P63标记角膜缘干细胞的可行性研究

目的探讨p63蛋白（P63）作为角膜缘干细胞阳性标记物的可行性和意义，为研究和鉴定角膜缘干细胞存活、增殖和分化情况提供依据。方法取正常新西兰兔角膜全层标本5份（包括角膜缘和结膜），同时取角膜缘干细胞移植后3个月上皮生长良好的角膜全层标本和角膜失代偿标本各5份。免疫组织化学SP三步法检测P63在不同组标本供体干细胞的表达情况。结果P63在角膜缘干细胞核内呈高表达，而短暂扩充细胞虽然也具备一定的增殖和分化能力，但是P63表达较少。角膜中央和结膜呈阴性表达。结论P63可以特异性地标记角膜缘干细胞，对角膜缘干细胞的研究和鉴定及其在眼表重建的应用具有一定的价值。     

干细胞标记物在翼状胬肉上皮中的表达及意义

目的：检测翼状胬肉上皮中干细胞标记物p63、ABCG2、CK19的表达水平，并探讨其对揭示翼状胬肉发病机制的意义。方法选取30例（30眼）原发性翼状胬肉患者，应用免疫荧光组织化学染色法检测p63、AB-CG2、CK19、PCNA蛋白在翼状胬肉上皮的表达及分布情况，并以正常结膜上皮作对照。选取翼状胬肉病理组织块和正常结膜上皮进行原代细胞培养，观察细胞的生长特性，并用实时荧光定量PCR方法检测p63和ABCG2表达量并进行比较。结果根据p63、ABCG2、CK19、PCNA的免疫组化结果，翼状胬肉与正常结膜间比较差异有统计学意义（ P＜0.05）。根据细胞培养结果，翼状胬肉呈现高增殖能力，根据PCR检测结果，p63和ABCG2在翼状胬肉与正常结膜间，差异均有统计学意义（ P＜0.05）。结论翼状胬肉上皮高表达干细胞标记物p63、ABCG2、CK19。     

Transplantation of corneal stem cells cultured on amniotic membrane for cornea l burn: experimental and clinical study

目的：探讨离体培养的角膜干细胞增殖分化特性,观察干细胞羊膜移植片治疗角膜缘功能障碍的效果。方法：用克隆形成率（colony-forming efficiency,CFE）、免疫组织化学染色等方法观察培养角膜干细胞的增殖力和分化表达状况。角膜干细胞培养后接种生长于羊膜上进行干细胞羊膜片移植,观察角膜上皮、组织浸润和新生血管情况。结果：原代和传第1代角膜干细胞具有高增殖力,部分表达角质蛋白K3,角膜干细胞在羊膜上能够继续增殖分化为多层细胞结构的角膜上皮细胞层;角膜干细胞移植术后可以在角膜比存活,角膜比移植片紧密贴附,角膜上皮完整,经度基质炎性浸润,浅层新生血管减少,深层新生血管充盈减轻,睑球粘连得到松解。结论：角膜缘干细胞羊膜片移植治疗角膜缘功能障碍能够使患获得进一步进行角膜移植的条件。     

利用皮肤干细胞的横向分化重建角膜上皮的初步研究

目的 观察皮肤干细胞在角膜基质上的分化发育情况,探讨皮肤干细胞重建角膜上皮的可能性。方法 将体外分离培养的1～4代人和兔皮肤干细胞种植在兔角膜基质上,在体外和体内观察皮肤干细胞的分化发育情况。实验标本作HE染色及用人上皮细胞角蛋白K19单克隆抗体和角膜上皮细胞特异性标志蛋白K3／K12抗体AE5进行免疫组织化学鉴定。结果 皮肤干细胞在角膜基质的调控下可以横向分化发育成表达角膜上皮细胞特异性标志蛋白K3／K12的细胞,呈现AE5抗体阳性;并可形成类似角膜上皮外观透明的多层细胞结构。结论 利用皮肤干细胞有可能重建角膜上皮,进行自体生物角膜的构建。     

