大鼠肝Kupffer细胞分离培养及鉴定

目的 :参照 Smedsrod等方法加以适当的修正 ,建立简便、有效和稳定的大鼠肝 Kupffer细胞分离、纯化和培养方法。　方法 :1联合酶原位循环灌注消化 ;2 Nycodenz不连续密度梯度离心 ;3选择性贴壁纯化 ;经大鼠单核 -巨噬细胞单克隆抗体 ED1( MΦ-Mc Ab ED1)鉴定。　结果 :最终获得大鼠肝 Kupffer细胞产量 ( 2 8.68± 4)× 10 6/鼠肝 ,细胞纯度 96% ,细胞活性大于 95 %。　结论 :本文建立的大鼠肝 Kupffer细胞分离方法 ,操作简便易行、效果稳定 ,同时获得的细胞保持良好的生物学性状     

免疫磁珠法分离提纯骨髓造血干细胞方法的建立

目的 :为了建立免疫磁珠法体外分离提纯骨髓造血干细胞的方法。方法 :采用免疫磁珠阴性选择法分选 CBA(H - 2 K)小鼠骨髓细胞的 CD34+ CD38- Scal+ 细胞群 ,台盼蓝染色观察活力 ,流式细胞仪检测荧光标记的 CD34+ CD38- Scal+ 表达阳性率 ,骨髓造血干细胞 (HSCs)在体外克隆形成的分析 ,HSCs在体内造血功能重建的分析。结果 :分选后 CD34+ CD38- Scal+ 表达阳性细胞纯度达 (86 .5± 3.2 ) % ,细胞活力为 (95 .8± 2 .2 ) %。结论 :免疫磁珠阴性选择法分选系统是一种有效的骨髓造血干细胞分离提纯方法 ,省时、简便、纯度高并对细胞的生物活性无明显影响 ,提纯的细胞可直接用于后续实验     

免疫磁珠分离法分选提纯骨髓造血干细胞CD117

目的：探讨用免疫磁珠分离法（magnetic activated cell sorting,MACS）从小鼠股骨、胫骨分离纯化骨髓造血干细胞CD117的方法。方法：收集小鼠骨髓细胞,台盼蓝染色观察其活力,用免疫磁珠分离法分选CD117细胞,流式细胞仪检测荧光标记CD117表达阳性率。结果;未分选前CD117细胞纯度为（41.56±18.77）%,MACS分选CD117细胞纯度（88.68±4.74）%,纯化前后有明显差异（P〈0.05）。结论：MACS阳性选择法分选系统能有效分选骨髓造血干细胞CD117。     

调节性T细胞的MACS分选和纯度鉴定

目的 建立CD4^ CD25^ 调节性T细胞（Regulatory T Cells,Treg)的磁珠（MACS）分选方法，并对分选结果进行纯度鉴定。方法 采用T细胞纯化柱分离小鼠脾脏T淋巴细胞，以抗－CD8－FITC抗体和抗FITC标记磁珠相结合的阴性选择法剔除CD8^ T细胞，再以抗－CD25－FITC抗体和义气风发FITC标记磁珠相结合的阳性选择法选出CD25^ T淋巴细胞；以FACS流式细胞法检测分选的CD4^ CD25^ 调节性T细胞纯度。结果 MACS磁珠分选法能够成功分选出CD4^ CD25^ 调节性T细胞，分选平均纯度达到73％，分选细胞活力为95％。结论 MACS磁珠分选法能够分选出高纯度的Treg细胞，该分选方法不影响分选靶细胞的细胞活力。     

Ly49C基因SiRNA对小鼠NK细胞抗白血病活性的影响

目的:观察SiRNA转染小鼠KIR(Ly49C)基因对NK细胞抗白血病活性的影响。方法:应用免疫磁珠分选法纯化C57BL/6小鼠脾细胞中的NK细胞,体外化学合成以Ly49C基因为靶标的SiRNA,联合用脂质体转染小鼠NK细胞,以未处理组为对照,流式细胞仪检测在SiRNA转染后淋巴细胞表面Ly49C分子的表达率。以空转染和未转染的NK细胞作对照,LDH法检测转染后NK细胞对红白血病细胞FBL-3的的杀伤活性。结果:免疫磁珠分选后NK细胞纯度可达90%以上。Ly49C基因SiRNA转染小鼠NK细胞48 h后Ly49C分子表达率为(30.28±1.41)%,未转染对照组为(58.45±3.32)%。相同效靶比时,转染组NK细胞杀伤活性较未转染组显著提高,二者之间差异有显著统计学意义(P<0.05)。结论:转染Ly49C SiRNA的C57 BL/6小鼠NK细胞对FBL-3细胞的杀伤活性明显增强,为提高异基因骨髓移植后移植物抗白血病作用提供了实验依据。     

