变情况的可行性.方法用非混合感染、敏感的H.pylori菌株进行甲硝唑诱导实验,使其由敏感型转变为耐药型;再提取DNA,PCR扩增诱导前后rdxA基因并测序.结果甲硝唑诱导菌株12株,4株获得成功,诱导前后的M IC值增加了16~64倍;连续传代3次后,M IC值保持不变.诱导前后敏感型与耐药型菌株rdxA基因序列仅有0.2%~0.8%的差异,而不相关菌株间则有2.2%~2.7%的差异.结论甲硝唑诱导实验可以在较短时间内获得稳定的甲硝唑耐药性,并能排外不同菌株间存在差异的影响,有望成为一种研究甲硝唑耐药机制的好方法.     

幽门螺杆菌融合基因vacA-hpaA的克隆及在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达

目的 构建幽门螺杆菌融合基因vacA-hpaA的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒,并观察其在大肠杆菌(E.coli)和双歧杆菌(B.bifidium)中的表达情况.方法 通过PCR得到hpaA-vacA融合基因,将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-hpaA-vacA,电穿孔转化入大肠杆菌BL21和双歧杆菌.转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达的重组蛋白.结果 构建了重组质粒pGEX-vacA-hpaA,vacA-hpaA融合基因的分子量约为1548bp;经SDS-PAGE分析,在大肠杆菌中表达出85kD的融合蛋白,表达的蛋白约占细菌总蛋白的20.5％;在双岐杆菌中也能得到正确表达,但表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约8.5％.Western blotting结果确认了该条带为hpaA-vacA融合基因的产物.结论 构建的重组质粒pGEX-hpaA-vacA能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达.     

幽门螺杆菌致病相关基因的研究

作为人的胃、十二指肠疾病发生发展中重要的致病菌,幽门螺杆菌(Hp)由于其特有的生存方式、多变的基因结构特征、感染结局的多样性、与人类共生和进化的密切关系等等,而成为当前研究的热点。Hp致病机理的研究、特别是Hp感染与胃癌发生相关的分子机制研究,是目前Hp研究的主要方面,也是近年生物学进展较快的领域之一。     

乳糖诱导对幽门螺杆菌UreB、HpaA和大肠杆菌LTKA63、LTB重组蛋白表达的影响

目的:探讨乳糖诱导幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(ureB)、黏附因子(hpaA)和大肠杆菌肠毒素B亚单位(ltB)、A亚单位突变体63(ltKA63)重组基因表达的效果及最佳表达条件.方法:采用BIO-RAD凝胶图象分析系统测定表达的目的重组蛋白产量.采用SDS-PAGE检测不同乳糖浓度、诱导时间和温度对不同生长阶段工程菌重组蛋白表达量的影响,并与异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)比较.结果:乳糖较IPTG更为有效地诱导rHpaA、rUreB、rLTB、rLTKA63的表达.37℃诱导的目的重组蛋白表达量明显高于28℃.rHpaA表达的最佳条件为起始菌液OD600值0.8、50 g/L乳糖,诱导4 h;rUreB和rLTB均为起始菌液OD600值1.2、100 g/L乳糖,诱导5 h;rLTKA63为起始菌液OD600值0.8、100 g/L乳糖,诱导4 h.结论:乳糖较IPTG更有效地诱导上述重组基因表达目的蛋白,且无毒和廉价,为幽门螺杆菌基因工程疫苗工业化生产奠定了有利的基础.     

幽门螺杆菌CagA基因的克隆

目的 为在大肠杆菌表达幽门螺杆菌ＣａｇＡ蛋白,建立ＥＬＩＳＡ法检测ＣａｇＡ抗体,克隆幽门螺杆菌ｃａｇＡ基因片段。方法 根据ｃａｇＡ基因序列,设计引物ＰＣＲ扩增ｃａｇＡ基因片段,用Ｔ－Ａ克隆的方法将ＰＣＲ产物克隆入质粒载体ｐＧＥＭ－Ｔ,并转化大肠杆菌ＪＭＩ１０９。结果 经蓝白斑筛选,ＰＣＲ及限制性内切酶酶切分析,获得ｃａｇＡ基因片段的克隆,序列测定结果与文献报道一致。结论 ＰＣＲ产物可采用Ｔ－Ａ法克     

