NR2B反义寡核苷酸对大鼠海马CA1区NR2B蛋白质表达的影响

目的 观察NMDA受体2B亚单位（NR2B）反义寡核苷酸（ANR2B）对海马CA1区NR2B蛋白质表达的影响，筛选有效的反义寡核苷酸，为探讨针对NR2B的新药物提供形态学基础。方法 设计、筛选、合成ANR2B。正常SD大鼠，海马CA1区立体定位注射ANR2B，灌注取脑，连续冰冻切片，ABC免疫组织化学方法染色，光镜下观察NR2B蛋白质的表达变化。结果 注射ANR2B后，注射区及其周围NR2B免疫组织化学染色强度明显下降。仅有少量锥体细胞和颗粒细胞散在分布；而在注射NR2B正义寡核苷酸（SNR2B）、生理盐水及生理盐水插针不注射的海马切片上，海马CA1区的染色特征与注射ANR2B者有明显差别，其作用区锥体细胞、颗粒细胞及顶树突的NR2B免疫组织化学染色强度无明显变化。结论 ANR2B能够降低NR2B蛋白质在正常大鼠海马CA1区的基础性高表达。     

海马内注射脂多糖导致痫性发作及其机制

目的 研究脂多糖海马内注射激活胶质细胞免疫反应引起大鼠痫性发作及海马硬化的作用机制。方法 随机将36只成年雄性Wistar大鼠分为脂多糖组(LPS组)、海人酸组(KA组)、生理盐水组(NS组)。立体定位在大鼠CA3区分别注射脂多糖5μg/μL、生理盐水、海人酸0.4μg/μL各1.5μL,记录大鼠的行为学、脑电图;行海马区HE染色观察神经元形态;采用免疫组化法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元型一氧化氮合酶(nNOS)的表达。结果 海马内注射NS后大鼠未见痫性发作,脑电图呈基本节律。注射LPS或KA后2h内大鼠出现不同程度的痫性发作和脑电图异常改变(尖波或棘波),KA组发作等级高于LPS组,部分LPS和KA组大鼠在给药后3～4周仍可见痫性发作。与NS组比较,LPS和KA组给药后急性期海马各区星形胶质细胞活化,神经元nNOS活性增高,慢性期星形胶质细胞增生,神经元数量减少,呈海马硬化表现。结论 海马内注射脂多糖可激活胶质细胞的固有免疫反应,并导致大鼠痫性发作和海马硬化。     

氯胺酮连续给药对幼龄小鼠前脑c-Fos表达的影响

目的:观察氯胺酮连续给药对幼龄小鼠前脑c-Fos表达的影响,探讨建立分裂症模型的方法。方法:7日龄雄性昆明小鼠腹腔注射30mg/kg氯胺酮或生理盐水,灌注取脑后冰冻切片,检测c-Fos蛋白表达。结果:给药组的隔区、CA1区等脑区c-Fos表达明显增加。结论:幼龄小鼠连续注射氯胺酮建立分裂症模型有一定的可行性。     

利用冰冻切片技术检测大鼠全脑缺血后海马CA1区线粒体细胞色素C变化

目的 利用冰冻切片技术检测大鼠全脑缺血后海马CA1区神经元线粒体CytC的变化。方法 采用4-VO法制作全脑缺血模型，将SD大鼠随机分为假手术对照组、全脑缺血组。观察缺血后24h海马CA1区细胞色素C(Cytoclaromec，C,CytC)变化。结果 缺血后24h，假手术组海马CA1区CytC呈阳性表达，并且呈现出特异性的点状分布，符合CytC线粒体分布的特征，全脑缺血组海马CA1区CytC表达明显降低。结论 利用冰冻切片技术能方便、直观的检测脑缺血再灌注后神经元线粒体CytC的变化，再灌注24小时海马CA1区神经元线粒体CytC明显下降。     

促红细胞生成素对缺血海马CA1区神经元Bcl-xl和细胞色素C作用的相关性研究

目的探讨促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)的神经保护机制.方法采用4-vO法制作大鼠全脑缺血模型.将SD大鼠随机分为假手术组、生理盐水对照组、EPO预处理组.全脑缺血前3 h,EPO组大鼠脑室立体定向注射重组人促红细胞生成素(rHu-EPO),生理盐水组则给予生理盐水,假手术组只进行假手术处理.观察缺血后24 h各组海马CA1区bcl-xl和细胞色素C(Cytochrome C,CytC)表达是否有相关性.结果bcl-xl和CytC预处理可以抑制缺血后大鼠海马CA1区神经元CytC从线粒体释放入胞浆,这种作用可能与促进bcl-xl表达相关.     