免疫磁珠法纯化人外周血CD4~+T细胞

目的 :采用Dynal免疫磁珠法从人外周血单个核细胞 (MNC)中分离和纯化CD4+ T细胞。结果 :经过流式细胞仪测定纯度达到 ( 96.4± 2 .6) % ,0 .2 %台盼兰染色细胞活力为 ( 96.9± 3 .6) % ,增殖试验表明分离后的CD4+ T细胞对植物血凝素 (PHA)的刺激保持了良好的增殖能力 ,为进一步纯化CD4+ T细胞的生物学特性创造了条件。     

正常与受照射的新生儿脐带血中ACl33+细胞的分离与纯化的相关问题探讨

目的探讨正常与受照射的新生儿脐带血中ACl33+细胞的分离与纯化的相关问题.方法采用免疫磁珠活性分选系统(MidiMACS)分离、纯化脐带血,通过流式细胞仪测定ACl33+细胞的纯度.结果在正常与受照射的脐带血单个核细胞(MNC)中,ACl33+细胞所占的比例分别为(0.93±0.20)%和(0.33±0.20)%,两者相比较,差异非常显著(P＜0.01);正常与受照组一次过柱获取的ACl33+细胞的纯度分别为(70.3±4.9)%和(68.3±4.6)%,二次过柱获取的ACl33+细胞的纯度分别为(86.3±5.5)%和(84.5±6.8)%,正常与受照组相比较,无论是一次过柱还是二次过柱,差异均无显著性意义(P＞0.05).结论免疫磁珠活性分选技术是一套有效的分离、纯化系统,可以获得足够数量的造血干/祖细胞;正常与受照射的脐带血MNC中ACl33+细胞所占的比例差异非常显著.     

大鼠肝星形细胞、枯否细胞的同步分离培养与鉴定

目的:建立经济、简便的同步分离培养肝星形细胞及枯否细胞的方法。方法:应用胶原酶和蛋白酶对大鼠肝脏进行原位灌流、消化,获得大鼠肝脏非实质细胞,经18%(W/V)的Nycodenz密度梯度离心,一步分离肝星形细胞及枯否细胞;肝星形细胞处在界面,枯否细胞则处在界面下;台盼蓝染色鉴定细胞活力;Desmin免疫细胞化学染色鉴定肝星形细胞;溶菌酶免疫细胞化学染色鉴定枯否细胞。结果:该方法分离的肝星形细胞和枯否细胞的纯度达95%左右。肝星形细胞得率(3.0±0.5)×107/肝,枯否细胞得率(4.0±0.5)×106/肝。结论:应用Nycodenz一步密度梯度离心法可以很好的同时分离肝星形细胞和枯否细胞。     

钩吻素子对免疫磁珠分离纯化的小鼠CD4+T细胞体外增殖的影响

目的 探讨小鼠脾脏CD4⁺T细胞的分离方法,观察钩吻素子(Kou)对小鼠脾脏CD4⁺T细胞体外增殖的影响.方法 以免疫磁珠分选法从小鼠脾脏细胞中分离CD4⁺T细胞,流式细胞术检测所得细胞的纯度,台盼蓝法检测细胞活力.将10～20μg/ml Kou分别作用于经刀豆蛋白A或植物血凝素刺激的小鼠T淋巴细胞,四唑盐比色法检测细胞增殖情况,用酶联免疫法检测细胞上清中IL-2的含量.结果 经过流式细胞仪测定分离后的小鼠脾脏CD4⁺T细胞纯度达到90.%±5.8%:0.2%台盼兰染色细胞活力为94.9%±.6%;增殖试验表明分离后未加Kou的CD4⁺T细胞对刀豆蛋白A、植物血凝素的刺激保持了良好的增殖能力,当浓度范围为20～20μg/ml时,Kou均能抑制淋巴细胞的增殖(P<0.05),且表现出一定的剂量相关性;不同浓度的Kou(20、100、200μgm1)作用后,CD4⁺T细胞培养上清中的IL-2水平明显低于对照组(P<0.05).结论 免疫磁珠阴性分选法操作简单、快速,可获得较高纯化率、有活性的CD4⁺T细胞;Kou明显抑制小鼠CD4⁺T淋巴细胞增殖反应,此抑制作用可能与Kou抑制小鼠CD4⁺T细胞IL-2的分泌及免疫抑制作用相关.     

