醛固酮对大鼠肾小球系膜细胞表达结缔组织生长因子的影响

目的:探讨醛固酮(ALD)对大鼠肾小球系膜细胞表达结缔组织生长因子(CTGF)的影响,及转化生长因子β1(TGF-β1)是否参与其信号通路。方法:大鼠肾小球系膜细胞加入不同浓度的ALD共同培养0、12、24、36、48h,RT-PCR方法评价CTGF mRNA的表达;用ELISA方法检测TGF-β1蛋白的表达;并用TGF-β1/Smads信号通路的特异性丝、苏氨酸激酶抑制剂Staurosporine(STA)加以对比。结果:ALD刺激后肾小球系膜细胞CTGF mRNA表达水平增加,且呈剂量依赖性,TGF-β1蛋白表达也明显增加;用STA预处理1h后再用ALD刺激24h,则CTGFmR-NA的表达无明显变化。结论:ALD通过TGF-β1/Smads途径上调肾小球系膜细胞表达CTGF。     

蛋白激酶C参与脂多糖诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达

目的:观察蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)在内毒素/脂多糖(lipopolysacchride,LPS)诱导血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达上调中可能发挥的作用。方法:以肺微血管内皮细胞为研究对象,用PKC抑制剂预处理内皮细胞,以RT-PCR检测VEGF mRNA水平的表达变化;Western Blot检测其蛋白质水平的表达变化。结果:(1)VEGF mRNA的表达水平与LPS呈剂量和时间依赖的关系;(2)PKC抑制剂calphostin c预处理内皮细胞能显著抑制LPS诱导VEGF mRNA和蛋白的表达。结论:LPS可能通过PKC信号通路而诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达上调。     

促红细胞生成素对高糖环境下系膜细胞凋亡的影响及其可能机制

目的探究促红细胞生成素（EPO）在高糖环境下对正常人肾小球系膜细胞凋亡的影响及其可能机制,为延缓糖尿病肾病（DN）进展寻找新的治疗方法。方法体外培养正常人肾小球系膜细胞。将培养后的正常人肾小球系膜细胞随机分为8组:空白对照（A）组（未加任何刺激物）,高糖（B）组(D-葡萄糖30 mmol·L-1),高渗（C）组(甘露醇25 mmol·L-1),EPO（D）组(EPO 20 U·mL-1),低浓度EPO干预（E）组(D-葡萄糖30 mmol·L-1+EPO 5 U·mL-1),中浓度EPO干预（F）组(D-葡萄糖30 mmol·L-1+EPO 10 U·mL-1),高浓度EPO干预（G）组(D-葡萄糖30mmol·L-1+EPO 20 U·mL-1),Y27632（H）组(D-葡萄糖30 mmol·L-1+Rho激酶抑制剂10μmol·L-1)。各组细胞均培养24 h。RT-PCR检测各组RhoA mRNA、ROCK1 mRNA的表达水平,流式细胞术检测各组的细胞凋亡。结果C、D、E 3组系膜细胞凋亡率与A组比较差异无统计学意义（P>0.05）。与B组比较,C、D、E、F、G 5组系膜细胞凋亡率、RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达水平均降低,H组系膜细胞凋亡率、ROCK1 mRNA表达水平均降低（均P<0.05）;与E组比较,F、G、H 3组系膜细胞凋亡率均升高,RhoA mRNA、ROCK1 mRNA表达水平均降低（均P<0.05）;与F组比较,G、H 2组系膜细胞凋亡率、ROCK1 mRNA表达水平均降低,G组RhoA mRNA表达水平降低、H组RhoA mRNA表达水平升高（均P<0.05）。Pearson相关性分析结果显示,B组及E、F、G 3组RhoA mRNA表达与ROCK1 mRNA表达均呈正相关（r=0.829、0.898、0.831、0.861,均P<0.05）。结论 EPO可抑制高糖诱导的正常人肾小球系膜细胞的凋亡,其作用机制可能与阻断RhoA/ROCK信号通路有关。     

