免疫荧光技术中不同固定剂对RhoA蛋白定位的影响

目的：观察免疫荧光技术中不同固定剂对SGC7901细胞中RhoA蛋白定位的影响，找出最适合观察RhoA蛋白细胞内定位的固定方法。方法：采用免疫荧光的方法观察在使用不同固定剂（2％多聚甲醛，4％甲醛，甲醇，丙酮，10％三氯醋酸）及0．3％TritonX-100穿孔的条件下，RhoA蛋白在SGC7901细胞中的定位。结果：用2％多聚甲醛固定，不用0．3％TritonX-100时，染色显示胞质内可见少量RhoA蛋白散在分布，核内则有RhoA蛋白浓聚；用0．3％TritonX-100后，质内只能见极少量阳性染色，核内蛋白染色变得清晰。甲醛固定后染色显示RhoA蛋白主要在核内分布，使用TritonX-100后染色更为清楚。甲醇和丙酮固定后染色显示RhoA蛋白主要在胞质内分布，核内基本未见阳性分布，加TritonX-100后核内染色增强，胞质染色减弱。另外，使用10％三氯醋酸固定未加TritonX-100时染色较淡，胞质胞核都可见，加TritonX-100后核内可见蛋白浓聚，胞质染色减少。结论：用免疫荧光法观察RhoA定位时，固定剂的不同以及是否加TritonX-100对观察RhoA蛋白细胞内定位具有较大的影响。     

不同固定剂对鼻息肉上皮细胞免疫荧光染色的影响

目的 通过激光共聚焦技术,观察鼻息肉体外培养上皮细胞在3种不同固定剂作用下的免疫荧光染色效果,探讨不同固定剂对免疫荧光染色结果的影响,从而选择最佳固定方法。方法 用酶消化法分离培养鼻息肉上皮细胞,接种培养7 d后,分别用4%（质量分数）多聚甲醛（paraformaldehyde,PFA）、等体积甲醇丙酮混合液及甲醇室温固定,1%（体积分数）Triton X-100透膜,山羊血清封闭,滴加一抗4 ℃过夜,滴加相应荧光二抗,含DAPI封片剂封片,激光共聚焦显微镜观察。结果 等量甲醇丙酮混合液及甲醇对标记的4个标记蛋白均有较好的固定作用;4%（质量分数）PFA对跨膜蛋白16A（transmembrane protein 16A,TMEM16A）固定效果差,对紧密连接蛋白（zonular occludens-1,ZO-1）的固定效果不理想。结论 甲醇丙酮混合液及甲醇对标记的4个标记蛋白的固定作用均较好,为体外培养细胞免疫荧光染色最佳固定剂的选择提供参考。     

不同固定方法对细胞免疫荧光染色结果的影响

目的 比较不同的固定方法对细胞内胞浆蛋白Vigilin和核蛋白CTCF的免疫荧光染色结果的影响.方法 在免疫染色前,分别采用四种方法对HepG2细胞进行固定及通透：①纯甲醇-20℃处理8min后,再用80％丙酮—20℃处理1min.②甲醇;丙酮的1∶1混合溶剂-20℃处理10min.③在方案2的基础上,再用0.1％ Triton-X-100冰上通透10min.④4％多聚甲醛室温固定10min后,用0.1％％Triton-X-100冰上通透10min.结果 采用方案①、②、③、④得到的胞浆蛋白vigilin在细胞内的大致分布无明显差异,但用方案④处理后,染色效果更为清晰而能更好地观察到细胞的细微结构;另外,采用方案①和方案②处理细胞后,对核蛋白CTCF进行免疫染色,可见CTCF分布于胞浆;方案③中,在纯甲醇固定后,若用0.1 ％Triton-X-100通透,则CTCF显示主要分布于细胞核内,胞质内亦有阳性染色;方案④的通透条件下,CTCF特异性分布于细胞核,胞质内几乎无阳性染色.结论 不同的固定及通透方法对免疫染色的结果影响很大,应针对抗原特点,采用适宜的固定方法,以得到正确的实验结果.     