海人藻酸诱导大鼠海马CA1区Procaspase3巯基去亚硝基化机制的研究

目的：探讨海人藻酸（Kainic acid, KA）注射诱导大鼠海马CA1区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3酶原（cysteine aspartate-specific proteasezymogen,Procaspase3）巯基去亚硝基化的机制。方法：将SD大鼠随机分为假手术组（sham组）、KA注射组（KA组）、给药组（NS102组,DNCB组,GSNO组）及溶剂对照组（生理盐水组,DMSO组）。采用KA侧脑室注射构建大鼠癫痫模型。运用生物素转化法检测蛋白质巯基亚硝基化,聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹方法对Procaspase3巯基去亚硝基化进行分析,焦油紫染色法观察大鼠成活海马神经元的数量。结果：与sham组相比,KA组Procaspase3巯基亚硝基化水平明显降低,与KA组相比,NS102组、DNCB组和GSNO组Procaspase3巯基亚硝基化水平显著上升,差异均有统计学意义（P<0.05）,但DMSO组和生理盐水组差异无统计学意义。说明注射浓度为0.6 μg/10μL的KA能够诱导大鼠海马CA1区Procaspase3巯基去亚硝基化;KA通过激活KA受体导致大鼠海马CA1区Procaspase3巯基去亚硝基化,KA受体抑制剂NS102能够抑制Procaspase3巯基去亚硝基化;TrxR参与调节KA诱导的大鼠海马CA1区Procaspase3巯基去亚硝基化;外源性NO供体能够抑制Procaspase3巯基去亚硝基化。焦油紫染色结果显示,与KA组相比,NS102组、DNCB组和GSNO组神经元损伤降低。结论：KA注射通过激活KA受体诱导大鼠海马CA1区Procaspase3巯基去亚硝基化,Procaspase3巯基去亚硝基化受TrxR和外源性NO调节,抑制Procaspase3巯基去亚硝基化对海马神经元具有保护作用。     

组织学切片法在三维重建大鼠海马结构中的应用价

 目的  探讨组织学切片法在三维重建大鼠海马结构的应用价值。方法 采用成年SD大鼠3只,取全脑至脊髓颈1节段后固定,其中2只标本在冰冻切片机上行冠状面连续冰冻切片,1只标本行正中矢状切片,片厚30 μm。所得切片行尼氏染色,在5倍物镜下行显微拍摄。每张切片拍摄4至5张照片,在Photoshop 7.0软件中进行图像拼接,三轴法对所得图片进行配准。根据大鼠脑立体定位图谱在3D DOCTOR 4.0软件中将连续图像中海马划分为CA1、CA2、CA3和DG 4区,对这4区以及侧脑室分别进行三维重建和可视化,利用软件自带工具计算出各区及侧脑室体积。结果 (1) 大鼠海马结构起自于前囱后1.4mm或对耳线前7.6 mm,止于前囱后6.8mm或对耳线前2.2 mm,全长5.4 mm;(2) 侧脑室呈“C”形位于海马外侧,齿状回位于中线两侧,CA1区位于海马的顶部,CA2区位于CA1区的外侧,CA3区位于CA2与齿状回之间;(3) 海马内各区体积CA1为(8.634 9±0.092 7) μL,CA2为(2.952 2±0.058 7) μL,CA3为(3.756 9±0.061 4) μL,DG为(8.547 9±0.139 0) μL,侧脑室体积为(2.143 5±0.040 8) μL。结论  利用组织学方法可以对大鼠脑内海马结构及其各区进行三维可视化重建;利用3D DOCTOR 4.0软件可以计算重建的海马各区体积。     