角膜缘上皮细胞移植重建眼表的实验研究

目的探讨角膜缘上皮细胞构建的角膜上皮植片重建眼表的可行性和有效性。方法采用碱烧伤法建立完全性角膜缘干细胞缺陷的SD大鼠动物模型,以羊膜为载体培养人角膜缘上皮细胞,移植重建角膜缘干细胞缺陷眼表,观察术后眼表状态的改变,RT-PCR和免疫组化检测术后10、20、30、45 d及60 d角膜组织CK3/12和P63的表达。结果体外培养的人角膜缘上皮细胞移植术后,完全性角膜缘干细胞缺陷眼表状态较术前和对照组都有不同程度改善;免疫组化和RT-PCR检测表明体外培养角膜缘上皮细胞移植术后角膜组织60 d内P63和CK3/12表达无明显改变。结论以去上皮羊膜为载体,体外培养人角膜缘上皮细胞构建的角膜上皮植片能够重建完全性角膜缘干细胞缺陷眼表。     

角膜缘上皮移植术的临床应用

角膜缘上皮基底层存在一种低分化并能被创伤激发而发生增殖的干细胞,角膜上皮就是由其增殖分化而来。当某些因素引起角膜缘组织破坏,致使角膜缘上皮内干细胞缺失时,就会影响角膜上皮的生长,从而引起新生血管及异常结膜上皮入侵,导致角膜损害。因此,角膜缘上皮移植是治疗角膜缘功能缺陷所致严重眼表疾病的有效方法。1　简要的历史回顾　　1971年Ｄｅｖａｎｇｅｒ等[1]研究发现角膜上皮细胞的生长来源于角膜缘上皮。以后相继有学者研究证实了这一结果,并发现角膜缘部基底细胞即为干细胞,从而提出了角膜缘干细胞的概念[2,3]。1989年Ｋｅｎｇｏ…     

角膜缘干细胞移植后供体干细胞的检测与分析

目的观察新西兰兔角膜缘干细胞移植后供体干细胞数量的变化与角膜上皮化的关系,为角膜缘干细胞移植手术效果提供理论依据.方法新西兰兔30只,分为自体移植和异体移植两组,建立角膜缘干细胞缺损动物模型,分别进行自体和异体角膜缘干细胞移植.术后1周、1月、3月空气栓塞各处死5只,取包括角膜缘的角膜标本,免疫组织化学p63蛋白抗体检测供体干细胞的存活数量和增殖分化状况,比较两组的移植效果.结果自体移植术后1周,供体干细胞仍然局限于受体角膜缘;1个月后,上皮细胞覆盖角膜全层,但是层次非常少;3个月后,干细胞的储备数量基本上恢复到正常水平,角膜完全上皮化.异体移植1周,干细胞的数量有一定的减少;1个月后,角膜缘干细胞储备数量明显减少;3个月后,角膜缘已经检测不到干细胞.结论干细胞的储备数量和增殖分化状况直接影响到角膜上皮化的结局;有效的干细胞检测结果可以为临床角膜缘干细胞移植效果提供依据,p63蛋白抗体可以作为一个检测角膜缘干细胞的特异指标.     

复式滋养层培养法构建组织工程化小鼠角膜上皮的实验研究

目的 探讨构建组织工程化小鼠角膜上皮的理想方法.方法 在Transwell气液界面培养系统中,利用复式滋养层培养法构建组织工程化小鼠角膜上皮,HE染色进行组织学观察,分别利用RT-PCR、Western blot以及免疫荧光法检测上皮祖细胞标记p63、角蛋白19(K19)以及分化标记被膜素(involucrin)的表达.结果 复式滋养层培养法构建可成功小鼠角膜上皮,上皮层数达5～7层.与RT-PCR和Western blot结果一致,免疫荧光结果显示上皮基底细胞层和基底细胞上层表达p63和K19,角膜上皮全层均表达involucrin.结论 复式滋养层培养法可保持培养细胞的干细胞性质,是构建组织工程化小鼠角膜上皮的理想方法.     

