网织红细胞与骨髓瘤细胞杂交的胞质杂交体细胞血红蛋白的PAGE电泳分析

小鼠网织红细胞(RM)×人早幼粒白血病细胞突变株(Hb-60-AR);兔网织红细胞(RR)×小鼠BW-胸腺淋巴肉瘤细胞(BW5147);大鼠骨髓有核红细胞(RNR)×小鼠SP2/0浆细胞瘤细胞等不同异种杂交组合的胞质体杂交细胞珠蛋白基因产物血红蛋白的PAGE电泳分析,结果表明在正常状态下检测不到血红蛋白的肿瘤细胞,一旦与网织红细胞或有核红细胞融合后,则能持续地出现血红蛋白,进一步证明哺乳类红细胞胞质因子具有调节基因活动,激活珠蛋白基因表达的作用,不同种属红细胞胞质因子似无种属特异性。     

网织红细胞胞质因子调控肿瘤细胞基因表达的核酸杂交分析 Ⅱ.myc癌基因的表达状态

本实验用Northern杂交方法,以c-myc癌基因为探针,对人和小鼠骨髓瘤细胞以及杂交后的同种和异种胞质体杂交细胞和异种杂交细胞进行了癌基因表达的核酸分子杂交分析。结果表明,在小鼠-小鼠,小鼠-兔及人-小鼠的胞质体杂交细胞(BW-RM,BW-RR,HMy-RM)中均未检测到myc癌基因的表达产物。但自15代以后开始出现微弱或可测的表达活性,并随传代而有上升的趋向。同样,在小鼠浆细胞瘤(Sp2/o)与大鼠有核红细胞(ER)的异种杂交中,杂交细胞(SpER)的第4代和第7代细胞中亦未检查到myc基因转录物。表明细胞杂交后,myc基因受到了抑制。这种抑制作用似无种属特异性。这一结果提示红系细胞内“胞质因子”对肿瘤细胞原来活化的myc基因具有抑制作用,并与杂交细胞的恶性下降有关。论文对胞质因子对癌基因表达的调控作用及其分子生物学机理进行了讨论。     

兔网织红细胞胞质因子对小鼠骨髓瘤细胞恶性调控的研究

以无细胞核的兔网织红细胞与小鼠骨髓瘤细胞BW(胸腺淋巴肉瘤)及SP2/0(浆细胞瘤)分别进行异种杂交。实验结果表明杂交后形成的二种胞质杂交细胞(BW-RR及SP 2/0-RR)均呈现下列去恶性分化特征;①细胞分裂指数、~3H-TdR标记指数及生长曲线明显下降。其中SP2/0-RR的核分裂活动受到明显的抑制;②在软琼脂培养中不形成集落;③异种移植至裸鼠不长瘤;④染色体数量减少,众数及畸变率下降;⑤出现正常分化的珠蛋白基因产物血红蛋白和HGPRT基因的酶产物,珠蛋白探针分子杂交实验证明有珠蛋白基因的表达。为不同种属红细胞胞质因子调控肿瘤细胞恶性提供了证据。论文对胞质因子调控基因表达、恶性逆转及其在红细胞发生过程中自然去核的物质基础等问题进行了讨论。     

网织红细胞与骨髓瘤缺陷株细胞杂交前后HGPRT酶基因产物的测定

本研究建立了HGPRT酶的测定方法,对自然去核的哺乳类网织红细胞与小鼠骨髓瘤及人肿瘤突变型细胞杂交前后的HGPRT基因产物进行测定结果表明:①自然去核后的兔和小鼠网织红细胞质中含有高活性的HGPRT酶,其活性浓度与有细胞核的人早幼粒白血病细胞HL-60及人胃癌823细胞相当;②无核和缺失HGPRT酶基因定位的X染色体的上述网织红细胞分别与HGPRT阴性的小鼠骨髓瘤Bw及人早幼粒白血病的HL-AR突变株细胞杂交后,获得HGPRT阳性的胞质体杂交细胞。这些杂交细胞及其子代均出现中等阳性的HGPRT酶活性。提示用无细胞核而含基因产物的胞质体可能激活或诱导宿主细胞相应基因进行表达。     

胞质因子对肿瘤细胞恶性的调控研究——小鼠骨髓瘤细胞与网织红细胞胞质体的胞质杂交实验

本文选用无细胞核而富含珠蛋自mRNA的正常小鼠网织红细胞与骨髓瘤细胞系中的BW胸腺淋巴肉瘤细胞系、NS-1浆细胞癌细胞系及P388淋巴瘤细胞等分别进行胞质杂交实验,以研究胞质因子调控肿瘤细胞恶性的可能性。实验结果表明3种淋巴瘤细胞在并入网织红细胞胞体后所形成的杂交细胞呈现下列去恶性化特征:1)杂交细胞出现组织化学反应及超微结构形态改变;2)细胞分裂指数及生长速度明显下降;3)作异种移植至裸鼠后丧失发生肿瘤能     