地卓西平对吗啡依赖大鼠部分脑区突触素ImRNA表达的影响

目的：研究地卓西平对吗啡依赖大鼠部分脑区突触素ImRNA表达的影响。方法：雄性SD大鼠24只，随机等分为2组。吗啡组大鼠腹腔注射盐酸吗啡，2次／d，起始剂量5mg／kg，逐d递增5mg／kg，至第10d达50mg／kg；干预组大鼠在每次注射吗啡（同吗啡组）前30min腹腔注射地卓西平0．075mg／kg。末次注射后3h及72h，2组各取6只大鼠取脑并冰冻切片，留取中脑腹侧被盖区（VTA）、伏隔核（NAc）、中脑导水管灰质（PAG）、杏仁核（AMG）、海马CA1区（HIPCA1）的脑片，利用原位杂交技术检测突触素ImRNA的表达。结果：末次注射后3h．干预组大鼠AMG、HIPCA1突触素ImRNA的表达高于吗啡组；72h时，干预组大鼠NAc、HIPCA1突触素ImRNA的表达高于吗啡组（P均〈0．05）。其他脑区2组间差异无统计学意义（P〉0．05），结论：地卓西平可促进吗啡依赖大鼠部分脑区突触素I基因的表达，这可能是其抑制吗啡依赖效应的机制之一。     

利用冰冻切片技术检测大鼠全脑缺血后海马CA1区线粒体细胞色素C变化

目的利用冰冻切片技术检测大鼠全脑缺血后海马CA1区神经元线粒体CytC的变化.方法采用4-VO法制作全脑缺血模型,将SD大鼠随机分为假手术对照组、全脑缺血组.观察缺血后24 h海马CA1区细胞色素C(Cytochrome C,CytC)变化.结果缺血后24 h,假手术组海马CA1区CytC呈阳性表达,并且呈现出特异性的点状分布,符合CytC线粒体分布的特征,全脑缺血组海马CA1区CytC表达明显降低.结论利用冰冻切片技术能方便、直观的检测脑缺血再灌注后神经元线粒体CytC的变化,再灌注24小时海马CA1区神经元线粒体CytC明显下降.     

P-糖蛋白在吗啡耐受大鼠不同脑区表达差异的研究

目的 研究P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）在吗啡耐受大鼠脑内额叶皮层、海马及下丘脑表达差异。 方法 雄性SD大鼠12只随机分为吗啡耐受组和生理盐水对照组：吗啡耐受组连续皮下注射吗啡10 mg∕kg,2次∕d,连续7 d,建立吗啡耐受模型;生理盐水对照组同时注射生理盐水。模型建立并确认成功后处死大鼠,取出大鼠海马、下丘脑和额叶皮层组织,以逆转录聚合酶链反应分析比较两组不同脑区P-gp基因表达。 结果 吗啡耐受组大鼠海马和下丘脑P-gp的表达显著高于同组的额叶皮层（P<0.05）,并显著高于生理盐水对照组相同脑区P-gp的表达（P<0.05）;而在生理盐水对照组各脑区间P-gp的表达无显著差异（P>0.05）。 结论 海马和下丘脑P-gp表达增加明显高于额叶皮层,P-gp表达在吗啡耐受大鼠各脑区之间存在显著差异。     