幽门螺杆菌的vacA基因亚型及其致病性

自 198 3年Warren和Marshall首先从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检标本中分离到幽门螺杆菌 (Helicobactepy lori,Hp)以来 ,已有大量研究显示慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌及胃黏膜淋巴组织淋巴瘤的发生发展与Hp感染密切相关[1,2 ] 。 1994年世界卫生组织将Hp列为 1类致癌物[3] 。Hp感染十分普遍 ,在发达国家人群中 ,Hp感染率为 3 0 % -5 0 % ,发展中国家为 60 % - 70 % ,但仅有 15 %Hp感染者出现临床症状。Hp感染者是否发病与Hp菌株的毒力、宿主遗传易感性、环境等诸多因素有关。随着分子生物学的迅速发展 ,人们已成功地测定出该菌的基…     

幽门螺杆菌毒素相关基因的克隆、测序及表达

目的　分段扩增、克隆幽门螺杆菌毒素相关基因cag A中间区 cag1,cag2 ,并利用大肠杆菌系统表达 .方法　PCR法扩增 cag A基因 ,双脱氧中止法测序正确后 ,克隆入大肠杆菌表达载体 p BV2 2 0 ,受控于 PRPL 启动子 ,转化大肠杆菌 DH5α,4 2℃进行温度诱导 .结果　 PCR分段扩增出 cag A中间区基因 cag1,cag2 ,分别为 975 ,75 5 bp,克隆入 p UC19质粒 ,测序正确 ;在 p BV中构建 cag1,cag2的重组表达载体p BVcag A1,p BVcag A2 ,工程菌诱导后 SDS- PAGE显示新生表达蛋白带 ,Mr:Cag136× 10 3,Cag2 2 7.9× 10 3,均与预期的 cag A蛋白 Mr一致 ,约占菌体总蛋白的 36 %和 2 4 % .结论　成功克隆分段扩增的 cag A中间区基因 ,并可在大肠杆菌DH5α中高效表达 .     

人工合成人恶性疟原虫58肽抗原基因在大肠杆菌中的表达

使用DNA合成仪合成的人恶性疟原虫58肽抗原基因,与大肠杆菌表达性载体质粒PWR450—Ⅰ重组,转化到大肠杆菌JM83中。用斑点杂交技术和电泳分析DNA方法筛选出阳性重组转化菌株,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳分析,证明合成基因在大肠杆菌中表达,产生与β—半乳糖苷酶融合的多肽。     

幽门螺杆菌尿素膜通道基因的克隆和表达

目的 克隆幽门螺杆菌(Hp)尿素膜通道基因(ureI)和构建能表达UreI蛋白的原核表达工程菌,并初步研究产物的表达特性和免疫特性.方法 用PCR方法从Hp基因组中克隆ureI基因,构建原核表达重组质粒pET32a/ureI,双酶切和测序鉴定正确后,重组质粒转染大肠杆菌BL21 (DE3),构建高效表达UreI的工程菌BL21 /UreI.不同温度条件下用1.0 mmol/LIPTG诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE和Gel-Pro Analyzer 4分析重组蛋白的表达,并用Western blotting对其免疫原性进行分析.结果 克隆到约650 bp的基因片段,测序结果与GENBANK中对应菌株的ureI序列100%同源,与其他Hp的序列同源性不低于98.5%.工程菌BL21 /UreI含完整的ureI基因.在37℃、1.0 mmo1/LIPTG诱导14 h后,重组蛋白表达量可达菌体总蛋白的20.2%.分析表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,经免疫印迹证实该重组蛋白有一定的免疫反应性和特异性.结论 成功构建了Hp ureI基因的原核表达载体,该载体可高表达有免疫特性的重组蛋白,为进一步研究Hp在胃的定植机制和抗Hp新药奠定了基础.     

人乳头瘤病毒18型E6基因在大肠杆菌中的克隆与表达

本文以表达性质粒pBD_2为载体,克隆了人乳头瘤病毒第18型(HPV_(18))E_6基因。经DNA分析及蛋白产物分析,筛选出一株重组子(pDV_(11)),可表达分子量与预计相符的新生蛋白质,并绘制了其限制酶酶切图谱。纯化表达蛋白后,经对流免疫电泳鉴定。证明其为预计表达的βga1/E_6融合蛋白。     

幽门螺杆菌flaA基因在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：观察幽门螺杆菌(H．pylori)flaA基因在大肠杆菌中的表达。方法：用PCR方法扩增flaA基因,然后插入原核表达载体pMAL-c2x进行融合表达。采用蛋白印迹法对表达产物进行鉴定。结果：特异PCR和酶切鉴定证实flaA基因克隆入表达载体,并以融合蛋门形式MBP-FLA高效表达,约占细胞总蛋白的28％。该融合蛋白可与H.pylori阳性病人血清和小鼠H.pylori全菌抗体发生特异反应。结论：成功构建了能高效表达H．pylori FlaA蛋白的重组质粒,为H．pylori多价基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

