弓形虫P30基因非融合蛋白表达的研究

目的构建弓形虫主要表面抗原P30基因的原核表达载体并在E.coli中进行表达.方法采用定向克隆的方法,将PCR扩增得到的P30片段,插入原核表达质粒pBV220上,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,于氨苄LB培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及PCR扩增鉴定重组子.将含阳性重组子pBV220-P30的工程菌经温度诱导表达,SDS-PAGE电泳及免疫印迹分析.结果成功构建了pBV2200-P300重组质粒;SDS-PAGE电泳及Western-blot显示表达P30非融合蛋白的分子量为29kD,且能被弓形虫高免鼠血清识别.结论从弓形虫基因组DNA中获取P30基因,并成功构建了pBV220-P30重组质粒,诱导表达了P30非融合蛋白.对弓形虫病基因疫苗研制奠定了基础.     

prk基因非融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建prk基因的非融合表达载体，并诱导表达。方法：PCR扩增并回收prk基因片段，将其与亚克隆载体pMDl8-T重组，通过蓝／白斑筛选、酶谱分析和序列测定鉴定出重组质粒，然后从该重组质粒上切下prk基因片段，再克隆至非融合表达载体pBV220中，酶谱分析鉴定出正向重组质粒，诱导含有正向重组质粒的宿主菌表达蛋白，提取全菌总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果：成功构建并筛选出pBV220正向重组质粒，经热诱导表达，得到一可溶性的相对分子质量为65ku的重组蛋白。结论：pBV220-prk表达载体的成功构建和表达，说明扩增所得的基因具有正确的阅读框架，使获得天然Prk蛋白成为可能．为进一步研究prk基因的生物学功能奠定了基础。     

弓形虫RH株表面抗原P30基因重组质粒的构建及鉴定

目的：构建弓形虫RH株表面抗原P30基因的重组表达质粒，为下一步免疫与诊断研究制备高纯度P30重组蛋白奠定基础。方法：自弓形虫RH株感染小鼠腹水中收集速殖子，用酚／氯仿法提取基因组DNA，用PCR法扩增编码P30的基因片段(经电泳切带纯化)，定向插入到PQE-30表达质粒中，转化入TG1宿主菌，在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子，采用酶切、PCR扩增和DNA序列分析等方法对插入片段进行鉴定。结果：阳性重组质粒PQE30-P30经Sal HindⅢ双酶切下的插片及PCR扩增产物均与原插入的P30基因片段大小一致为976bp，通过序列测定证实插入片段为编码P30的基因片段。结论：成功构建弓形虫表面抗原P30基因的重组质粒PQE30-P30。     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的：利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子（human brain-derived neurotrophic factor, hBDNF）的原核表达载体pBV220／mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法：制备重组质粒pGEM-T／hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果：重组原核表达质粒pBV220／mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论：成功构建了原核表达载体pBV220／mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

弓形虫重组耻垢分枝杆菌M.S-P30-ROP2载体活疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定弓形虫1330-ROP2复合基因重组耻垢分枝杆菌M．s载体活疫苗。方法用亚克隆技术把P30-ROP2复合基因克隆入大肠杆菌／分枝杆菌穿梭质粒pSTM3，构建重组质粒pSTM3-P30-ROP2，电穿孔法导入耻垢分枝杆菌中，潮霉素筛选、PCR法鉴定阳性转化子，温度诱导表达鉴定。结果获得pSTM3-P30-ROP2重组穿梭表达载体，SDS—PAGE结果显示P30-ROP2复合基因表迭蛋白产物分子量约为66kDa。结论成功构建弓形虫复合抗原基因P30-ROP2重组耻垢分枝杆菌疫苗，为弓形虫病的防治提供了-种新方法。     