人浆细胞瘤与小鼠网织红细胞异种杂交的恶性调控研究

用人浆细胞瘤细胞与小鼠网织红细胞异种杂交获得成功。杂交细胞可以传代,出现下列明显的肿瘤细胞去恶性化特征:①生长速度及~H-TdR并合率明显下降;②出现红细胞特异的遗传标记——血红蛋白;③出现慢型迁移率的葡萄糖-6-磷酸异构酶Gpi;④在软琼脂培养基中不形成细胞集落;⑤异种移植至裸鼠后丧失发生肿瘤的能力。表明红细胞胞质体杂交模型可以用作研究细胞恶性调控的实验系统。对调控肿瘤细胞恶性表型的可能机理进行了讨论。     

人白血病突变株红细胞胞质杂交体的建立及在恶性调控研究中的应用

细胞分化、基因表达和恶性表型的调控是当代细胞与分子生物学领域中的重大研究课题。近几年来中国医学科学院基础医学研究所细胞生物学室利用天然无核的小鼠或兔的网织红细胞与小鼠骨髓瘤细胞系(BW-5147,NS-1,Sp2/0和p388)或人骨髓瘤细胞系(HL-60-AR,HMY)融合,建立了7株可传代和可逆转恶性表型的红细胞胞质杂交模型,以及1个以大鼠成红细胞与小鼠Sp2/0细胞融合的杂交瘤。这些胞质杂交体,包括遗传型相同的小鼠-小鼠同种间的胞质杂交系(BW-R,     

网织红细胞作为转基因靶细胞的实验性研究

采用无核兔网织红细胞作为外源基因导入的靶细胞，以β－半乳糖苷酶基因的真核表面质粒作为报告基因，研究网织红细胞作为外源基因表达宿主的可能性。结果表明，β－半乳糖苷酶基因可以在兔网织红细胞中有限表达。     

人肺巨细胞癌突变株HDM5和小鼠网织红细胞融合后珠蛋白基因表达的研究(简报)

为证实哺乳类红细胞调节因子对珠蛋白基因的调控作用,用人肺巨细胞癌突变株HDM5和小鼠网织红细胞进行细胞融合。亲代肿瘤细胞株HDM5是由人肺巨细胞癌细胞株PLA801—D95经N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)诱变,8-杂氮乌嘌呤(8-AG)筛选而获得的次黄嘌呤乌嘌呤磷酸核糖转移酶缺失(HGPRT~-)的突变株。亲代正常细胞网织红细胞由盐酸苯肼制造的昆明种小鼠获得。两者用聚乙二醇(PEG1000)促融,融和细胞经HAT培养基选择后获得数个杂种细胞克隆,定名为HDM5-MR     

人β-珠蛋白小分子RNAs调控γ-珠蛋白基因表达及开关机制研究

目的从RNA角度研究珠蛋白基因表达调控,探讨人γ-珠蛋白向β-珠蛋白转换的分子机制,为β-珠蛋白生成障碍性贫血的分子治疗提供新靶位,并为诱导肿瘤细胞分化治疗肿瘤提供依据。方法通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)比较白血病和非白血病患者外周血白细胞血红蛋白基因分子水平的差异,将β-珠蛋白基因转染K562细胞,运用噻唑蓝比色法、细胞流式分选等技术检测β-珠蛋白基因对K562细胞增殖、细胞周期与凋亡的影响,通过Western blot及RT-PCR分别从蛋白质水平和mRNA水平分析其调控γ-珠蛋白基因表达的作用,同时运用生物信息学预测人β-珠蛋白基因可以产生具有基因表达调控作用的小分子RNAs。结果白血病患者血红蛋白A1、血红蛋白B、血红蛋白E1、细胞珠蛋白、脑红蛋白的mRNA表达均显著低于非白血病患者(P<0.05)。β-珠蛋白基因能以时间依赖的方式诱导K562细胞增殖受抑,并在第7天达到最佳时间效应。用RT-PCR检测转染后K562细胞α、β、γ-珠蛋白等mRNA的表达,发现β-mRNA上升导致转染后的K562细胞γ-珠蛋白表达下调,同时α-珠蛋白表达上调;β-珠蛋白基因可能产生作用于γ-珠蛋白的小分子RNA,符合条件的二级结构在热力学上稳定,空间位阻也在一定范围内。结论白血病患者外周血白细胞珠蛋白基因低表达,β-珠蛋白基因能以时间依赖的方式诱导K562细胞增殖受抑,其高表达可诱导K562细胞增殖受抑和凋亡,并抑制K562细胞γ基因表达,通过小分子RNAs调控γ-珠蛋白基因表达沉默,有助于揭示人γ-珠蛋白向β-珠蛋白转换的基因表达调控及开关机制。     

