14-3-3ε和Cdc25B在小鼠卵母细胞生发泡期阻滞中的作用

目的: 研究14-3-3ε和Cdc25B对小鼠卵母细胞生发泡(GV)期阻滞作用的影响,为阐明蛋白激酶A/Cdc25B/14-3-3ε通路在小鼠卵母细胞GV期阻滞中发育调控机制奠定基础。方法: 在体外将表达载体pcDNA3.1-ZEO-HA-14-3-3ε、pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-WT、pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321A和pcDNA3.1-MYC-Cdc25B-S321D转录成mRNA。超排卵方法获得小鼠GV期卵母细胞,实验分为未注射组、TE缓冲液注射组、14-3-3εmRNA单独注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-WT(野生型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321D(模拟磷酸化型) mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321A(突变型)mRNA共注射组,收集各组母卵细胞后采用Western blotting法检测外源性14-3-3ε和Cdc25B蛋白表达及Cdc2-Tyr15的磷酸化状态;相差显微镜观察卵母细胞的形态学变化并计数生发泡破裂(GVBD)率。结果: 未注射组、TE缓冲液注射组、14-3-3εmRNA单独注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-WT(野生型)mRNA共注射组、14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321D(模拟磷酸化型) mRNA共注射组在显微注射后20h均未发生GVBD(P>0.05); 14-3-3εmRNA+Cdc25B-S321A(突变型)mRNA共注射组在显微注射后1、2和3h卵母细胞的GVBD率分别为(5.00±0.68)%、(62.00±3.56)%和(100.00±0.00)%,显微注射后20h到达第2次减数分裂中期(MII)的比例为(79.00±2.80)%,与未注射组和TE缓冲液注射组比较,GVBD率和到达MII的比例均显著升高(P<0.01)。结论: 14-3-3ε通过Cdc25B的321位丝氨酸磷酸化和脱磷酸化调控卵母细胞由GV期向GVBD的过渡。     

14-3-3蛋白调节1-细胞期小鼠受精卵有丝分裂

 [摘要]目的：研究14-3-3蛋白在1-细胞期小鼠受精卵有丝分裂中的作用。方法：RT-PCR技术鉴定小鼠受精卵14-3-3蛋白亚型。采用显微注射方法将14-3-3siRNA注射入小鼠受精卵G1期,观察受精卵的卵裂率、形态学变化及MPF活性。结果：小鼠受精卵中的14-3-3蛋白亚型是14-3-3ε。小鼠受精卵注射pSUPER-14-3-3εsiRNA后,与对照组相比,卵裂率下降,有丝分裂延迟,有更多的受精卵发生形态异常,MPF活性最高值显著下降。结论：14-3-3蛋白在调节小鼠受精卵有丝分裂中发挥重要作用。     

点突变Uchl1不影响小鼠卵母细胞成熟

目的 通过观察突变蛋白与野生蛋白过量对卵母细胞成熟过程的影响,分析Uchl1在小鼠卵母细胞离体成熟中发挥的作用及其作用方式。方法 通过原核重组蛋白技术制备点突变（C90S和I93M）和野生型Uchl1蛋白,通过蛋白微量注射技术将突变蛋白与对照蛋白注射到未成熟卵母细胞,或体外培养液中添加突变蛋白与野生型蛋白,分析野生型Uchl1过量,或突变Uchl1-I93M蛋白添加,或泛素水解酶活性缺失的Uchl1-C90S突变蛋白添加,对于卵母细胞体外成熟的影响。结果 显微注射UCHL1融合蛋白的各组之间以及与注射PBS之间, GVBD率差异没有达到统计学显著性;同时培养液中添加Uchl1的GST融合蛋白,相对于无注射对照组,也没有统计学显著差异（P>0.05）。注射GST-C90S融合蛋白组少量GV期卵母细胞体外发育为MII期卵母细胞后呈现极体偏大于对照组。I93M点突变小鼠与WT小鼠比较,GV期卵母细胞体外GVBD率无显著差异。结论 在小鼠卵母细胞中,添加外源性Uchl1,或者有毒性作用的I93M突变体,或者水解酶活性结构改变的C90S突变体,均不影响卵母细胞成熟的GVBD进程。即使构建的I93M点突变小鼠卵母细胞GVBD率无异常。但是,其水解酶活性位点突变影响极体的形成。     