弓形虫ZS株P22基因片段的克隆、表达与融合蛋白的纯化

目的 克隆弓形虫ZS株表面抗原P22编码基因，构建原核重组表达质粒pThioHieA，B，C／P22，并在大肠杆菌(Top10)中进行表达及纯化融合蛋白。方法 PCR扩增及限制性内切酶Pst Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切496bp的弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段，胶回收纯化，插入表达质粒裁体pThioHisA，B，C多克隆位点，构建置组体pThioHisA，B，C／P22，并转化大肠杆菌(E.coli)Topl0，筛选阳性克隆，以限制性酶切分析及测序鉴定后，以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导，在E.coli Top10中表达，用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达产物并纯化．结果 PCR扩增出约496bp的P22编码基因目的片段，与预期片段大小相符；所构建的pThioHisA，B，C／P22重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定，与预期结果一致；SDS—PAGE与免疫印迹显示，表达融合蛋白产物约35．4kD．结论 成功构建弓形虫ZS株表面抗原P22编码基因pThioHisA，B，C／P22表达质粒，诱导表达弓形虫表面抗原P22蛋白，并纯化该融合蛋白。     

融合蛋白ScFv（3G11）-mms13在大肠杆菌中的表达及鉴定

目的：构建抗Ⅳ型胶原酶单链抗体基因ScFv与磁小体膜蛋白基因mms13融合基因的原核表达载体pET30a（＋）-ScFv-mms13,在大肠杆菌中诱导表达并对融合蛋白进行初步鉴定。方法 PCR扩增融合基因ScFv-mms13,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆入原核表达载pET30a（＋）质粒,构建重组表达质粒。将重组质粒导入大肠杆菌DH5ɑ中,利用PCR、酶切筛选鉴定重组菌株。用异丙基疏代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达融合蛋白,通过改变IPTG浓度、诱导时间优化表达条件。表达产物经SDS-PAGE电泳和Western blot法进行鉴定。结果重组质粒经PCR、酶切、测序证实重组质粒pET30a（＋）-ScFv-mms13构建成功。 SDS-PAGE电泳结果分析表明诱导菌株在43kDa左右处有明显异源蛋白表达,且确定了在IPTG终浓度为0．2mmol/L、诱导时间为6h时为表达稳定。对表达蛋白进行定位分析确定表达蛋白主要以包涵体形式存在,部分存在于可溶细胞质中。 Western blot结果实证该表达产物可与His-tag抗体发生特异性结合,提示为目的融合蛋白。结论成功构建pET30a（＋）-ScFv-mms13表达载体并表达获得目的融合蛋白。     

hBDNF原核表达载体的构建及其表达

目的:利用基因重组技术构建人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)的原核表达载体pBV220/mhBDNF,诱导表达融合基因,鉴定BDNF的生物学活性。方法:制备重组质粒pGEM-T/hBDNF及hBDNF的成熟肽基因片段,经限制性内切酶联合酶切,将hBDNF亚克隆到原核表达载体pBV220,诱导表达克隆基因,培养鸡胚背根神经节,检测表达蛋白的活性。结果:重组原核表达质粒pBV220/mhBDNF构建正确,表达框架未发生改变。成功诱导表达了融合基因并成功地分泌表达hBDNF蛋白。表达蛋白组可见大量神经突起自神经节组织块外周缘向四周呈放射状长出,损伤组未见明显神经突起长出。结论:成功构建了原核表达载体pBV220/mhBDNF,重组质粒可分泌表达hBDNF蛋白,而且hBDNF蛋白有良好的生物活性。本实验为进一步开展hBDNF基因治疗感音神经性耳聋提供了可能。     

内源性血管生成抑制因子Arresten原核表达载体的构建及表达

目的构建内源性血管生成抑制因子Arresten基因的原核表达载体,并在E.coliDH5α进行表达。方法从健康产妇的胎盘组织中提取总RNA,经逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,构建重组质粒pBV220-Arr转化E.coliDH5α进行原核表达。结果成功筛选出Arresten基因并构建了重组质粒pBV220-Arr,重组质粒在菌株中获得表达。结论构建的原核表达重组体pBV220-Arr能高效表达重组Arresten蛋白。     

嗜肺军团菌ip基因的克隆及其原核表达

目的克隆嗜肺军团菌主要免疫原蛋白ip基因,构建重组质粒pET-ip,并在原核系统中表达。方法采用聚合酶链反应(PCR),从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增军团菌主要免疫原蛋白ip基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a( ),构建原核表达重组质粒pET-ip,经限制性内切酶鉴定、PCR及测序分析后,转化宿主菌大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了792 bp完整的ip基因,构建的原核表达重组质粒pET-ip表达出49 kDa Trx-IP的融合蛋白质,Western-blot证实获得蛋白为所需要的目的蛋白。结论成功构建了军团菌ip基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

