经尿道灌注SCL和GJA1基因慢病毒对糖尿病膀胱病变中CD117和Cx43蛋白及其mRNA表达的影响

目的：探索灌注干细胞白血病SCL和GJA1基因慢病毒对糖尿病膀胱病变中CD117(c-kit)和Cx43蛋白及其mRNA表达的影响。方法：选取70只健康成年雄性豚鼠，称量体重在300～400 g之间，一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)200 mg/kg,浓度1%,构建豚鼠糖尿病膀胱模型，经尿流动力学筛选出26只成模型豚鼠。随机将24只糖尿病膀胱模型豚鼠分为4组，每组6只：阴性对照组(n=6)、Cx43组(n=6)、CD117组(n=6)、CD117+Cx43组(n=6)。阴性对照组将未携带基因的慢病毒+PBS液0.2 ml单次经尿道灌注，CD117组单次经尿道灌注SCL基因重组慢病毒药物(滴度2×10⁷U)0.2 ml, Cx43组单次经尿道灌注GJA1基因重组慢病毒药物(滴度2×10⁷U)0.2 ml, CD117+Cx43组单次经尿道灌注SCL+GJA1基因重组慢病毒药物(滴度2×10⁷U)0.2 ml。灌注结束后迅速结扎尿管至2 h后解除尿管。各组的糖尿病豚鼠膀胱在结束灌注后第14天时于无菌操作和全身麻醉下取出，将...     

缝隙连接蛋白α7促进骨髓间充质干细胞转化为心脏起搏样细胞的实验研究

目的 探讨缝隙连接蛋白α7(GJA7)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs),经与乳鼠心肌细胞(neonatal rat ventricular myocytes,NRVMs)共培养,诱导心脏起搏样细胞相关基因表达的变化.方法 构建携带GJA7基因的慢病毒载体,转染rMSCs,经嘌呤霉素加压筛选纯化后,与NRVMs共培养.分为RFP(red fluorescent protein,红色荧光蛋白)-rMSCs组(A组)、GJA7-RFP-rMSCs组(B组)、RFP-rMSCs+ NRVMs组(C组)、GJA7-RFP-rMSCs+NRVMs组(D组)4组.荧光定量PCR法检测心脏起搏细胞相关基因(HCN4、GJA7、Tbx3、Tbxl8)及工作心肌细胞相关基因(Cx43、Nkx2.5)的表达.全细胞膜片钳检测各组细胞起搏电流(If).结果 携带GJA7基因的慢病毒载体成功转染rMSCs,经嘌呤霉素加压筛选,转染效率高达95％以上.RT-qPCR结果显示,D组HCN4、GJA7、Tbx3、Tbxl8表达较其他各组明显增高(P＜0.05);C组Nkx2.5、Cx43则较其他组表达明显升高(P＜0.05).全细胞膜片钳检测结果显示,仅D组记录到超极化激活的内向电流,该电流具有明显时间电压依赖性,且可被Cscl(4 mmol/L)阻断,符合If电流特性.结论 经GJA7基因修饰并通过与心肌细胞共培养,使rMSCs在体外诱导出具有If电流的心脏起搏样细胞.     

一个白内障家系的临床特征及基因突变研究

目的对1个先天性绕核粉尘状白内障家系的临床特点及基因突变进行研究,探索先天性白内障发病的遗传机制。方法收集确诊为常染色体显性遗传的一个绕核粉尘状白内障家系的外周静脉血,提取基因组DNA,针对现有国内外文献已报道的与该家系白内障表型相关的10个基因设计引物,对患者基因片段进行扩增和序列分析,比对已发现的10个基因序列,查找是否有序列改变。结果被检查者的10个发病相关基因片段的序列中,GJA3基因的外显子发现杂合性突变位点(912C>A,1372A>G),其余9个与GenBank发表的正常序列相同。结论 GJA3基因外显子上发现了新的杂合性突变位点,其对先天性白内障的作用需进一步的研究。     