AKAP7γ在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的表达

 目的 研究小鼠卵母细胞减数分裂过程中AKAP7γ的表达情况。 方法 收集生发泡（GV）期及第2次减数分裂中期（MII期）小鼠卵母细胞,Western blot方法检测AKAP7γ 蛋白的表达及修饰情况。 结果 在小鼠卵母细胞减数分裂过程中,AKAP7γ在GV及MII期均有表达,且在MII期卵母细胞中,AKAP7γ电泳迁移率变慢,应用冈田酸及碱性磷酸酶（ALP）分别处理GV 及MII 期卵母细胞,AKAP7γ电泳迁移率差异消失。结论 随减数分裂进程,在MII期小鼠卵母细胞中,AKAP7γ发生磷酸化修饰,提示AKAP7γ不仅作为A型激酶锚定蛋白发挥支架蛋白的作用,其本身也可作为其他激酶的底物和效应分子。     

14-3-3σ和Cyclin B1蛋白在浸润性乳腺癌中的表达及意义

目的 探讨浸润性乳腺癌组织中14-3-3σ和Cyclin B1的表达并分析其阳性表达与预后的关系。方法 应用免疫组化PV-9000两步法检测80例浸润性乳腺癌 ,40例乳腺导管原位癌和25例乳腺增生症术后石蜡标本中14-3-3σ和Cyclin B1蛋白的表达情况。结果 80例浸润性乳腺癌组织中14-3-3σ的阳性表达率为22.5%（18/80）,明显低于乳腺导管原位癌65%（26/40）和乳腺增生症92%（23/25）（P<0.05）; 14-3-3σ的表达在组织学分级、TNM分期、腋窝淋巴结转移、术后复发、HER-2受体及ER受体等分组间差异均有显著性意义（P<0.05）,与其它临床特征之间差异均无统计学意义（P>0.05）; Cyclin B1蛋白在浸润性乳腺癌、乳腺导管原位癌、乳腺增生症组织中的表达阳性率分别为67.5%（54/80）、52.5%（21/40）和36%（9/30）,其中浸润性乳腺癌明显高于乳腺增生症（P<0.05）;Cyclin B1的表达在腋窝淋巴结转移、术后复发及ER受体等分组间差异均有显著性意义（P<0.05）,而在与其它临床特征之间差异均无统计学意义（P>0.05）;14-3-3σ和Cyclin B1蛋白的表达呈负相关（r=-0.521,P=0.000）。14-3-3σ蛋白阳性表达组患者的总生存期OS明显高于阴性表达组患者的总生存期OS,Cyclin B1蛋白的表达与之相反（P<0.05）。结论 14-3-3σ和cyclin B1蛋白与浸润性乳腺癌的发生发展可能相关,二者联合检测可能对判断患者的预后有一定作用。     

CDC25B和14-3-3δ蛋白在膀胱癌中的表达及意义

目的探讨CDC25B和14-3-3δ蛋白在膀胱癌中的表达与病理分级、临床分期的关系,为临床上判断膀胱癌的恶性程度和膀胱癌的新的治疗方法提供理论依据。方法采用免疫印迹（Western Blot）法检测64例膀胱癌、9例癌旁正常膀胱粘膜中CDC25B和14-3-3δ蛋白的表达。1）观察CDC25B和14-3-3δ蛋白在膀胱癌和癌旁正常膀胱粘膜中的表达情况;2）分析CDC25B和14-3-3δ蛋白在膀胱癌中的表达与病理分级和临床分期的关系。结果所测组织中均有CDC25B的表达,膀胱癌中呈高表达;并且在膀胱癌各病理分级、临床分期间的表达亦有差异。CDC25B随着肿瘤的分化程度降低而表达逐渐增加,CDC25B在浸润性膀胱癌中表达高于非浸润性膀胱癌。14-3-3δ蛋白在癌旁正常膀胱粘膜中大量表达,在膀胱癌中均呈低表达,但未见其与肿瘤病理分级有明显相关性。结论 CDC25B在膀胱癌组织中表达明显高于癌旁正常膀胱粘膜,且CDC25B的高表达与膀胱癌的分化程度和浸润性密切相关;14-3-3δ蛋白在癌旁膀胱粘膜大量表达,而在膀胱癌组织中均呈低表达,但与肿瘤分化程度无相关性。CDC25B及14-3-3δ蛋白可能成为膀胱癌潜在的诊断标记和治疗靶点。     