高糖刺激对体外培养大鼠肾小球系膜细胞表达TGF-β_1和PDGF-BB的影响

目的探讨高糖刺激对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)表达转化生子因子(TGF-β1)和血小板源性生长因子(PDGF-BB)的影响。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,传代后分为正常组(葡萄糖浓度为5.6mmol/L)、高糖A组(葡萄糖浓度为15mmol/L)、高糖B组(葡萄糖浓度为30mmol/L),分别培养12h、24h、48h后,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定各组细胞TGF-β1和PDGF-BB mRNA的表达水平,应用免疫细胞化学法检测各组细胞中TGF-β1和PDGF-BB蛋白的表达。结果①正常组细胞可表达TGF-β1及PDGF-BB;②与正常组相比,高糖各组细胞TGF-β1和PDGF-BB的mRNA及蛋白表达均升高(P<0.01);③与高糖A组比较,高糖B组系膜细胞中TGF-β1和PDGF-BB的mRNA及蛋白表达均升高(P<0.01)。结论高糖刺激可以上调大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1和PDGF-BB的表达。     

脂联素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的 观察脂联素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响,探讨脂联素在糖尿病肾病中可能的保护作用.方法 体外培养大鼠肾小球系膜细胞,随机分为7组:对照组、高糖A组、高糖B组(培养液葡萄糖浓度分别为5.6 mmol/L、15 mmol/L、30 mmol/L);脂联素A、B、C、D组(各组培养液葡萄糖浓度均为30 mmol/L+脂联素,脂联素浓度依次为2.5 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml),作用24 h,RT-PCR法测定各组细胞VEGF mRNA表达水平;ELISA法测定各组上清液中VEGF蛋白的含量.结果 与对照组相比,高糖A组、高糖B组大鼠肾小球系膜细胞VEGF mRNA及VEGF蛋白表达升高(P＜0.05);脂联素各组大鼠肾小球系膜细胞VEGF mRNA及VEGF蛋白表达低于高糖B组(P＜0.05).结论 高糖可刺激大鼠肾系膜细胞VEGF表达增高,脂联素可抑制高糖环境下系膜细胞对VEGF的表达.     

Resveratrol对高糖所致大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1表达的影响

目的:探讨高糖对大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1表达的影响及Resveratrol的干预作用.方法:体外培养大鼠肾小球系膜细胞.①分为正常对照组(NC组,匍萄糖浓度5.6 mmol/L)、高糖组(HG组,葡萄糖浓度30 mmol/L),分别观察24、48、72 h;②分为NC组、HC组、Resveratrol组(Res组,葡萄糖浓度5.6 mmol/L+Resvemtrol 20 μmol/L)和高糖+Rcsvcratrol组(HG+Res 组,葡萄糖浓度30 mmol/L+Resveratrol浓度分别为5、10、15、20 μmol/L),各组细胞分別培养48 h.用半定量RT-PCR和Western blotting法检测细胞内TGF-β1 mRNA和蛋白表达变化.结果:①与NC组相比,HG刺激后大鼠系膜细胞TGF-β1 mRNA和蛋白表达明显增加,差异均有显著性,P值均<0.01;②与HC组相比,HG+Resveratrol干预后,大鼠系膜细胞TGF-β1 mRNA和蛋白表达呈浓度依赖性减少,差异均有显著性(P值分别为<0.05,<0.01).Res组和NC组之间TGF-β1 mRNA和蛋白表达的差异无显著性(P>0.05).结论:高糖能上调大鼠肾小球系膜细胞TGF-β1 mRNA和蛋白表达,Resveratrol可能通过抑制高糖引起的系膜细胞TGF-β1高表达而在糖尿病肾病中起治疗作用.     

PAF通过PKCβ途径对系膜细胞分泌细胞外基质的影响

目的 探讨血小板活化因子(PAF)是否通过高糖可激活蛋白激酶C-β(PKCβ)途径调节高糖高脂环境下细胞外基质(ECM)的分泌.方法 将人肾小球系膜细胞分成6组:正常对照组、PAF组、PAF+ LY333531组、高糖高脂组、高糖高脂+ PAF组、高糖高脂+PAF+ LY333531组;ELISA法测定各组中纤维联接蛋白(Fn)及Ⅳ型胶原(ColⅣ)含量,实时定量PCR测定PKCβ Ⅰ mRNA表达水平.结果 与正常对照组比较,其他5组Fn、ColⅣ、PKCβ Ⅰ mRNA表达增加(P＜0.05);与PAF组比较,PAF+ LY333531组Fn、ColⅣ、PKCβ Ⅰ mRNA表达减少(P＜0.05);与高糖高脂+ PAF+LY333531组比较,高糖高脂组、高糖高脂+ PAF组Fn、ColⅣ、PKCβ Ⅰ mRNA表达显著增加(P＜0.05).结论 高糖高脂环境下PAF通过促进PKCβ Ⅰ表达刺激Fn、ColⅣ分泌;当加入LY333531时,ECM分泌减少,PKCβ Ⅰ抑制剂对肾脏可能具有一定的保护作用.     