免疫磁珠法纯化小鼠CD34+造血干细胞

目的探讨免疫磁珠法(MiniMACS)能否用于纯化小鼠骨髓CD34+造血干细胞.方法应用免疫磁珠纯化小鼠骨髓CD34+细胞,流式细胞仪(FACS)评估纯化效率,检测纯化后的细胞活力.结果纯化后CD34+细胞纯度81.5%(范围76.80%～85.38%),回收率47.54%(范围40.50%～54.31%),纯化前后细胞活力不受影响(P=0.169).结论应用MiniMACS纯化小鼠骨髓可获得高纯度CD34+细胞,并不影响细胞活力.     

应用联合酶建立BALB/c鼠枯否氏细胞体外分离培养方法

目的用作用功效不同的酶联合消化分离BALB/c鼠枯否氏细胞(KC),建立简便易行,产量、活性、纯度较稳定的KC分离培养方法。方法将0.1%型胶原酶、0.2%链霉蛋白酶、0.01%Dnase酶按1∶1∶1比例混合原位灌注和离体消化肝组织,经Percoll梯度离心,贴壁培养纯化细胞,应用荧光显微镜观察、免疫组织化学染色、吞噬功能实验进行鉴定。结果KC获得率为(2~3)×106/鼠肝,细胞存活率达96%,免疫组化和吞噬实验鉴定细胞纯度达92%。KC贴壁后形态大小不规则,呈多角形或星形,免疫组织化学染色显示溶菌酶阳性,胞浆内见吞噬的碳素墨汁颗粒。结论用作用功效不同的酶联合消化KC,经梯度离心和贴壁培养,可获得高产量、高活性、高纯度的BALB/c鼠KC,为进一步研究KC在肝脏疾病中的作用提供可靠的细胞来源。     

脐血CD34^＋细胞分离方法比较

目的：比较不同方法分离脐血单个核细胞（MNC）及纯化CD34＋细胞效果。方法：采集脐血48份，在室温下保存12、24、48小时，分别用密度离心法和羟乙基淀粉（HES）沉淀法分离脐血MNC，再用免疫磁珠法纯化CD34^＋细胞，以台盼蓝拒染法检测细胞存活率。结果：脐血在室温下保存48小时分离MNC和CD34^＋细胞数最多．其次为12小时，在24小时分离所得最低（P〈0．05）；HES沉淀法较密度离心法分离所得MNC和CD34^＋细胞数明显增多（P〈0．05）；6组细胞存活率差异无统计学意义（P〉0．05）；免疫磁珠法纯化CD34^＋细胞可达（88±5）％的纯度。结论：HES沉淀法优于密度离心法，且48小时分离为优，免疫磁珠法纯化CD34＋细胞可提高纯度：各种方法对细胞存活率无明显影响。     

免疫磁珠分选法原代培养小鼠肺微血管内皮细胞

目的：探讨一种高效、稳定的小鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）原代培养方法。方法：选取45只1周龄Balb/c小鼠,随机分成3组,分别用酶消化法、组织贴块法、免疫磁珠分选法3种方法分离培养小鼠PMVECs,观察细胞形态学以及VIII因子相关抗原免疫荧光染色鉴定内皮细胞,计算各组原代培养成功率及从原代培养开始到首次传代所需时间,测定细胞纯度,MTT法绘制生长曲线。结果：3组原代培养的细胞在倒置显微镜下均能见到短梭形、多边形的微血管内皮细胞,血管内皮细胞特异性标志物VIII因子相关抗原表达阳性。免疫磁珠分选法组原代培养成功率及细胞活性显著高于其他2组,差异有统计学意义（P＜0.01）,从原代培养至首次传代所需的时间短于组织贴块法组,差异有统计学意义（P＜0.05）,细胞纯度显著高于酶消化法组,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：相比于酶消化法与组织贴块法,免疫磁珠分选法原代培养小鼠PMVECs具有重复性好,分离速度快,细胞纯度高及活性好的优点。     

Separation of CD34 positive cells and determinationof surface homing antigen

Immunomagnetic beads were magnetic particlescoated with-monoclonal antibody. They could specifi--.cafly combine with target substances and enable thelatter to respond to magnetism. When they were putinto a magnetic field, the magnetic beads binding thetarget substances were retarded thereby being separated from other elements. Matters of interest couldbe purified and enriched by this technique. Themethod has been used to separate different kinds of 'bone marrow (BM) and blood cells, tumor cel…     