丁内酯-Ⅰ对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的研究丁内酯-Ⅰ（BL-Ⅰ）对小鼠卵母细胞体外成熟及成熟动力学的影响。方法以BL-Ⅰ作为成熟抑制剂，按“两步法”培养小鼠卵丘-卵母细胞复合物（COC），即先用含有不同浓度BL-Ⅰ（0、6．25、12．5、25、50、100μmol／L）的培养液培养，按培养时间分为3h组和6h组。BL-Ⅰ培养液培养结束时，观察卵母细胞生发泡破裂（GVBD）的发生率，再用不含BL-Ⅰ的培养液继续培养，进一步观察其成熟动力学的变化，即卵母细胞GVBD过程和第一极体形成过程。结果6．25μmol／L及以上浓度的BL-Ⅰ培养液均可将未成熟卵的GVBD抑制3h，抑制6h则需100μmol／L BL-Ⅰ，BL-Ⅰ抑制作用解除后，卵母细胞的成熟率与对照组的差异无显著性意义（P〉0．05），但卵母细胞的成熟动力学发生明显改变，GVBD和成熟过程较对照组明显加速。结论BL-Ⅰ对小鼠未成熟卵GVBD 3h或6h的抑制是可逆的，不影响小鼠卵母细胞的成熟能力，但成熟动力学发生明显改变。而这可能改善体外成熟的卵母细胞胞质成熟滞后于核成熟的状态，提高未成熟卵的发育能力。     

CDC14B在小鼠1-细胞期受精卵各细胞周期的动态表达及其定位

目的：检测小鼠1-细胞期受精卵各细胞周期中细胞分裂周期蛋白14B（CDC14B）的表达水平及其定位,初步阐明CDC14B对哺乳动物受精卵早期发育调控的机制。方法：通过超排卵技术分别收集小鼠1-细胞期受精卵,采用RT-PCR和Western blotting法检测小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中CDC14B mRNA和蛋白表达水平;采用细胞免疫荧光法观察小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中CDC14B和β微管蛋白（β-tubulin）的共定位情况。结果：与G₁期比较,小鼠S、G₂和M期1-细胞期受精卵中CDC14B mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）。间接免疫荧光实验,CDC14B（红色荧光）和β-tubulin（绿色荧光）在G₁期和S期共定位于小鼠受精卵皮质;在G₂早期,CDC14B和β-tubulin共定位于皮质和细胞质;在G₂晚期,部分CDC14B入核;在M期,CDC14B和β-tubulin共定位于纺锤体。结论：CDC14B在小鼠不同细胞周期1-细胞期受精卵中动态表达,CDC14B存在核浆纺锤体转位,CDC14B的定位变化可能调控纺锤体的功能。     

敲除Sirt3后激活自噬对阿尔茨海默病有保护作用

目的: 探究Sirt3在阿尔茨海默病（AD）发生发展中的作用及可能机制。方法: 体内实验以C57BL/6野生型小鼠和Sirt3基因敲除小鼠为对象,采用腹腔注射D-半乳糖联合脑定位注射β-淀粉样蛋白（Aβ）_1-40建立AD小鼠模型。莫里斯（Morris）水迷宫实验、自发活动开场实验和悬尾实验观察造模前后小鼠学习记忆和焦虑抑郁状态的改变,免疫荧光染色观察脑内海马区域Aβ沉积情况,蛋白质印迹法检测小鼠脑组织中自噬和凋亡相关蛋白表达。体外实验选小鼠皮层原代细胞作为对象,给予Aβ_1-40建立AD体外模型,MTT法检测细胞活性。结果: 体内实验结果显示,野生型小鼠诱发AD后平台潜伏期延长（P < 0.05）,穿越平台次数减少、目标象限停留时间缩短（均P < 0.05）,提示造模后小鼠的学习记忆能力下降;而Sirt3敲除能够缓解AD所致的学习记忆障碍（均P < 0.05）。相较于野生型小鼠,Sirt3基因敲除小鼠脑内海马区域的Aβ沉积减少（P < 0.05）,凋亡蛋白cleaved caspase 3表达减少（P < 0.05）。另外,野生型小鼠诱发AD后LC3-Ⅱ和P62蛋白表达增加（均P < 0.05）,提示自噬流受阻;而Sirt3基因敲除小鼠诱发AD后LC3-Ⅱ蛋白表达增加,P62蛋白表达减少（均P < 0.05）,提示自噬被激活。小鼠皮层原代细胞AD模型中,Sirt3基因敲除的细胞较野生型细胞死亡减少（P < 0.05）;加用自噬抑制剂氯喹后,Sirt3基因敲除的保护作用消失（P < 0.05）。结论: Sirt3敲除对于D-半乳糖联合Aβ_1-40诱发的AD有保护作用,这种保护作用可能与自噬流活化有关。     