NS-398通过转化生长因子-β/Smad信号通路对肾小球系膜细胞环氧化酶-2表达的影响

目的:探讨COX-2抑制剂NS-398对转化生长因子-β(TGF-β)影响肾小球系膜细胞表达环氧化酶-2(COX-2)及Smad2 mRNA表达的作用。方法:传代培养系膜细胞后取第4代系膜细胞进行分组实验,用RT-PCR方法测定各组COX-2 mRNA及Smad2 mRNA的表达,观察不同浓度TGF-β在4、12、24h对COX-2 mRNA及Smad2 mRNA表达的影响,及NS-398对其的抑制作用。结果:不同浓度TGF-β作用不同时间后,系膜细胞COX-2 mRNA和Smad2 mRNA表达均增加,呈浓度和时间依赖性。与TGF-β组相比,加入COX-2抑制剂NS-398后,COX-2 mRNA和Smad2 mRNA表达均减少。结论:TGF-β刺激肾小球系膜细胞COX-2表达的信号通路之一是Smad信号通路。而COX-2抑制剂NS-398对COX-2表达的抑制机制之一是通过此信号通路。     

Losartan下调高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞TGF-β受体的表达

目的 观察血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂losartan对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞TGF-β受体表达的影响.方法 取4～8代系膜细胞进行实验.系膜细胞转种在50mL塑料培养瓶和置有消毒盖玻片的24孔培养板中培养.系膜细胞长至亚融合状态时,换成无血清RPMI～1640培养基培养24 h,使细胞同步于静止期,然后分为4组:低糖(LG)组:加10%FBS RPMI-1640培养液(葡萄糖浓度为5.6 mmol/L);低糖+D-甘露醇(LG+M)组:加D-甘露醇(D-Mannitol)24.4 mmol/L和10%FBS RPMI-1640培养液(葡萄糖浓度为5.6 mmol/L);高耱(HG)组:加10%FBS RPMI-1640高糖培养液(葡萄糖浓度为30 mmol/L);高糖+losar-tan(HG+L)组:加losartan 10-5mol/L和10%FBS RPMI-1640高糖培养液(葡萄糖浓度为30mmol/L).各组系膜细胞继续培养72 h.每3瓶细胞作为1组,用半定量RT-PCR检测各组系膜细胞转化生长因子β1型受体(TβRI)、转化生长因子βⅡ型受体(TBRⅡ)和纤维连接蛋白(FN)MRNA的表达.24孔培养板中每4孔作为1组,用免疫组织化学检测各组系膜细胞Tβ RⅠ、Tβ RⅡ和FN蛋白表达.结果 HG组TβRⅠ、TβRⅡ和FN mRNA表达以及TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表达显著高于LG组和LG+M组(P<0.05).加入losartan后,HG+L组Tβ RⅠ、Tβ RⅡ和FN mRNA表达显著降低,T β RⅠ、Tβ RⅡ蛋白表达也显著降低(P<0.05).与LG组比较,LG+M组Tβ RⅠ、TβRⅡ和FN mRNA表达以及TβRⅠ、TβRⅡ蛋白表达差异均无显著性(P>0.05).结论 高糖上调肾小球系膜细胞TGF-β受体和FN的表达,其作用与渗透压无关.血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂losartan能逆转高糖的上述作用.从而产生肾保护作用.     