幽门螺杆菌CagA基因的原核表达及抗原性测定

目的：合成胃癌相关幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的 CagA基因片段,建立原核表达系统,鉴定重组表达产物的抗原性。方法：选取前期研究确定的与胃癌相关的H.pylori CagA基因片段,优化设计并合成CagA基因,将合成的CagA基因从pUC57-CagA质粒中切出,用表达载体pET32a携带该基因转化宿主菌BL21(DE3),通过氨苄青霉素抗性筛选和菌落PCR挑选出阳性克隆pET32a-CagA;以IPTG诱导含pET32a-CagA的宿主菌表达融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析CagA蛋白表达情况,用Western印迹鉴定融合蛋白的抗原性。结果：设计并人工合成了CagA基因片段,序列测定结果显示,合成的CagA基因序列与设计的序列（AF289435）基本一致;成功构建pET32a-CagA原核表达质粒,对应蛋白序列与AAG09884同源性为100%;含pET32a-CagA的BL21(DE3)宿主菌经IPTG诱导后能表达CagA融合蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳分析结果表明,融合蛋白相对分子质量大小与预期一致(45 kD);Western印迹检测结果显示该融合蛋白可与抗H.pylori全菌抗体结合反应。结论：本实验构建的原核表达系统表达的CagA融合蛋白具有良好的抗原性,为临床胃癌相关H.pylori菌株的筛选和针对性治疗奠定了基础。     

Cloning of the Gene Encoding Urease Subunit.A in Helicobacter Pylori

Themostefficient ,economicalapproachwithlowriskofadversereactiontothepreventionandcon trolofHelicobacterpylori (H .pylori)infectionistousevaccine .UreaseanditssubunitAisproventobethemainvaccineagainsttheinfectionofH .pylori.Inordertoexpresstheureasesubuni…     

大鼠RGS4基因的克隆及在原核中的表达

目的构建pGEX4T-1-RGS4载体,并检测融合蛋白GST-RSG4在原核中的表达水平。方法采用RT-PCR方法,将克隆SD大鼠G蛋白信号转导调节因子(regulator of G protein signaling4,RGS4)基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pGEX4T-1中,IPTG诱导原核表达,通过Western blot检测融合蛋白GST-RSG4的表达水平。结果成功构建了pGEX4T-1-RGS4载体;经IPTG的诱导,RGS4可与GST以融合蛋白的形式高效表达。pGEX4T-1-RGS4在原核内表达产物相对分子质量约为50×103,与预期融合蛋白大小一致。结论构建的重组质粒能够在大肠杆菌中高效表达。     

大鼠β细胞素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的: 获得大量重组大鼠β细胞素(BTC),为研究β细胞素的功能及制备其抗体奠定基础. 方法: 利用PCR方法从大鼠肾组织扩增出544 bp的β细胞素基因片段并按读框克隆到原核表达载体pET28a( )上,得到重组质粒pET28a-rBTC,转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,IPTG诱导β细胞素蛋白表达,SDS-PAGE 和Western blot检测. 结果: 经IPTG诱导后,有明显的目的蛋白表达,分子量符合β细胞素;表达的蛋白主要以包涵体形式存在;表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%;目的蛋白与抗His标签抗体具有良好的反应原性. 结论: 大鼠β细胞素基因的克隆与表达为进一步开展β细胞素蛋白功能和胰腺干细胞的研究奠定了基础.     

牛乳铁蛋白素基因及其突变基因在大肠埃希菌中的融合表达

目的构建牛乳铁蛋白素基因（LfcinB）及牛乳铁蛋白素突变基因（mLfcinB）的表达载体，建立在大肠埃希菌中融合表达的方法。方法依据大肠埃希菌偏爱密码子设计LfcinB和mLfcinB，进行克隆扩增并测序，构建LfcinB和mLfcinB的融合表达载体并转化人大肠埃希菌，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，产物经谷胱甘肽-琼脂糖凝胶法纯化。结果成功构建了融合表达载体pGEX-4T-1-LfcinB和pGEX-4T-1-mLfcinB，表达载体转化大肠埃希菌BL21，经IPTG诱导3h后LfcinB和mLfcinB融合蛋白表达率约为30％，洗脱纯化后产物约为60％。聚丙烯酰氨凝胶电泳显示融合蛋白为29kDa，主要以包涵体形式存在，谷胱甘肽-琼脂糖凝胶纯化后得到3．1kDa的目的蛋白。结论LfcinB及其突变基因在大肠埃希菌中的融合表达可提高LfcinB的表达率。