北五味子酸性多糖对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力的改善作用

目的：观察北五味子酸性多糖（SCP-A）对Aβ_25-35致阿尔茨海默病（AD）模型小鼠学习记忆能力的改善作用,并阐明其相关机制。方法：75只雄性C57BL小鼠随机分为空白组（侧脑室注射生理盐水,灌胃蒸馏水）,模型组（侧脑室注射Aβ_25-35,灌胃蒸馏水）,5、10和20 mg·kg^-1 SCP-A组（侧脑室注射Aβ_25-35,灌胃SCP-A）,每组15只。灌胃药物每日1次,连续14 d,于第8天给予Aβ_25-35进行侧脑室注射。给药完毕后,第15天依次进行避暗实验及Morris水迷宫实验观察小鼠的潜伏期、错误次数、找到平台时间、穿越平台次数和目标象限停留时间,Western blotting法检测小鼠海马组织中Tau蛋白、糖原合成酶激酶3（GSK-3β）及其磷酸化蛋白的表达水平。结果：避暗实验,与空白组比较,模型组小鼠潜伏期明显缩短,错误次数明显升高（P<0.01）;与模型组比较,10和20 mg·kg^-1 SCP-A组小鼠潜伏期明显延长（P<0.01）,错误次数明显减少（P<0.05或P<0.01）。Morris水迷宫,与空白组比较,模型组小鼠找到平台时间明显延长（P<0.01）,穿越平台次数及目标象限停留时间明显缩短（P<0.01）;与模型组比较,10和20 mg·kg^-1 SCP-A组小鼠找到平台时间明显缩短（P<0.01）,穿过平台次数及平台区域停留时间明显增加（P<0.01）。Western blotting法检测,与模型组比较,20 mg·kg^-1SCP-A组小鼠海马组织中磷酸化蛋白Tau Ser199、Tau Ser396及Tau Ser404表达水平明显降低（P<0.05）,GSK-3β表达水平明显降低（P<0.01）,磷酸化蛋白GSK-3β Tyr216相对表达水平明显降低（P<0.05）,磷酸化蛋白GSK-3β Ser9相对表达水平明显升高（P<0.05）。结论：SCP-A具有抗AD作用,该作用与其调节GSK-3β活性进而降低海马组织中Tau蛋白磷酸化水平有关。     

滋养细胞分泌14-3-3 τ蛋白对子宫内膜基质细胞表达整合素αvβ3蛋白的影响

 目的 探讨滋养细胞分泌14-3-3 τ蛋白对子宫内膜基质细胞容受性分子整合素 α_vβ₃表达的影响。方法 RNA干扰技术下调人绒癌滋养细胞株BeWo细胞14-3-3 τ蛋白的表达。Western blot法检测BeWo细胞及培养液中14-3-3 τ蛋白的表达。建立14-3-3 τ蛋白表达下调的BeWo细胞与人子宫内膜基质细胞（endometrial stromal cells,ESC）的共培养体系,Western blot法检测共培养体系培养液中14-3-3 τ蛋白的表达,以及ESC容受性分子整合素α_vβ₃的表达变化。结果 与siRNA阴性对照组相比,特异性siRNA显著下调BeWo细胞和培养液中14-3-3 τ蛋白的表达（P<0.05）。共培养体系中,与siRNA阴性对照组相比,与14-3-3 τ蛋白表达下调的BeWo细胞共培养的ESC整合素α_vβ₃的表达显著上调（P<0.05）,提示ESC容受性增加。与单独培养的ESC相比,培养液中添加14-3-3 τ重组蛋白的ESC培养24 h后整合素α_vβ₃的表达显著下调（P<0.05）,提示ESC容受性降低。 结论 14-3-3 τ蛋白可以被滋养细胞分泌至细胞外,并可能发挥调控ESC容受性的作用,但其作用机制仍需进一步研究。     