体内合成人血红蛋白转移基因鼠

将人α-珠蛋白及β-珠蛋白基因分别融合于两个红细胞系特异性的Ⅰ型脱氧核糖核酸酶(DNAase)超高敏感的游区位点。此位点正常位于人β-珠蛋白基因的上游50千对碱基。将这两个构造物同时注入鼠的受精卵内,并在发育的转移基因动物中分析其表达情况。具有完整的转移基因拷贝的小鼠在红细胞组织中特异表达了高水平的正确启动的人α-珠蛋白及β-珠蛋白信使RNA。在成年人的红细胞中形成了     

2型重组腺相关病毒介导的β-地中海贫血基因治疗实验

目的探讨2型重组腺相关病毒(rAAV2)能否有效转染重型β-地中海贫血患者造血细胞,通过体外途径基因治疗地中海贫血。方法 6只BALB/c裸小鼠分为转染组(n=4)和未转染组(n=2),经X射线照射后,分别移植入经rAAV2β-珠蛋白病毒转染(MOI=50)或未转染的β41-42/β654杂合子型重型β-地中海贫血流产胎儿造血细胞,转染后第28天和第70天分别处死rAAV2转染小鼠(n=2)和未转染受体小鼠(n=1)。采用RT-PCR、等位基因特异性PCR(ASPCR)法检测rAAV2介导的人β-珠蛋白基因在小鼠骨髓中的表达,并以高压液相色谱法量化分析受体小鼠外周血中人β-珠蛋白肽链的水平。结果①RT-PCR于所有受体小鼠样本中均可检测到人β-actin和人β-珠蛋白基因的表达。②ASPCR检测中,β41-42突变基因稳定表达于所有受体小鼠,β654突变基因仅在移植后第70天受体小鼠样本中被检测到;移植后第28天,rAAV2转染及未转染小鼠体内均可检测到主要来自于β654突变基因的正常β-珠蛋白基因表达;但至移植后第70天,仅rAAV2转染小鼠骨髓样本中仍可检测到rAAV2-β-globin载体介导的正常β-...     

兔网织红细胞钙调蛋白含量及阿片肽对兔网织红细胞膜钙调蛋白活性的影响

用以激活环核苷酸磷酸二酯酶活性为基础的钙调蛋白(Calmodulin CaM)活性测定法,测定正常兔红细胞及兔网织红细胞CaM含量及阿片肽类对兔网织红细胞膜CaM活性的影响。发现无论在网织细胞或其细胞膜CaM含量均明显高于正常红细胞;β-内啡肽和强啡肽对兔网织细胞膜CaM活性有显著的抑制作用,这种作用并不为纳洛酮或其化合物Mr2266所拮抗,也不受钙离子浓度增加的影响,但可被外源性CaM所翻转。推论兔网织细胞膜CaM是β-内啡肽和强啡肽作用环节之一.     

615系小鼠可移植性肝癌中H-ras基因的表达

作者用盐酸胍法从615系小鼠原发性可移植性肝癌(H651、H22)实体瘤组织及正常615系小鼠肝组织(N615)中制备总RNA,经Oligo(dT)纤维素亲和层析法纯化得到 poly(A)~+RNA,再经兔网织红血球溶胞物体系测活及电泳鉴定后,作Northern 印迹和经α-~(32)P-标记的H-ras、Ki-ras及C-myc癌基因分子探针杂交,发现:仅H615中有H-ras基因的明显表达信号,N615中仅有弱表达。     

兔网织红细胞RNA诱导K562细胞向终末期定向分化的研究

为探讨兔网织红细胞ＲＮＡ对人白血病细胞Ｋ５６２分化的影响。方法运用细胞生物学方法，将兔网织红细胞ＲＮＡ与人白血病Ｋ５６２细胞共同培养４天，测定细胞密度，进行联苯胺染色，计数阳性细胞的百分化。结果生长在含有１００μｇ／ｍｌ兔网织红细胞ＲＮＡ培养液中的人白血病细胞Ｋ５６２，首先表现为细胞逐渐失去无限增殖能力，发生向终末期定向分化、合成和积累血红蛋白，出现终末期的表现型。Ｋ５６２细胞与ＲＮＡ共同培养４天时联苯胺阳性终末细胞达６０％，最后期达１００％。结论哺乳类红细胞胞质中的ＲＮＡ具有限制Ｋ５６２细胞无限的分裂和增殖，使Ｋ５６２细胞发生终末分化，并使其恶性表型逆转的作用。     