1型1-磷酸鞘氨醇受体的siRNA对人涎腺导管上皮细胞的作用

目的：构建靶向1型1-磷酸鞘氨醇受体（sphingosine 1-phosphate receptor-1, S1P1）基因的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）慢病毒表达载体,感染干燥综合征细胞模型--人涎腺导管上皮细胞（human salivary gland cells,HSG）,探讨S1P1的siRNA治疗干燥综合征的可能性,为临床靶标治疗提供广阔的思路。方法：实验分空白组、空载体组、scramble-siRNA组及S1P1-siRNA组,分别将pLL3.7空载体、构建成功的scramble-siRNA及S1P1-siRNA慢病毒表达载体与pMD2.G、pMDL g/p RRE、pRSV-REV共转染293T细胞制备病毒,感染HSG细胞株48 h,流式细胞术检测其感染效率,实时荧光定量RT-PCR法检测HSG细胞中S1P1 mRNA的表达水平,细胞免疫组织化学法检测细胞中S1P1蛋白的表达水平,ELISA法检测细胞上清中γ-干扰素（interferon-γ, IFN-γ）和白细胞介素（interleukin,IL）-17的表达水平。结果：（1）成功构建scramble-siRNA、S1P1-siRNA慢病毒表达载体,慢病毒的滴度约为3.5×108 TU/mL。（2）感染48 h后S1P1-siRNA组HSG细胞中S1P1 mRNA的表达水平明显低于空白组、空载体组和scramble-siRNA组,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）S1P1-siRNA组HSG细胞中S1P1蛋白的表达水平低于空白组、空载体组和scramble-siRNA组,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）S1P1 siRNA组HSG细胞分泌的IL-17的浓度明显降低,与空白组、空载体组和scramble-siRNA组比较差异有统计学意义（P<0.05）。（5）S1P1-siRNA组细胞上清液中IFN-γ的浓度降低,与空白组、空载体组和scramble-siRNA组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：成功构建了靶向S1P1基因的慢病毒载体,S1P1 siRNA可以使S1P1 mRNA和蛋白表达水平下降,细胞上清液中IL-17和IFN-γ的浓度下降,证明S1P1 siRNA可转染HSG细胞且特异、高效地抑制S1P1基因的表达,抑制细胞上清液中细胞因子的表达,为治疗干燥综合征奠定了实验基础。     

电针胃俞募配穴对胃扩张模型大鼠海马c-fos表达水平及神经细胞活动的影响

目的 探讨海马参与电针胃俞募配穴调节胃扩张模型大鼠胃运动的中枢机制。 方法 将40只7周龄SD大鼠随机分为模型组、胃俞组、中脘组、中脘+胃俞组、非经非穴组,每组8只。采用胃内球囊扩张法复制胃扩张模型。模型组不予针刺,其余各组进行电针干预,每日1次,每次20 min,连续干预7 d。采用压力换能器检测大鼠胃内压,用双导智能胃肠电图仪测定大鼠体表胃电。采用免疫荧光法检测大鼠海马c-fos的表达水平,采用微阵列电极技术记录大鼠海马神经细胞放电变化。结果 与模型组比较,中脘组、胃俞组及中脘＋胃俞组大鼠胃内压、胃电振幅均显著升高（P<0.05）,海马CA1区c-fos表达水平及海马CA1区神经细胞放电频率均显著增加（P<0.05）,但非经非穴组上述指标均无明显变化（P>0.05）。与中脘组、胃俞组比较,中脘+胃俞组大鼠胃内压、胃电振值均显著上升（P<0.05）,海马CA1区c-fos表达水平显著增加（P<0.05）,海马CA1区神经细胞放电频率显著增加（P<0.05）。结论 海马CA1区神经细胞参与电针胃俞募配穴对胃运动的调节机制。     

小鼠pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒载体的构建及神经干细胞转染

目的 构建共表达小鼠Wnt3a（mWnt3a）与绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体,感染神经干细胞(NSCs),观察mWnt3a在NSCs中的表达。方法 利用同源重组技术将mWnt3a基因插入慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1,构建pLVX-Wnt3a-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒,通过瞬时转染法包装出病毒上清,感染NSCs,设为Wnt3a-NSCs组;同时设GFP感染NSCs组（GFP-NSCs组）和未感染NSCs组(NSCs组)作为对照。免疫荧光染色法对Wnt3a-NSCs组NSCs 进行nestin鉴定;Real-Time PCR检测各组细胞mWnt3a mRNA的表达;Western blotting检测各组细胞mWnt3a、β-catenin蛋白的表达。结果 经限制性内切酶检测、基因测序和绿色荧光观察证实成功构建了携带mWnt3a基因的重组慢病毒,且慢病毒滴度达3×108 TU/mL。Wnt3a-NSCs组NSCs在荧光显微镜下证实有绿色荧光,且nestin表达阳性。Real-Time PCR和Western blotting结果显示感染后7 d, Wnt3a-NSCs组mWnt3a mRNA和蛋白以及β-catenin蛋白均明显高于GFP-NSCs组和NSCs组（P<0.01）。结论 成功构建了表达mWnt3a基因的慢病毒载体,在体外培养条件下可以成功转染NSCs。     