胆盐对枯否细胞功能的影响

为了证实梗阻性黄疸时高浓度的胆盐对肝枯否 (Kupffer)细胞功能的抑制作用 ,在分离培养的大鼠高纯度的枯否细胞中加入不同终浓度的胆盐 (GCDC) ,并分别进行MTT(噻唑蓝 )、中性红吞噬及TNF(肿瘤坏死因子 )释放的检测。结果表明 :当GCDC <2 5μmol/L时 ,对枯否细胞的活性及功能无明显影响 ;而当GCDC >50 μmol/L时 ,对枯否细胞的活性、吞噬功能及分泌功能均显示出浓度依赖性的抑制作用。提示 ,胆盐对枯否细胞功能具有抑制作用 ,可能在梗阻性黄疸的发展过程中起重要作用     

分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞

目的：建立稳定的同时分离原代大鼠肝细胞（HC）、肝星状细胞（HSC）和Kupffer细胞（KC）的方法,并初步评估其在体外培养的特征。方法：通过胶原酶原位灌注获得肝脏单细胞悬液,随后行等密度离心结合选择性贴壁纯化肝脏原代细胞,细胞的产量和活力经自动细胞计数仪计算出,纯度经免疫荧光、特殊染色及吞噬等实验进行鉴定。结果：大鼠原代HC产量为（21.0±8.2）×106/g肝组织,活力为92.1%±2.1%,纯度为96.5%±2.2%;原代HSC产量为（2.5±0.8）×106/g肝组织,活力为90.1%±3.8%,纯度为93.1%±1.5%;原代KC产量为（4.1±1.2）×106/g肝组织,活力为96.2%±2.7%,纯度为95.1%±1.4%。分离的HC、HSC和KC适合体外长期培养。HSC在体外培养过程中失去维生素A,逐渐向成纤维细胞表型转变。KC在体外可增殖,至14 d时仍表达CD68,具有较强的吞噬能力。结论：成功建立同时分离和培养大鼠HC、HSC和KC的方法,为进一步研究肝脏病理生理提供细胞基础。     

Studies of the effects of heparin，dexamethasone and ibuprofen on clearance function of hepatic Kupffer cell complement recept

Ｓｔｕｄｉｅｓｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｈｅｐａｒｉｎ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅａｎｄｉｂｕｐｒｏｆｅｎｏｎｃｌｅａｒａｎｃｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃＫｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｒｅｃｅｐｔｏｒｓｄｕｒｉｎｇａｃｕｔｅｏｂ...     

联合免疫磁珠与逆转聚合酶联反应在肝细胞癌患者外周血癌细胞检测中的应用

目的 研究联合免疫磁珠分类与巢式逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）在肝细胞癌患者外周血癌细胞检测中的应用价值。方法 分别收集肝细胞癌（45例）、肝硬化（16例）、肝炎（20例）患者及健康人（18例）的外周血，以CD15和Ber-EP4免疫磁珠富集血液中的癌细胞，用巢式RT-PCR检测其外周血甲胎蛋白（AFP）mRNA水平。结果 AFPmRNA在肝细胞癌、肝硬化和肝炎患者的检出率分别为72．1％．43．8％和25．0％，肝细胞癌组与肝硬化组和肝炎组比较的差异均有显著性意义（P〈0．05和P〈0．01）。结论 联合免疫磁珠分类与巢式RT-PCR法可提高肝细胞癌患者外周血AFPmRNA的检出率。     

一种新的内皮细胞分离方法

目的　探索一种新的内皮细胞分离方法。方法　利用内皮细胞特有的CD31抗体和磁珠包被的抗体结合 ,用磁力架将内皮细胞分离出来。结果　分离出的内皮细胞形态完整 ,纯度较高。结论　用磁珠法分离内皮细胞纯度高 ,方法简单易行 ,且整个过程在低温下进行 ,有利于细胞培养、构建文库等后续工作的进行     

大鼠肝星状细胞的简易分离法

目的在肝脏二步酶灌注法分离大鼠肝星状细胞的基础上,探讨一种简单易行且结果稳定的分离方法。方法采用大鼠肝脏二步酶灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经密度梯度离心去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,结蛋白(Desmin)免疫荧光鉴定肝星状细胞的纯度。结果肝星状细胞的得率为4.0×107以上,肝星状细胞纯度为96%左右,肝星状细胞存活率为(95.0±1.2)%。结论本实验采用的大鼠肝星状细胞的分离方法,结果稳定,细胞纯度较高,有利于进一步的生物学研究。