反转录病毒载体介导含增强子的人β－珠蛋白基因在小鼠胎肝细胞中的表达

将人β－珠蛋白基因（３．１ｋｂ）反向克隆入反转录病毒载体Ｎ２Ａ，并在Ｎ２Ａ的ＬＴＲ插入３６ｂｐ的增强子ＨＳ２（简称Ｎ２Ａ．β．Ｅ３６）。将此反转录病毒重组体转染ψ－２和ＰＡ３１７包装细胞系，经Ｇ４１８筛选后，分离出完整整合的并能产生较高病毒滴度的产病毒细胞系。利用产病毒细胞系，将含增强子人β－珠蛋白基因转入小鼠胎肝细胞，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交表明人β－珠蛋白基因可以完整地整合到靶细胞的基因组上，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示人β－珠蛋白基因可在小鼠胎肝细胞中表达。     

红细胞分化表达的调节

α与β-珠蛋白、收缩蛋白、血红素合成酶类是红细胞的特徵,它们的基因只有在红细胞中表达,所以可作为红细胞分化的标志物。应用小鼠红白血病细胞株(MELC)进行红细胞分化表达的调节具有下列优点:(1)可以长期体外培养。(2)易于在细胞周期的某一阶段同步化。(3)可以得到可用以分析分化过程中的不同步骤的变异株。(4)可用化学试剂诱导细胞分化。一、小鼠红白血病细胞(MELC)的生长特点小鼠红白血病的细胞很大,核大、核浆比     

人β-珠蛋白MAR对转基因在不同细胞中表达的影响

目的:研究人β-珠蛋白核基质结合区(matrix attachment region,MAR)在不同表达宿主中对转基因表达的影响.方法:通过PCR从人基因组扩增β-珠蛋白MAR,正向克隆至pCAT3-control载体SV40启动子的上游,分别检测在瞬时及稳定表达的情况下,MAR在NIH3T3及Hela细胞中对CAT报告基因的影响情况.结果:在瞬时表达情况下,NIH3T3细胞及Hela细胞中MAR均不能提高CAT基因的表达;在稳定整合的情况下,NIH3T3细胞中β-珠蛋白MAR可使CAT报告基因表达水平提高8倍,而在Hela细胞表达水平只提高2.5倍.结论:MAR能在一定程度上提高稳定外源基因的表达水平;MAR的作用与表达宿主相关.     

地西他滨对K562细胞γ-珠蛋白基因表达及细胞增殖的影响

目的研究地西他滨对K562细胞γ-珠蛋白基因表达及细胞增殖的影响,探讨药物治疗β-地中海贫血的新思路。方法分别用不同浓度(0 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、300 nmol/L)地西他滨作用于K562细胞24 h、48 h、72 h,用CCK-8检测药物对K562细胞存活率的影响,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用实时荧光定量RT-PCR检测γ-珠蛋白基因表达。结果地西他滨对K562细胞生长有抑制作用,作用后细胞凋亡率增加,γ-珠蛋白基因表达显著提高(P<0.05)。结论地西他滨可以提高K562细胞γ-珠蛋白基因表达。     

珠蛋白生成障碍性贫血网织红细胞的分群分析

目的探讨网织红细胞低荧光强度网织红细胞(LFR)、中荧光强度网织红细胞(MFR)、高荧光强度网织红细胞(HFR)三分群参数在珠蛋白生成障碍性贫血(珠贫)中的变化。方法用Sysmex XE-2100全自动血球计数仪检测α珠贫与β珠贫的网织红细胞三参数,进行珠贫与正常对照组比较,不同程度珠贫组间的比较。结果珠贫患者网织红细胞三分群与正常人比较,α珠贫与β珠贫比较,男女β珠贫非贫血组、轻度贫血组与中重度贫血组比较,女性β珠贫非贫血组与轻度贫血组比较,差异有显著性(P<0.05)。结论珠贫患者三分群与贫血程度有关,LFR随珠贫患者贫血程度降低而降低,MFR、HFR随珠贫患者贫血程度降低而增高。故网织红细胞分群三参数应用于珠贫患者检查,观察其造血功能有着重要的临床意义。