VEGF干扰慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

目的构建VEGF基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达。方法根据人VEGF基因序列,设计并合成包含靶序列的互补DNA链,连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测RNAi组（MHCC97-200）、阴性对照组（MHCC97-NEGA）和空白对照组（MHCC97-空白）中VEGF的表达情况,确定其干扰VEGF表达的有效性。结果测序证实慢VEGF基因RNAi病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为3.23×109TU/mL。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,VEGF基因在mRNA水平抑制了72.2%。结论 VEGF基因RNAi慢病毒载体构建成功,并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。     

SOX9基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建SOX9基因的慢病毒载体并使其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中表达.方法 通过RT-PCR获得人SOX9基因编码区(CDS)片段,将该片段克隆入质粒Pwpxl-MOD2中产生Pwpxl-MOD2/SOX9,将Pwpxl-MOD2/SOX9、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共转染293T细胞,获得携带目的基因SOX9基因的重组病毒.同时共转染Pwpxl-MOD2,pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G进另一组293T细胞包装产生空载体慢病毒作为阴性对照.包装好的慢病毒体外感染MSCs,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法及免疫印迹检测SOX9的表达;四甲基噻唑蓝(MTT)法测定慢病毒对细胞增殖能力的影响.结果 酶切、PCR及测序鉴定证实慢病毒载体质粒Pwpxl-MOD中插入片段为基因SOX9.病毒感染MSCs后,经RT-PCR法和免疫印迹证实SOX9基因在MSCs中表达.MTT法检测示慢病毒感染对骨髓间克质干细胞的生长未产生显著影响.结论 成功构建SOX9基因的慢病毒载体并感染骨髓间充质干细胞后能够稳定表达SOX9.为研究椎间盘退变的基因及生物学治疗提供了实验依据.     

人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达

目的构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在脂质体Lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper 1.0和包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-TNF-α)、空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT-PCR以及ELISA方法检测TNF-α表达。结果所获TNF-α基因测序证明与GenBank中序列一致;重组慢病毒载体质粒pGC-FU-TNF-α经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L,感染脐血间质干细胞后RT-PCR、ELISA检测3组细胞均有TNF-α表达,其中实验组大量表达TNF-α,与其余两组比较差异有显著性(F=11.677、21.321,P<0.01)。结论成功构建带有TNF-α基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为脐血间质干细胞转基因治疗胃癌的应用奠定基础。     

人NESG1基因慢病毒载体的构建及其在293FT细胞中的表达

目的克隆人NESG1基因,构建与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合表达的慢病毒载体pGC-FU-NESG1-EGFP,包装慢病毒,感染293FT细胞并进行鉴定。方法以NESG1全长克隆为模板扩增其编码框序列,通过限制性内切酶AgeI酶切、T4 DNA连接酶连接,将NESG1插入慢病毒载体pGC-FU-EGFP,构建pGC-FU-NESG1-EGFP重组载体。质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经PCR及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染人胚肾细胞系293FT,进行慢病毒包装并测定病毒滴度。病毒感染293FT细胞,荧光显微镜下观察感染效率,Western blot方法检测NESG1-EGFP融合蛋白的表达情况。结果成功构建慢病毒表达载体pGC-FU-NESG1-EGFP,三质粒共转染293FT细胞后可见大量绿色荧光;浓缩病毒后测定其滴度为2×107 TU/ml;以复感染系数MOI为1感染293FT细胞,感染效率在90%以上。Western blot证实细胞表达NESG1。结论成功构建NESG1慢病毒表达载体,包装得到高滴度慢病毒,为后续感染鼻咽癌细胞,探索其在鼻咽癌发生和发展中的作用奠定了基础。     