NP9蛋白的原核表达及纯化

目的构建表达人NP9融合蛋白的重组体并进行融合蛋白的原核表达及NP9蛋白的分离和纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）得到NP9基因的编码区序列，克隆到原核表达载体pGEX-6P-3上构建重组NP9原核表达质粒。转化大肠杆菌后通过SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定融合蛋白表达。使用GSTFF层析柱分离纯化NP9蛋白。结果得到序列正确的NP9基因及重组原核表达质粒pGEX-6P-3-Np9，SDS-PAGE电泳和Western blotting证实重组质粒能够在大肠杆菌内受IPTG诱导表达，层析分离得到分子量为大约14kDa单一的NP9蛋白。结论成功构建了表达NP9融合蛋白的原核表达载体，该栽体能在细菌内表达出GST—NP9融合蛋白．有效分离得到NP9蛋白．     

刚地弓形虫P30两个不同片段的克隆、表达及鉴定

目的：构建刚地弓形虫(简称弓形虫)主要表面抗原P30基因的2个不同片段的克隆并进行表达、鉴定。方法：根据已发表的弓形虫P30基因序列，参考有关文献设计合成两对引物，用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出P30基因的两个不同片段，分别构建T-A克隆，经PCR扩增及酶切鉴定后，进行测序，再亚克隆入pMAL—p2质粒并转化DH5α感受态细胞，于氨苄青霉素LB平板上初步筛选阳性克隆，再经酶切及PCR扩增鉴定重组子。将重组子转入表达菌BL21，用IPTG进行诱导表达，并对所表达的蛋白以western blot鉴定，结果：成功构建相应的T-A克隆及pMAL—p2亚克隆，经诱导、表达和鉴定，证实2个表达产物均为目的蛋白，其分子量分别为70和73Ku。结论：成功获得弓形虫主要表面抗原P30的2个表达产物，为其进一步的纯化及应用奠定了基础。     

7株不同原核质粒表达丙型肝炎核心蛋白的差异研究

目的通过比较不同原核质粒表达丙型肝炎核心蛋白(CORE)的差异,筛选出能高效表达CORE的原核质粒。方法用PCR扩增并获得CORE基因,扩增产物分别构建到7种不同原核表达质粒中,重组质粒用IPTG诱导表达,聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)初步鉴定表达产物,并经Western blot验证。结果 PCR及双酶切验证表明CORE基因成功构建到7种原核质粒中,SDS-PAGE验证各融合质粒表达目的蛋白存在差异,其中pTrc-CKS-CORE及Pmbp-C-CORE可见相应的融合蛋白表达,以pTrc-CKS-CORE表达量高,表达产物经Western blot验证表达成功。结论成功构建7株不同CORE原核表达质粒,各融合质粒表达CORE存在较大差异,筛选出高表达CORE质粒,为下一步研究奠定基础。     

人血管内皮生长因子A(VEGFA)的原核载体构建、蛋白表达及鉴定

目的 克隆人VEGFA基因,与原核载体融合表达、纯化及其鉴定,并将其应用于肿瘤血管生长研究过程中.方法 采用PCR方法扩增人VEGFA序列,将其克隆入pGEX-KG原核载体,获得pGEX-KG-hVEGFA重组质粒.将该质粒转化入E.coli菌株BL21 (DE3),经IPTG诱导其表达,以GSTrap亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE电泳,Western Blot方法鉴定融合蛋白的表达.结果 PCR扩增获得了hVEGFA基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒载体经过PCR、酶切鉴定,证明重组质粒中已成功的插入了hVEGFA基因片段.成功构建了该蛋白的原核表达载体pGEX-KG-hVEGFA.结论 融合蛋白在IPTG终浓度为0.5 mmol/L、25℃条件下诱导表达,并获得纯化融合蛋白.采用Western Blot的方法可检测到目的融合蛋白GST-hVEGFA的表达.     