构建Cx43特异性shRNA真核表达载体及体外干扰效率的鉴定

目的 本研究前期研究结果表明Cx43与穴位、经脉之间存在着密切联系,为了进一步研究Cx43在针刺活动中的作用,我们应用RNA干扰技术首先构建针对Cx43基因的特异性shRNA(small hairpin RNA)真核表达载体,并转染体外培养的NIH/3T3细胞,观察其对Cx43基因的沉默效果,从而挑选出一条能有效沉默Cx43表达的shRNA,为进一步在体研究作准备.方法 针对大、小鼠Cx43 mRNA同源序列的两个靶点,体外合成两对互补的寡核苷酸链.经退火连接形成双链,插入到Pgenesil-1真核表达载体.经酶切鉴定及测序等步骤后,将构建好的表达载体[分别命名为P-Cx43-shRNA(1)、P-Cx43-shRNA(2)]分别转染NIH/3T3细胞,G418筛选后应用免疫荧光、Western blot等方法观察P-Cx43-shRNA对Cx43蛋白水平的影响.结果 酶切鉴定及测序结果表明,成功构建了两个针对Cx43基因的shRNA真核表达载体及对照质粒(P-con-shRNA);Western blot结果说明两个Cx43特异性shRNA真核表达载体分别使Cx43蛋白水平下降了73.5%(P＜0.01)和10.8%(P＞0.05).阴性对照质粒(P-con-shRNA)对NIH/3T3细胞Cx43蛋白水平无明显影响.结论 重组质粒P-Cx43-shRNA(1)能较好的特异性抑制Cx43基因在NIH/3T3细胞中的表达,为进一步在体研究提供了实验依据.     

Cx43在桥本甲状腺炎甲状腺上皮细胞中的表达

目的 探讨Cx43在桥本甲状腺炎甲状腺上皮细胞中的表达,探索其在自身免疫性甲状腺疾病的发病机制、转归及预后中所起的作用.方法 采用二步法免疫组织化学技术(s-P法)测定甲状腺腺瘤旁正常甲状腺组织16例(对照组)和桥本甲状腺炎30例(HT组)甲状腺上皮细胞中Cx43的分布及表达情况.结果 ①对照组和HT组甲状腺上皮细胞均有Cx43的表达,两者既定位于甲状腺上皮细胞的细胞质中,又定位于细胞膜上.②对照组和HT组甲状腺上皮细胞Cx43表达阳性率分别为75.00%(12/16)、33.33%(10/30),Cx43在HT组的表达强度均明显低于对照组(Z=2.703,P<0.007).结论 Cx43可在人甲状腺上皮细胞中表达;Cx43在AITD的表达强度存在异质性,这种缝隙连接蛋白表达的异质性可能与AITD的发生、发展及预后有关.     

原发性肾上腺皮质肿瘤组织中间隙连接蛋白32和43的表达及其临床意义

目的研究间隙连接蛋白(Cx)32和43在原发性肾上腺皮质肿瘤中的表达,探讨其在原发性肾上腺皮质肿瘤的临床诊断及预后评估中的价值。方法应用免疫组化NovolinkTMPolymer法检测21份正常肾上腺组织、45份肾上腺皮质腺瘤及14份肾上腺皮质癌标本中Cx32、Cx43的表达水平,运用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。结果 Cx32和Cx43在肾上腺皮质癌中表达阳性率分别为21.4%和35.7%,明显低于肾上腺皮质腺瘤中的68.9%和75.6%(P=0.002,P=0.010)及正常肾上腺组织中的85.7%和100%(P=0.000,P=0.000);肾上腺皮质腺瘤中Cx43表达的阳性率低于正常肾上腺组(P=0.013)。Cx43的表达与肾上腺皮质腺癌患者的预后相关(P<0.05),Cx43表达越低患者预后越差。在肾上腺皮质癌中,Cx32和Cx43之间的表达呈明显正相关(P=0.015)。结论联合检测Cx32和Cx43的表达对鉴别良、恶性肾上腺皮质肿瘤具有重要的参考意义。Cx43在原发性肾上腺皮质癌组织的表达与患者预后相关,增加其表达可能改善患者预后。     