绿色荧光蛋白基因在白血病细胞K562中的转导效率

目的：探讨慢病毒载体在白血病细胞中的基因转导效率,为白血病基因治疗提供关键依据。方法：应用1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)改造而成的第3代自身失活(SIN）慢病毒载体（lentiviral vector）系统,与鼠白血病病毒（MLV）SIN载体进行比较,通过荧光显微镜观察细胞内标记基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况,应用流式细胞术检测基因导入细胞百分比,评价两种载体系统在人白血病细胞系K562中的基因转导效率。结果：通过荧光显微镜可定性观察GFP在K562细胞中的表达情况,在同样的基因转导条件下,HIV载体转导的白血病细胞中被转导的标记基因GFP的表达强度及GFP阳性细胞数明显高于MLV载体转导的细胞。流式细胞仪定量检测HIV载体的转导效率接近100%,而MLV低于40%,两组间转导效率比较差异有显著性（P＜0.05）。结论：基于慢病毒载体基因转导的高效性,该载体系统可作为白血病细胞基因转导的极好工具。     

shRNA稳定干扰Raptor基因表达的小鼠胸腺上皮细胞系的建立

目的: 建立Raptor基因稳定干扰的小鼠胸腺上皮细胞系(mouse thymic epithelial cell line 1, mTEC1)。方法: 根据Sigma公司数据库Raptor基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列,在其3′和5′端添加pLKO.1 puro慢病毒载体酶切位点序列,合成shRNA序列,插入载体。将pLKO.1 puro shRNA Raptor慢病毒载体与包装质粒混合,共同转染293T细胞,收集病毒颗粒感染mTEC1,再用嘌呤霉素对其进行筛选,最后用免疫印迹法检测Raptor,mTOR,磷酸mTOR(p mTOR)以及mTOR下游分子核糖体S6激酶(ribosomal S6 kinase, p70S6k),磷酸化p70S6k(p p70S6k)的表达水平。同时采用细胞计数和TUNEL法分别检测细胞增殖与凋亡。结果： 合成的Raptor基因shRNA序列成功插入至经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pLKO.1 puro载体,经测序表明序列正确;免疫印迹结果显示,pLKO.1 puro shRNA Raptor感染mTEC1后,Raptor、mTOR及其下游p p70S6k蛋白表达明显降低,但细胞增殖及凋亡无明显变化。 结论： 成功构建Raptor shRNA慢病毒表达载体,建立稳定的Raptor基因敲降的小鼠mTEC1。     

小鼠BTLA基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 :构建小鼠B、T淋巴细胞衰减子(BTLA)基因重组慢病毒载体,探讨BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞增殖及活化的影响。方法:以小鼠脾脏组织总RNA为模板,逆转录为c DNA,通过PCR技术扩增BTLA基因,构建p WPTS-m BTLA慢病毒载体,磷酸钙法感染人胚肾上皮细胞株293T细胞。RT-PCR及Western blot法检测BTLA m RNA和BTLA蛋白表达,50%组织培养感梁剂量(TCID50)法检测重组慢病毒滴度。通过感染p WPTS-m BTLA及p WPTS-GFP慢病毒载体的293T细胞与小鼠脾脏T淋巴细胞混合培养,初步研究BTLA基因过表达对小鼠脾T淋巴细胞活化与增殖的影响。结果:成功构建小鼠p WPTS-m BTLA慢病毒载体,并制备高滴度病毒颗粒(1.3×108pfu/ml)。通过对比实验组与对照组小鼠脾T淋巴细胞的增殖结果 ,发现4 d及8 d T细胞的增殖效应均明显受抑制,差异具有统计学意义(P<0.05),且这种抑制作用在0~8 d内具有时间依赖性。结论:过表达BTLA基因的293T细胞与小鼠脾T淋巴细胞混合培养后对其增殖及活化有抑制作用,提示成功构建具有生物学效应的小鼠BTLA基因重组慢病毒载体。