肾康丸对高糖培养大鼠系膜细胞TGF-β_1/Smad信号通路的影响

目的:观察肾康丸对高糖培养大鼠系膜细胞(MC)TGF-β1/Smad信号通路的影响,探讨其防治糖尿病肾病(DN)的分子作用机制。方法:体外培养大鼠MC,将细胞分为6组,培养72 h后,ELISA法检测MC上清中TGF-β1含量;RT-PCR法检测MC中TGF-β1mRNA表达;Western blot法检测MC中Smad 2、3和7蛋白表达。结果:与正常葡萄糖组比较,高糖组MC上清中TGF-β1含量增加,MC中TGF-β1mRNA表达上调(P<0.01),Smad 2和3蛋白表达增加,而Smad 7蛋白表达降低。肾康丸和开搏通治疗后可以降低高糖诱导的TGF-β1分泌和mRNA表达的增加(P<0.01或P<0.05);减少Smad 2、3蛋白的表达,增加Smad 7蛋白的表达。结论:肾康丸可以抑制高糖激活MC细胞中TGF-β1/Smad信号通路。     

蛋白激酶Cα参与高糖致人系膜细胞癌胚纤维连接蛋白的表达

目的:研究高糖环境下人系膜细胞(HMC)蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)、癌胚纤维连接蛋白(oncofetal FN)表达水平,并进一步探讨PKCα与oncofetal FN mRNA之间的关系。方法:实验HMC分组如下:正常葡萄糖组(NG,5 mmol/L D-葡萄糖),渗透压对照组(LG,5 mmol/L D-葡萄糖+20 mmol/L L-葡萄糖),高葡萄糖组(HG,25 mmol/L D-葡萄糖),高葡萄糖+PKCα抑制剂组(HS,25 mmol/L D-葡萄糖+40μmol/L Safingol)。以激光共聚焦显微镜观察PKCα蛋白表达及转位,RT-PCR法检测oncofetal FN mRNA表达水平。结果:(1)与NG组对比,高葡萄糖可促进蛋白激酶Cα蛋白发生核转位,定量分析示HG组胞浆/胞核强度较NG组降低20%(P<0.05),高葡萄糖刺激诱导HMC oncofetal FN mRNA上调,为NG组的2.36倍(P<0.05)。(2)与HG组比较,HS组PKCα蛋白转位激活被抑制,胞浆/胞核荧光强度比值为HG组的1.15倍,HS组oncofetal FN mRNA表达较HG组降低45%(P值均<0.05)。结论:PKCα的激活参与高葡萄糖致人系膜细胞oncofetal FN的表达。     

蛋白激酶C同工酶在初发糖尿病大鼠肾小球中的细胞定位及表达

目的：探讨蛋白激酶C(PKC)同工酶α，βⅠ，βⅡ，ε在正常及初发糖尿病(DM)大鼠肾小球中的细胞定位及表达变化与糖尿病肾病(DN)发生、发展的关系。方法：腹腔注射链脲菌素(STZ)制成DM大鼠模型，采用免疫组化S-P方法检测PKC同工酶的表达。结果：PKCα在正常大鼠肾小球系膜细胞、上皮细胞、内皮细胞中均有表达；PKCβⅠ，βⅡ在系膜细胞中表达；PKCε在系膜细胞及内皮细胞中表达。初发DM状态下，PKCα在系膜细胞和内皮细胞中表达上升；PKCβⅠ，βⅡ在系膜细胞中表达明显下降；PKCε在系膜细胞及内皮L细胞中表达升高不显著。结论：PKC各同工酶在正常大鼠肾小球内的细胞定位不同。高血糖对PKC各同工酶在肾小球内的细胞表达有着不同的的调控效应。PKC各同工本科在初发DM大鼠肾脏病变中发挥不同作用。     

高糖对血管紧张素Ⅱ促系膜细胞增殖作用的影响及其机制

目的　为了探讨高糖对血管紧张素Ⅱ促系膜细胞增殖作用的影响及其机制。方法　采用体外人肾小球系膜细胞培养 ,系膜细胞增殖能力采用MTT法 ,蛋白激酶C(PKC)α、β2 、ε表达应用免疫细胞化学检测。结果　高糖对AngⅡ促系膜细胞增殖有正相调节作用 ,高糖和AngⅡ可刺激系膜细胞PKCβ2 表达增强 ,PKC抑制剂可阻断高糖和AngⅡ的促增殖作用。结论　高糖和AngⅡ促系膜细胞增殖作用是通过PKC依赖途径介导的 ,应用PKC抑制剂可能是防治糖尿病肾病发生发展的手段之一。     