膀胱移行细胞癌中间隙连接蛋白Cx43mRNA、Bcl-2mRNA和Bax mRNA的表达及其相关性研究

目的 探讨间隙连接蛋白Cx43、Bcl-2及Bax在膀胱移行细胞癌(BTCC)中的表达及其意义.方法 用半定量RT-PCR的方法检测Cx43、Bcl-2及Bax在35例BTCC和21例癌旁组织中的表达情况,并分析其与BTCC临床病理因素的关系.同时取正常膀胱组织15例做对照.结果 BTCC组织中Cx43 mRNA的表达比值[Cx43/人肌动蛋白(β-actin)]为(0.34±0.37),低于BTCC癌旁组织中的(0.79±0.70)和正常膀胱组织的(0.81±0.47),差异有统计学意义(P＜0.01);Bcl-2 mRNA表达比值为(0.35±0.43),高于癌旁组织中的(0.16±0.33)和正常膀胱组织的(0.15±0.23),差异有统计学意义(P＜0.01).癌旁组织与正常膀胱组织Cx43 mRNA及Bcl-2 mRNA的表达比值比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).Cx43 mRNA在BTCC病理分级G3的表达为(0.30±0.16),G2的表达为(0.54±0.22),G1的表达为(0.60±0.25),3个级别比较差异有统计学意义(P＜0.05).Bcl-2 mRNA在BTCC病理分级G3的表达为(0.47±0.15),G2的表达为(0.35±0.11),G1的表达为(0.24±0.10),3个级别间比较差异有统计学意义(P＜0.01).复发BTCC组织中Bcl-2 mRNA的表达水平(0.40±0.15)高于初发癌组织(0.28±0.11),差异有统计学意义(P＜0.05).Bax mRNA在BTCC组织、癌旁组织及正常膀胱组织中的表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05).Bax mRNA的表达水平与BTCC患者的肿瘤分期、病理分级以及肿瘤有无复发比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 Cx43 表达下调与BTCC的发生、进展及其恶性特征有关,Cx43基因可能与凋亡相关基因Bcl-2(或Bcl-2/Bax)在BTCC的发展中起拮抗作用,与细胞的凋亡过程有关.     

一例进行性对称性红斑角化症GJB2基因突变分析

目的对一例进行性对称性红斑角化症(Progressive symmetric erythrokeratodermia,PSEK)患者GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1及SERPINB7基因突变进行检测。方法采用聚合酶反应(PCR)扩增GJB2、GJB3、GJB4、GJB6、GJA1及SERPINB基因所有的外显子及其邻近的剪切点并进行直接测序。结果 PSEK患者的GJB2基因存在杂合突变,核苷酸序列第608位发生错义突变,碱基由T突变成C,GJB2基因编码的蛋白第203位的异亮氨酸转换成苏氨酸突变;GJB3、GJB4、GJA1、GJB6及SERPINB基因未发现突变;患者家庭成员未发现GJB2基因突变。结论 GJB2基因突变可能是该例PSEK患者的致病基因。     

缝隙连接在胃肠道疾病中的作用

缝隙连接是由连接相邻两个细胞之间的连接通道排列而成的一种特殊膜结构,构成缝隙连接的基本单位是连接蛋白(connexin,Cx).在人类中,连接蛋白是由21个同源基因编码的,目前已发现超过20种的连接蛋白,它们的命名是以分子量大小而定.Cx具有4次跨膜结构域,形成2个胞外环和一个胞内环,氨基端和羧基端结构域均位于细胞内[1].细胞膜上每6个Cx聚合形成一个半通道,细胞间两个半通道通过氢键相互锚定形成兼容且有功能的缝隙连接通道[2]. 缝隙连接通道可以允许相对分子质量小于1×103的分子通过,包括腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、环磷酸腺苷(cAMP)、三磷酸肌醇(IP3)和离子.相邻细胞间可以通过缝隙连接进行着信息、能量和物质的交换,参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联,对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起着重要的调控作用.Cx的表达具有组织特异性,在人体胃肠道中至少有10种Cx的表达,其中胃部有Cx26、Cx32、Cx40、Cx43、Cx45;小肠上有Cx26、Cx31、Cx32、Cx36、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45、Cx57;结肠上有Cx26、Cx31、Cx31.1、Cx32、Cx36、Cx40、Cx43、Cx45[3].消化道疾病的发生和发展往往伴随着缝隙Cx的功能异常.本文主要针对缝隙连接在胃部和肠道常见疾病方面的研究进行综述,并探讨缝隙连接作为消化道疾病的分子标记物和治疗靶点的可能性.     

应用PCR测定Cx43转基因小鼠的基因型

目的：应用聚合酶链反应(PCR)技术，检测Cx43(connexin 43)转基因小鼠的基因型。方法：采用CMV43转基因小鼠和Cx43剔除小鼠分别与野生型小鼠杂交繁殖，切取子代小鼠尾巴制备DNA，应用PCR技术扩增DNA，观察目的基因的阳性率。结果：CMV43转基因小鼠子代66个，dhfr PCR检测阳性率为31．8％。Cx43基因剔除小鼠子代21个，分别与Cx43野生型引物和Cx43剔除引物进行PCR，两者均阳性( ／ )12个，百分率为57．1％，前者阳性而后者阴性(杂合子 ／-)7个，百分率为33．3％，两者均阴性(纯合子-／-)2个，百分率为9．6％。野生型小鼠经Cx43野生型引物PCR检测结果均为阳性。结论：PCR技术用于Cx43转基因小鼠基因型的检测敏感度高，特异性强，易操作，可用作Cx43转基因小鼠心血管畸形模型研究的初选方法。     