1,25 二羟基维生素 D3联合5-氟尿嘧啶对人食管癌Eca-109细胞移植瘤的影响

探讨1,25二羟基维生素D3、5-氟尿嘧啶单独或联合作用对人食管癌Eca-109细胞裸鼠移植瘤胰岛素生长因子结合蛋白-3（IGFBP-3）的影响。 方法 体外培养人食管癌Eca-109细胞，BALB/c裸小鼠皮下接种荷瘤后随机分为对照组（A）、1,25二羟基维生素D3组（B）、5-氟尿嘧啶组（C）、联合用药组（D），2.5 μg/kg 1,25二羟基维生素D3、25 mg/kg 5-氟尿嘧啶单独或联合腹腔注射，对照组用等体积生理盐水腹腔注射，观察瘤体生长情况，运用免疫组织化学方法检测移植瘤组织中IGFBP-3蛋白表达，全自动生化分析仪检测血清钙离子水平、Von kossa染色观察肾脏钙沉积情况。 结果 与A组比较，B、C、D组移植瘤生长缓慢，体积较小，IGFBP-3阳性蛋白染色较深，且表达量较多（P<0.05）；而D组较B、C组移植瘤IGFBP-3蛋白表达显著升高（P<0.05）。B、C、D组血清钙离子水平较A组稍有升高，但肾脏组织切片Von kossa染色未见钙沉积。结论 1,25二羟基维生素D3、5-氟尿嘧啶均能抑制移植瘤生长，且联合用药效果更为显著，可能与上调移植瘤组织IGFBP-3蛋白表达有关。肾脏Von kossa染色未见钙沉积。     

14-3-3γ在子宫肌瘤中的表达及其临床意义

目的研究不同月经周期子宫肌瘤中14-3-3γ蛋白的表达情况及其与雌、孕激素受体、子宫肌瘤临床病理参数之间的关系。方法收集行子宫全切或次切的子宫肌瘤患者65例,取子宫肌瘤和正常子宫肌层组织,标本均经病理确诊并根据子宫内膜确定月经周期。免疫组织化学方法观察14-3-3γ的定位情况。Westernblot方法检测组织中14-3-3γ、ERα、ERβ、PR蛋白的表达情况,分析14-3-3γ与月经周期、患者年龄、子宫肌瘤大小、肌瘤位置、肌瘤类型及与ERα、ERβ、PR等表达的相关性。结果（1）子宫肌瘤中14-3-3γ表达水平在不同月经周期及不同患者年龄、肌瘤大小、肌瘤类型和肌瘤位置中均无统计学差异（均P＞0.05）。（2）子宫肌瘤中14-3-3γ表达水平明显低于正常子宫肌层（P＜0.05）,尤其是增殖期和分泌期。年龄＜48岁组、子宫肌瘤大小4～8cm组、多发性子宫肌瘤组和肌壁间子宫肌瘤组中,子宫肌瘤中14-3-3γ表达水平均低于正常子宫肌层组织（均P＜0.05）。（3）子宫肌瘤中ERα、ERβ、PR蛋白表达水平较正常子宫肌层增高（均P＜0.05）,且子宫肌瘤中14-3-3γ表达水平与ERα呈负相关性（r=-0.305,P＜0.05）,而与ERβ、PR的表达无相关性（r=-0.157、-0.036,均P＞0.05）。结论14-3-3γ在子宫肌瘤中的表达不受月经周期、患者年龄及子宫肌瘤大小、类型或位置而改变。14-3-3γ在子宫肌瘤中的表达低于正常子宫肌层组织,其在生育年龄妇女和4～8cm大小子宫肌瘤、多发肌瘤和肌壁间肌瘤中的作用更为重要,该作用与雌激素受体α相关。     

下调PALM3表达抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎性反应

目的 探讨抑制paralemmin-3（PALM3）表达对脂多糖（LPS）诱导的大鼠肺泡巨噬细胞系（NR8383）炎性反应的影响。方法 将NR8383细胞并接种至6孔板中,待融合度达70%,加入0.5μg/ml LPS刺激12h,用免疫荧光检测细胞PALM3表达及亚定位;用0.5μg/ml LPS刺激NR8383细胞并在0、3、6、12、24和48h收集细胞提取总RNA,用RT-PCR法检测PALM3 mRNA;同前接种细胞至24孔板,待融合度达70%,将PALM3小干扰核糖核苷酸（siRNA）转染NR8383细胞（PALM3 siRNA转染组）,同时设立正常NR8383细胞组和对照转染组（转染control siRNA）,转染48h后,提细胞总蛋白用Western blot法检测PALM3蛋白水平;3组细胞给予LPS刺激12h,收集培养上清和核蛋白,用ELISA法检测培养上清中IL-8、IL-6的水平及核转录因子（NF-κB）转录活性。结果 PALM3分子在NR8383细胞中有表达,LPS可诱导PALM3表达;PALM3 siRNA转染后成功下调PALM3蛋白表达,予LPS刺激后,与正常细胞及对照转染组比较,PALM3 siRNA转染组培养上清中白介素-8（IL-8）和IL-6含量减少,PALM3 siRNA转染组细胞中NF-κB转录活性亦被抑制。结论 NR8383细胞中有PALM3表达,LPS可诱导NR8383细胞中PALM3的蛋白表达,下调PALM3表达可抑制LPS诱导的炎性反应。     