辛伐他汀与阿托伐他汀对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞p27蛋白表达的影响

目的探讨辛伐他汀和阿托伐他汀对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞p27表达的影响。方法将体外培养大鼠肾小球系膜细胞分为正常对照组(葡萄糖浓度5.6mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度30mmol/L)、高糖辛伐他汀组(葡萄糖浓度30mmol/L,辛伐他汀浓度10μmol/L)、高糖阿托伐他汀组(葡萄糖浓度30mmol/L,阿托伐他汀浓度10μmol/L)。每组设置6个复孔,于24、48、72、120h收集细胞,Western blotting法测定大鼠肾小球系膜细胞p27蛋白的表达,逆转录PCR测定p27mRNA的表达。结果高糖组p27蛋白浓度及mRNA水平均较正常对照组升高(P<0.05);高糖辛伐他汀组及高糖阿托伐他汀组p27蛋白浓度及mRNA水平均较高糖组降低(P<0.05)。结论他汀类药物通过调节肾小球系膜细胞p27的表达,可发挥非依赖降脂的肾脏保护作用。     

阿魏酸哌嗪对TGF-β_1诱导下肾小球系膜细胞结缔组织生长因子表达及细胞外基质合成的影响

目的 探讨阿魏酸哌嗪(PF)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导下肾小球系膜细胞结缔组织生长因子(CTGF)及细胞外基质成分表达的影响及其意义.方法 将体外培养正常大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)分为正常对照组、TGF-β1刺激组、TGF-β1加50、100、200 ng/mL PF干预组.分别利用免疫细胞化学法检测各组细胞CTGF蛋白表达,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定细胞CTGF mRNA表达量,双抗体夹心ABC-ELISA法检测细胞上清Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)、纤维连接蛋白(FN)的含量.结果 CTGF蛋白及mRNA、细胞上清Col Ⅰ、FN表达量在TGF-β1组较正常组明显升高(P<0.05),阿魏酸哌嗪组上述指标均低于TGF-β1组(P<0.05).结论 阿魏酸哌嗪能抑制TGF-β1诱导下肾小球细胞外基质(ECM)的合成.其机制可能与下调系膜细胞上CTGF的表达量及功能活性有关.     

SphK1信号通路对高糖诱导的系膜细胞FN表达的影响

目的研究阻断鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SphK1)通路对高糖诱导的大鼠系膜细胞(glomerular mesangial cells,GMC)中纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达的抑制作用。方法采用RealtimePCR检测SphK mRNA水平;Western blot检测FN的蛋白表达。结果 SphK1抑制剂二甲基鞘氨醇(N,N-Dimethylsphingosine,DMS)显著降低高糖诱导的FN表达;转染SphK1 siRNA可有效消除高糖诱导的FN上调效应。结论 SphK1通路在高糖诱导的肾小球系膜细胞FN表达过程中发挥着重要的调节作用。     

高糖诱导的肾小球系膜细胞Smad4蛋白的SUMO修饰作用

目的 观察高糖刺激下大鼠肾小球系膜细胞小泛素相关修饰物 （SUMO）2/3和Smad4蛋白的表达及二者之间的相互作用,探讨SUMO化修饰在糖尿病肾病转化生长因子-β （TGF-β）信号通路中的作用与机制。 方法 将体外培养的大鼠肾小球系膜细胞分别设正常对照组 (5.6 mmol/L葡萄糖),高糖组 （10、20、30 mmol/L葡萄糖）,渗透压对照组 (5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇）。用Western blot检测各组细胞SUMO2/3和Smad4蛋白表达;RT-PCR检测SUMO2/3和纤维连接蛋白 （fibronectin,FN） mRNA表达;免疫共沉淀方法检测SUMO2/3与Smad4蛋白间的相互作用;免疫荧光双染技术检测SUMO2/3与Smad4在细胞中的共定位关系。 结果 与正常对照组比较,各高糖组SUMO2/3、Smad4蛋白及SUMO2/3、FN mRNA表达均增加 （P<0.05）;免疫共沉淀结果显示SUMO2/3与Smad4在各组均存在相互作用,并在高糖刺激下显著增强 （P<0.05）;免疫荧光双染结果表明SUMO2/3与Smad4在肾小球系膜细胞内存在共定位现象,且在高糖组更明显。 结论 SUMO2/3可能通过共价修饰Smad4参与糖尿病肾病时TGF-β信号通路的调控。