Mutations of connexin43 in fetuses with congenital heart malformations

Background Gap junction channels formed by connexin43 (Cx43) protein are important in cardiac morphogenesis, and Cx43 gene is thought to be associated with congenital heart malformation (CHM). This study was undertaken to detect the mutations of Cx43 in fetuses with CHM.Methods Cx43 extron DNA was amplified by PCR from 16 fetuses with a variety of CHM. The PCR products were analyzed by SSCP and DNA sequencing. Thirty children who had no CHM were selected as controls.Results Eight homozygous mutations of Cx43 were observed in a fetus with double outlet right ventricule (DORV) , fiveof the 8 mutations were missense mutations including Arg239Trp, Ser251Thr, Ala253Pro,Pro283Leu and Thr290Asn, and the remaining 3 were silent polymorphisms including Gly252Gly,Pro256Pro and Thr275Thr.No mutations were found in other fetuses and the control group.Conclusions Mutations of Cx43 may be associated with congenital conotruncal anomalies. PCR-SSCP is an effective method for screening the mutations of Cx43.     

不同发育时期胚胎肝Cx基因的表达

为探索不同分化阶段胚胎肝中细胞连接蛋白（Ｃｘ）基因表达的时间顺序，规律及其与细胞分化的关系，本文采用Ｃｘ基因系列作为分子探针，通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹法，研究了不同发育时胚胎肝中Ｃｘ基因表达状态。     

风心病慢性房颤心房连接蛋白表达与AERP的相关性研究

目的:通过检测风心病慢性房颤患者左、右心房缝隙连接蛋白Cx40和Cx43表达及相应部位的心房有效不应期(AERP)研究两者之间的相关性,探讨Cx40和Cx43对慢性房颤左、右心房电生理特性的影响. 方法:29例风心病伴或不伴慢性房颤的患者,共分2组:窦性心律组(SR组,n=13),慢性房颤组(CAF组,n=16),另取6例非风心病作为正常对照组.在行二尖瓣置换术时,采用心外膜标测技术测定左、右心房的AERP,并在相应部位切取心房组织,通过Western印迹法检测左、右心房肌Cx40和Cx43的表达,同时对两者行相关性分析. 结果:CAF组患者左、右心房Cx40的表达和AERP较SR组有明显下降(P<0.05),而Cx43无明显变化;左心房后壁Cx40的相对表达量与AERP呈明显正相关(r＝0.762,P<0.01),而Cx43与AERP无明显相关.SR组中,Cx40和Cx43均与AERP无明显相关.结论:在风心病慢性房颤心房中,Cx40表达下调参与慢性房颤的心房重构,并影响心房的电生理特性,提示Cx40的表达对风心病慢性房颤的发生和维持具有重要的作用.     

Involvement of connexin 43 in acupuncture analgesia

Background Connexin 43 （Cx43） is one of the major components of human keratinocyte gap junctions. To study whether gap junctional intercellular communication participates in the transfer of acupoint signals and acupuncture analgesia, the expression of Cx43 was studied in Zusanli （ST36） acupoints compared with control non-acupoint regions in rats after acupuncture. In addition, Cx43 heterozygous gene knockout mice were used to further explore the relationship between Cx43 and acupuncture analgesia.
Methods The expression of Cx43 was detected by immunohistochemistry, immunoblotting, and RT-PCR for the Cx43 protein and mRNA. The influence of the Cx43 gene knockout on acupuncture analgesia was measured by a hot plate and observing the writhing response on Cx43 heterozygous gene knockout mice. Results Immunohistochemistry showed abundant Cx43 expression in some cells in the skin and subcutaneous tissue of rat ST36 acupoints. The mRNA and protein levels of Cx43 in acupoints were significantly higher than those in the control points in the non-acupuncture group, and even more so after acupuncture. The hot plate and writhing response experiments showed that partial knockout of the Cx43 gene decreased acupuncture analgesia. Conclusion Cx43 expression and acupuncture analgesia showed a positive correlation.     

缝隙连接蛋白43 (Cx43)与神经炎症的研究进展

 缝隙连接蛋白43(connexin43, Cx43)是中枢神经系统(central nervous system, CNS)中含量最丰富的连接蛋白,主要分布于星形胶质细胞,以缝隙连接(gap junction, GJ)和半通道(hemichannel, HC)的形式存在,分别介导细胞间和细胞与外环境间的信息交流。随着人口的老龄化,阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)、脑卒中及术后认知功能障碍等疾病的发生率越来越高,神经炎症是这些CNS疾病的一个共同特征,涉及到白细胞聚集、胶质细胞激活、炎性因子释放等,该过程需要高效的信息交流,研究表明Cx43在该过程中发挥着不可忽视的作用,主要表现为GJ抑制和HC活性增加并影响神经功能。本文重点综述Cx43与神经炎症的关系,为多种CNS疾病的治疗提供新的靶点。     