泛素羧基末端水解酶L1 C90S和I93M点突变不影响小鼠卵母细胞成熟

目的 通过观察泛素羧基末端水解酶L1(UCHL1)点突变蛋白与野生型蛋白过量对小鼠卵母细胞成熟的影响,并分析其在小鼠卵母细胞离体成熟过程中的作用及作用方式.方法 通过原核重组蛋白技术制备UCHL1点突变(C90S和I93M)和野生型蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,通过显微注射技术将UCHL1野生型蛋白与GST的融合蛋白、UCHL1点突变蛋白与GST的融合蛋白、GST、PBS分别注射到小鼠未成熟卵母细胞,或在体外培养基中添加UCHL1野生型蛋白与GST的融合蛋白,分析野生型UCHL1过量、UCHL1(I93M)点突变蛋白添加及泛素水解酶活性缺失的UCHL1(C90S)点突变蛋白添加对卵母细胞生发泡破裂(GVBD)率的影响.分离UCHL1(I93M)点突变小鼠与野生型小鼠的生发泡期卵母细胞,体外培养3 h后比较其GVBD率.结果 显微注射UCHL1野生型蛋白及其点突变体与GST的融合蛋白的各组之间、注射GST组、注射PBS组卵母细胞GVBD率差异均无统计学意义,在培养基中添加UCHL1蛋白与GST的融合蛋白组卵母细胞GVBD率与无注射无添加对照组相比差异也无统计学意义(P均>0.05).注射UCHL1(C90S)与GST的融合蛋白组有少量生发泡期卵母细胞体外发育为MⅡ期卵母细胞后呈现极体较对照组偏大的现象.UCHL1(I93M)点突变小鼠生发泡期卵母细胞体外GVBD率与野生型小鼠比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 在小鼠卵母细胞中添加外源性UCHL1、有致病作用的UCHL1(I93M)突变体或泛素水解酶活性丧失的UCHL1(C90S)突变体均不影响卵母细胞成熟的GVBD进程,UCHL1(I93M)点突变小鼠卵母细胞GVBD率亦无异常,但UCHL1(C90S)点突变可能影响极体的形成.     

沉默信息调节因子3对白藜芦醇诱导的人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响

目的：检测沉默信息调节因子3（Sirt3）对白藜芦醇（Res）诱导的人卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响,探讨其促进凋亡的机制。方法：人卵巢癌SKOV3细胞加入不同浓度（0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0和80.0 mg·L^-1）Res培养24h,MTT法检测细胞存活率。将细胞随机分为对照组、Sirt3抑制剂3-（1H-1,2,3-三唑-4-基）吡啶（3-TYP）组、Res组和3-TYP+Res组,培养24h后,MTT法检各组细胞增殖抑制率;采用Hoechst 33342进行细胞核染色,激光共聚焦显微镜观察细胞核形态;采用活性氧（ROS）探针检测细胞中ROS水平;Western blotting法检测各组细胞中Sirt3、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleavedcaspase-3）蛋白表达水平。结果：MTT实验,随着Res浓度的增加,细胞存活率明显降低,Res的半数抑制浓度（IC₅₀）为42.73 mg·L^-1。与对照组比较,Res组和3-TYP+Res组细胞增殖抑制率明显升高（P<0.05）;与Res组比较,3-TYP+Res组细胞增殖抑制率明显升高（P<0.05）。与对照组比较,3-TYP+Res组细胞核出现固缩、染色增强、核碎裂增多。与对照组比较,3-TYP组细胞红色荧光无明显变化,Res组和3-TYP+Res组细胞红色荧光明显减少。Western blotting法检测,与对照组比较,3-TYP组细胞中Sirt3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）,Res组细胞中Sirt3和Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.05）;与Res组比较,3-TYP+Res组细胞中Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,Bcl-2和Sirt3蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论：Res可以诱导SKOV3细胞的凋亡,3-TYP通过抑制Sirt3表达可增强Res的作用。     