AngⅡ对心肌细胞Kv4．2钾通道蛋白表达的影响及机制

【目的】体外培养新生大鼠心肌细胞,观察AngⅡ在诱导细胞肥厚过程中对Kv4．2蛋白表达的影响,及钙离子在其细胞内信号传导通路中的作用。【方法】AngⅡ心肌细胞肥大模型,用激光共聚焦显微镜检测AngⅡ对心肌细胞胞浆钙离子浓度的影响,用流式细胞仪检测AngⅡ诱导心肌细胞肥厚过程中细胞Kv4．2表达的变化。【结果】AngⅡ明显增加细胞的蛋白总量,诱导心肌细胞肥大,AngⅡ能增加心肌细胞胞浆钙离字浓度,下调Kv4.2编码的通道蛋白的表达含量。【结论】AngⅡ在诱导心肌细胞肥大过程中,可能通过细胞内钙离子以外的信号通路下调Ito通道蛋白Kv4．2。     

PYK2介导H460肺肿瘤细胞失巢凋亡抗性的机制

【目的】研究蛋白激酶PYK2对悬浮状态下的肺癌细胞H460失巢凋亡抗性的作用和PYK2的下游通路蛋白。【方法】RNA干扰实验采用逆转录病毒载体介导的稳定表达系统降低PYK2蛋白的表达;细胞悬浮培养实验用polyHEMA培养方法;用PARP 断裂带和DAPI荧光染色检测细胞凋亡情况;细胞侵袭能力用侵袭小室实验;磷酸化蛋白激酶水平用免疫印记实验检测。【结果】用RNA干扰沉默能够降低H460细胞中PYK2蛋白的表达。抑制PYK2的表达能够降低悬浮培养H460细胞增殖能力和促进细胞凋亡增加。此外,沉默PYK2的表达能使肿瘤细胞侵袭能力下降, 并降低磷酸化Paxillin和Src的水平,但不能降低磷酸化JNK、AKT和ERK的水平。【结论】 PYK2信号通路在H460肺癌细胞失巢凋亡抗性中起重要作用,Paxillin和Src可能是PYK2的下游通路蛋白。     

成人视网膜前体细胞的体外分离培养和鉴定

 【目的】对成人视网膜前体细胞进行体外分离、培养和鉴定。【方法】成人眼球12只，“机械分离联合酶消化法”分离出睫状上皮层的色素性细胞。10ng／mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）＋10ng／mL表皮生长因子（EGF）的无血清DMEM／F12培养液中培养，并从三方面鉴定其神经干细胞特性：A．免疫荧光染色检测神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白Nestin的表达；B．自我更新能力：原代神经球消化传代后，继续培养观察新神经球的形成；C．多向分化潜能：原代细胞培养4～5d，改用含10mL／L胎牛血清的DMEM/F12培养液。继续培养7～10d，分别用抗神经丝蛋白（NF）抗体、抗微管相关蛋白-2（MAP2）抗体、抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体、抗视紫质蛋白抗体、抗β-微管蛋白抗体以及抗无长突细胞特异性抗体作免疫荧光细胞染色。【结果】0．48％±0．08％（1：208）原代细胞在含bFGF＋EGF无血清培养条件下能保持增殖未分化状态。形成神经球样结构，消化传代后90．1％±8．3％的第二代细胞能重新形成新的神经球样结构，具有自我更新能力：原代及传代后的神经球均表达神经干细胞特异性抗原nestin；在含10mL／L胎牛血清的促分化培养液中。细胞分别分化为可表达神经细胞、星形神经胶质细胞和感光细胞等特异性抗原的细胞，表明具有多向分化潜能。【结论】在成人眼睫状体扁平部分离得到具有干细胞特性的视网膜前体细胞，并在体外成功进行培养鉴定。     

不同固定方法对初级纤毛蛋白免疫荧光的影响

目的：比较不同固定方法对动物细胞初级纤毛组分免疫荧光染色的影响,探究初级纤毛免疫荧光成像的优化策略。方法：选择4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)、甲醇(MeOH)、10%三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)固定细胞,后续使用相同的透化、封闭、抗体孵育条件,最后比较相同拍摄参数下初级纤毛的成像效果。结果：PFA固定法可使纤毛轴丝蛋白和部分纤毛膜蛋白有更好的染色效果,MeOH固定法可以更清晰地展现纤毛底部定位的蛋白。相比前两种方法,TCA固定的细胞虽然纤毛轴丝的染色效果很差,但适用于部分纤毛膜蛋白和轴丝结合蛋白。除荧光强弱不同外,使用不同方法固定后染色得到的蛋白定位也有微小差异。结论：3种固定方法在初级纤毛免疫荧光实验中各有优劣,需要综合考虑实验目的以及目标蛋白的特点进行选择。     