卵巢上皮性癌SEREX抗原基因FXR1、OV-189原核表达载体的构建及表达

目的:克隆并构建卵巢上皮性癌SEREX抗原基因FXRl、OV-189的原核表达载体.方法:用PCR从含SEREX抗原基因序列的重组pBK-CMV质粒中扩增FXRl、OV-189的CDS,双酶切后插入原核表达质粒pET-30b( ),经酶切及测序鉴定,阳性质粒转化表达菌BL21感受态细胞,IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.结果:成功扩增了FXRl、OV-189的CDS,并构建了原核表达质粒pET-30b( )/FXRl、pET-30b( )/189,经测序,与Genbank中的相应序列一致,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达目的蛋白.结论:成功构建了原核表达质粒pET-30b( )/FXRl、pET-30b( )/189,并在大肠杆菌中表达了重组融合目的蛋白,为进一步研究奠定了基础.     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫微线体蛋白MIC3基因。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,反转成cDNA.根据MIC3基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫cDNA中扩增MIC3基因片段,插入pGEM-T载体,并转化大肠杆菌Top10,经PCR、双酶切、测序验证后,将MIC3基因片段定向亚克隆到载体pET-28a中构建原核表达重组质粒pET-28a-MIC3,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出792bp大小的MIC3基因片段并诱导表达27 300 Mr的重组MIC3蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pET-28a-MIC3重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究莫定了基础。     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3的原核表达及其免疫反应性

目的 克隆表达弓形虫RH株MIC3基因,并对重组蛋白进行免疫反应性分析.方法 应用PCR技术扩增弓形虫RH株MIC3基因,将目的基因片段分别克隆至pET28a(+)和pET32a(+)两种表达载体中构建重组质粒,重组质粒转化至大肠杆菌体BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后,表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot鉴定.结果 成功从弓形虫RH株基因组DNA中克隆出大小约1080bp MIC3基因片段;重组质粒pET28a-MIC3和pET32a-MIC3经过酶切和PCR鉴定,及测序分析,表明重组质粒构建正确.两种重组质粒分别诱导表达后进行SDS-PAGE电泳分析,诱导表达产物分别在50 KD及70KD左右出现目的条带,Westem-blot分析显示重组蛋白对弓形虫慢性感染小鼠血清具有特异免疫反应性.结论 原核表达了弓形虫MIC3重组蛋白,所表达的重组蛋白具有免疫反应性,为下一步利用重组蛋白进行弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定基础.     

嗜肺军团菌pip基因原核质粒的构建及其表达

目的扩增嗜肺军团菌基因pip,构建重组质粒pET-pip并在原核系统中表达。方法采用PCR,从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增出pip基因,将其定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-pip,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序分析后,转化BL21,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE进行鉴定。使用His-tag纯化重组蛋白PIP。结果扩增出了嗜肺军团菌726bp的pip基因,构建的原核表达重组质粒pET-pip表达并纯化出了约46kD Trx-PIP的融合蛋白。结论成功构建了嗜肺军团菌pip基因的原核重组质粒,并在大肠杆菌中得到了高效表达。     

嗜肺军团菌momp原核重组质粒的构建和表达

目的构建嗜肺军团菌momp原核重组质粒,并纯化重组蛋白。方法以嗜肺军团菌LP1型DNA为模板,PCR扩增得到momp基因,定向克隆至原核载体PET32a（＋）中,经酶切及测序鉴定正确后,转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导并用SDS-PAGE电泳进行分析,其产物用亲和层析法进行纯化。结果扩增出831bp的momp基因,构建重组质粒pET-momp,诱导表达及纯化出50KD的蛋白。结论成功构建momp基因的原核表达载体并得到高效表达。     

结核分枝杆菌优势蛋白PPE37重组载体的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ppe37基因的重组原核表达质粒,并将其转化到E.coli BL21中诱导表达。方法以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增ppe37基因,将其克隆至pEasyE2克隆载体中,构建pEasyE2-ppe37重组质粒。经双酶切后将ppe37基因片段亚克隆到pET30a载体中,构建重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE及WesternBlot对表达产物进行鉴定。结果 PCR法扩增出约1600bp的条带。重组质粒pEasyE2-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE37蛋白基因序列一致。重组原核表达质粒pET30a-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确。SDS-PAGE鉴定表达的组氨酸标签重组蛋白相对分子质量约为50KDa,Western blot验证重组蛋白可与抗组氨酸单抗发生特异性反应。结论成功构建结核分枝杆菌ppe37基因重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并成功诱导表达,为PPE37蛋白作为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。