间隙连接蛋白-43调控骨组织细胞间平衡在激素性股骨头坏死中的研究进展

股骨头坏死是一种以股骨头内成骨细胞(osteoblast,OB)成骨活性降低,破骨细胞(osteoclast,OC)破骨活性增大,骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)成骨分化降低、成脂分化增强,血管内皮细胞(endothelial cell,EC)受损、血供减少,致使股骨头内骨代谢处于负平衡状态的一种骨代谢疾病.股骨头坏死与骨组织细胞间信息传递异常密切相关.缝隙连接(gap junction,GJ)是相邻细胞间进行信息传递的一种膜通道结构,GJ在骨组织细胞间物质及信号传导通讯中起重要调控作用.通过GJ进行缝隙连接细胞通讯对上述骨代谢动态平衡具有重要作用;间隙连接蛋白-43 (connexin 43,Cx43)是骨组织GJ中的重要组分.因此,GJ介导的细胞间信息传递与股骨头坏死等骨代谢疾病的发生密切相关.本文从GJ及Cx43在激素性股骨头坏死疾病中的研究进展作一综述.     

Connexin 43 remodeling induced by LMNA gene mutation Glu82Lys in familial dilated cardiomyopathy with atrial ventricular block

Background Mutations in the lamin A/C gene （LMNA） may cause familial dilated cardiomyopathy （dilated cardiomyopathy） characterized by early onset atrio-ventricular block （A-V block） before the manifestation of dilated cardiomyopathy and high risk of sudden death due to ventricular arrhythmia, which is very similar to the phenotype of gap junction related heart disease. This study aimed to determine the expression and localization of connexins in neonatal myocytes transfected with wild-type （WT） or mutant LMNA to elucidate how these mutations cause heart diseases. Methods We studied the connexin 43 （Cx43） and connexin 40 （Cx40） expression in cultured neonatal myocytes transfected with wild-type （WT） or mutant LMNA （Glu82Lys （E82K） and Arg644Cys （R644C）） using confocal imaging and Western blotting analysis. Results Cx43 protein expression was reduced by 40% in cells transfected with LMNA E82K than that in cells transfected with WT LMNA cDNA. Confocal imaging showed that the Cx43 located inside the cells by LMNA E82K. By contrast, LMNA E82K mutation had no effect on expression and localization of Cx40. LMNA R644C transfection did not show any significant effects on gap junctions at all. Conclusions Our findings suggest that LMNA E82K significantly reduced the Cx43 expression and altered its localization which may be one of the pathological mechanisms underlying LMNA-related heart disease.     

Downregulation of Rho associated coiled-coil forming protein kinase 1 in the process of delayed myocardialization of cardiac proximal outflow tract septum in connexin 43 knockout mice embryo

Background  The connexin43 knockout (Cx43 KO) mouse dies at birth with an enlarged conotruncal region, which leads to the obstruction of the right outflow tract (OFT). Since myocardialization of the proximal OFT septum is one of the key events during heart development, we investigated the process in the Cx43 KO embryo hearts. Rho associated coiled-coil forming protein kinase 1 (ROCK1), is a recently found key molecule to regulate the myocardialization of OFT, but its spatiotemporal expression pattern during myocardialization remains unknown. The objective of this study was to investigate the differentially expressed pattern of ROCK1 between Cx43 KO and wild type embryo hearts, and its relationship with the delayed myocardialization in Cx43 KO embryo hearts.

Methods  Using immunohistochemistry, the processes of myocardiolization were investigated both in Cx43 KO and wild type embryo hearts. The differentially expressed pattern of ROCK1 between Cx43 KO and wildtype embryo hearts was evaluated both at the mRNA and protein level by real-time RT-PCR and immunohistochemistry.

Results  The expression of α-sarcomeric actin (α-SCA) in the proximal OFT septum of Cx43 KO embryos was delayed. Meanwhile, it was shown that the downregulation of ROCK1 coincided with delayed myocardialization. The expression of ROCK1 protein was mainly limited to the proximal outflow tract septum from embryo day (E) E11.5 to E15.5. Its expression pattern was similar with that of α-SCA. Real-time RT-PCR found that the expression level of Rock-1 mRNA began at a low level on E11.5 and reached peak at E13.5 and E14.5.

Conclusions  ROCK1 may have an important role in the process of myocardialization of the proximal OFT septum. Downregulation of ROCK1 is likely to contribute to the aberrant myocardialization in Cx43 KO embryo hearts.