钙激活性CI-通道阻断剂对气道平滑肌细胞增殖的抑制作用

【目的】探讨钙激活性CI-通道阻断剂尼氟灭酸(NFA)对平滑肌细胞(ASMCs)增殖的影响及机制。【方法】采用[3H]-TdR掺入法检测不同剂量NFA对ASMCs增殖活性的影响。观察NFA及硝苯地平对组胺致ASMCs中[Ca2 ]i变化的影响。间接免疫荧光法观察NFA对ASMCs表达MAPK蛋白的影响。【结果】10μmol/L和50μmol/L NFA组细胞的活性明显低于对照组,并且高浓度50μmol/L NFA组比低浓度10μmol/LNFA组更显著,表现出剂量依赖性。对照组ASMCs胞浆和胞核呈现亮绿色荧光,胞膜周围较淡,加入激动剂组胺后,荧光亮度逐渐增强。相反,当同时存在NFA或硝苯地平干预时,镜下观察荧光强度变化不够明显。间接免疫荧光染色结果表明,培养24 h后,对照组中ASMCs细胞沿梭形胞浆出现大斑片状亮绿色荧光,而NFA干预组细胞表现为弱绿色荧光,胞浆内分布区域局限。【结论】NFA能有效抑制培养ASMCs的增殖活性,可能是通过阻断钙激活性CI-通道对[Ca2 ]i的正反馈效应,以及降低MAPK的表达来实现的。     

漆黄素通过调节Apaf-1,ERK和COX-2信号通路诱导人宫颈癌细胞凋亡

【目的】 探讨天然产物漆黄素抗宫颈癌细胞生长及其分子作用机制?【方法】 以人宫颈癌Hela细胞为模型,将漆黄素作用于细胞,利用MTT?PI以及Annexin V方法观察细胞的生长和凋亡情况,通过Western blot?RT-PCR以及免疫荧光方法分别考察凋亡相关信号通路的关键蛋白caspase和Apaf-1的表达水平和活性变化,ERK/MAPK信号通路中ERK1/2蛋白的磷酸化水平的变化,以及COX-2蛋白和PGE2的表达水平的变化,并通过使用小分子抑制剂和RNA干扰技术等方法进一步分析上述关键蛋白在漆黄素抗肿瘤细胞生长中的作用?【结果】漆黄素(当作用浓度为80~200 ?滋mol/L时)可显著抑制20% ~ 48%Hela细胞增殖和(当作用浓度为100 ~ 200 ?滋mol/L时)显著诱导细胞凋亡; 使Caspase-3和Caspase-9的蛋白酶活性分别增加20% ~ 50%和22% ~ 38%;促进Apaf1蛋白的表达;能有效诱导Cytochrome-C的释放;降低 ERK/MAPK信号通路中ERK1/2蛋白的磷酸化水平;与ERK抑制剂或siRNA联合使用可抑制60% ~ 70%细胞增殖;减少COX-2蛋白的表达;明显减少PGE2的产生,仅1800 ~ 2600 pg/mL;减少p300?NF-κB? p50?p65与COX-2启动子的结合,与对照组比较,差异有统计学意义(P < 0.05)?【结论】 漆黄素通过调控Apaf-1?ERK和COX-2的分子机制来诱导宫颈癌Hela细胞的凋亡及抑制细胞生长?     

鼠疟原虫红细胞内期间接荧光抗体试验中固定剂效果的探讨

本文在鼠疟原虫红细胞内期间接荧光抗体试验中,选用不同的固定剂(福尔马林,多聚甲醛,甲醇和丙酮)和自然干燥法固定抗原片,其中以多聚甲醛、福尔马林和丙酮等固定剂和自然干燥法效果较好,甲醇固定剂效果较差。多聚甲醛固定的虫体所显示荧光特异,呈蜂窝状和圆圈状。抗原片分别保存在4℃与～20℃冰箱内,原虫抗原性均可以保存3个月。