阿米福汀对小鼠放射性肺损伤的防护作用研究

目的 探讨阿米福汀（Amifostine,AMI）对小鼠放射性肺损伤（RILI）的防护作用机制。方法 将24 只雌性C57BL/6J 小鼠随机分为对照组、单纯照射组、AMI 组。用直线加速器6MV-X 射线单次12Gy 照射小鼠全肺,照射前30 min 腹腔注射AMI,对照组和单纯照射组注射同等剂量的生理盐水。照射14 d 后,留取小鼠肺组织标本,采用苏木精- 伊红染色法（HE）观察病理改变;酶联免疫吸附法（ELISA）检测支气管肺泡灌洗液中白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β1（TGF-β1）表达水平;凝胶电泳迁移实验检测核转录因子-κB（NF-κB）活性;免疫组织化学法观察NLRP3 蛋白的表达和定位;实时荧光定量聚合酶链反应检测肺组织中NLRP 3 和IL-1β mRNA 的表达;Western blot 检测NF-κB p65、NLRP3、IL-1β 蛋白的表达。结果 照射后第14 天,AMI 组与单纯照射组比较,AMI 组肺组织急性炎症反应减轻;AMI 组支气管肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α 水平下降,TGF-β1 水平升高（P <0.05）;AMI 组肺组织中NF-κB 活性下降（P <0.05）;AMI 组肺组织中NLRP3 蛋白表达下降（P <0.05）;AMI 组NLRP3 和IL-1β mRNA 表达下降（P <0.05）;AMI 组NF-κB p65、NLRP3、IL-1β 蛋白表达下降（P <0.05）。结论 AMI 可能通过抑制辐射引起的NF-κB 激活,进而抑制NLRP 3 基因的转录和表达,抑制炎症因子的释放,减轻RILI。     

14-3-3ζ蛋白在胃癌中的表达及意义

目的探讨14-3-3ζ蛋白在胃癌和正常胃黏膜组织中的表达及其临床意义。方法选取100例手术切除的胃癌组织标本及其中76例癌旁正常胃黏膜组织标本制备组织芯片,应用免疫组织化学方法检测组织芯片中14-3-3ζ蛋白的表达。分析胃癌患者的临床病理学特征与14-3-3ζ蛋白表达的相关性。结果 100例胃癌组织中79例（79.00%）表达14-3-3ζ蛋白;而正常胃黏膜中仅散在个别细胞弱表达。按组织学分类法,在乳头状腺癌和管状腺癌中14-3-3ζ蛋白阳性表达率分别为100%和86.75%,显著高于黏液腺癌和印戒细胞癌（42.86%、0）（P〈0.05）。按Lauren分类法,肠型胃癌中14-3-3ζ蛋白阳性表达率显著高于弥漫型胃癌（90.91%vs73.13%）（P〈0.05）。在不同浸润深度的胃癌中,肌层和浆膜层的14-3-3ζ蛋白阳性表达率分别为78.57%和81.93%,均显著高于黏膜层和黏膜下层（0、0）（P〈0.05）。进展期胃癌的14-3-3ζ蛋白阳性表达率为81.44%,而3例早期胃癌均不表达（P〈0.05）。结论胃癌组织中14-3-3ζ蛋白表达与其组织学类型和浸润状况密切相关。提示14-3-3ζ蛋白有可能成为评估胃癌的预后指标和潜在的生物治疗靶点。     

A型激酶锚定蛋白在小鼠卵母细胞减数分裂阻滞中的作用

  目的 探讨A型激酶锚定蛋白（AKAPs）在小鼠卵母细胞减数分裂阻滞中的作用。方法 收集生发泡期小鼠卵母细胞,显微注射Ht31或Ht31-P,观察卵母细胞减数分裂恢复情况。结果 在蛋白激酶A持续激活的情况下,Ht31注射组能促进小鼠卵母细胞减数分裂重新启动,解除蛋白激酶A引起的生发泡期阻滞,而Ht31-P对照组不能。结论 AKAPs介导的蛋白激酶A正确锚定对小鼠卵母细胞第一次减数分裂阻滞至关重要。