皮肤软组织扩张术对大鼠表皮细胞增殖分化的影响

目的观察皮肤软组织扩张术对大鼠表皮细胞增殖分化的影响。方法36只Wistar大鼠分为干预侧和假手术侧，制作皮肤扩张动物模型，利用表皮干细胞表达角蛋白（keratin 19，K19）、短暂扩充细胞表达K14及增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen。PCNA）的特点，采用免疫组织化学PowerVision^TM二步法检测扩张皮肤表皮干细胞和短暂扩充细胞的分布特征。结果扩张皮肤的表皮层明显增厚，不仅其基底层K19、K14和PCNA阳性细胞的数量明显增多。而且在棘层和颗粒层也可见K19、K14及PCNA阳性细胞的表达。结论皮肤软组织扩张术的应力能诱导大鼠表皮干细胞的增殖与分化，其可能是皮肤软组织扩张术的重要生物学基础。     

PCNA与EGF在人胎儿晶状体上皮表达的研究

目的：观察增殖细胞核抗原（PCNA）及表皮生长因子（EGF）在人胎儿晶关於 本上皮细胞的表达。方法：用SP免疫细胞化学法对48例人胎狼不同胎龄晶状体上皮细胞进行PCNA，EGF免疫细胞化学染色。结果：PCNA，EGF在人胎儿不同胎龄晶状体上皮细胞均有表达；免疫阳性细胞随着胎龄的增加而减少。PCNA阳性细胞核为桔黄色或棕黄色；EGF阳性细胞浆为桔黄色或棕黄色的斑块状；经相关分析；EGF与PCNA呈正相关。结论：PCNA，EGF在人胎儿不同胎龄胎晶状体上皮细胞均有表达。且EGF促进晶状体上皮细胞的增殖。     

体外诱导恒河猴皮肤干细胞分化为结膜上皮细胞的实验研究

目的诱导体外培养、纯化的恒河猴皮肤干细胞向结膜上皮细胞分化,探索皮肤干细胞的可塑性。方法体外培养恒河猴皮肤干细胞,用Ⅳ型胶原纯化,纯化前后用流式细胞仪检测β1整合素和角蛋白15阳性细胞比例,纯化后的皮肤干细胞用细胞免疫荧光和逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）技术鉴定β1整合素和角蛋白15。皮肤干细胞转染绿色荧光蛋白基因,24h后挑选出有荧光的细胞,与人结膜上皮细胞共培养10d,再进行结膜上皮细胞的特异性抗原黏蛋白4和角蛋白4的鉴定,检测方法包括细胞免疫荧光和RT—PCR。结果体外培养的皮肤干细胞纯化后比例接近90％。细胞免疫荧光和RT—PCR检测β1整合素和角蛋白15阳性。转染绿色荧光蛋白基因24h后,细胞呈现绿色荧光,与结膜上皮细胞共培养10d后,细胞免疫荧光和RT—PCR检查黏蛋白4和角蛋白4阳性。结论在体外培养纯化的灵长类动物恒河猴皮肤干细胞,在适宜条件下,可诱导分化为有结膜上皮细胞特征的细胞。     

Transplantation of human limbal cells cultivated on amniotic membrane for reconstruction of rat corneal epithelium after alkaline burn

Background The transplantation of limbal epithelial cells cultivated on amniotic membrane is a newly developed treatment for limbal stem cell deficiency. The purpose of our study was to investigate the biological characteristics of limbal epithelial cells and evaluate the effect of transplantation of cultivated human limbal epithelial cells on ocular surface reconstruction in limbal stem cell deficiency rat model.Methods Human limbal cells were isolated and cultivated in vitro. Cytokertins 3, 12, and 19 (K3, K12 and K19) and p63 were detected by immunofluorescent staining or RT-PCR. BrdU labelling test was used to identify the slow cycling cells in the cultures. Limbal stem cell deficiency was established in rat cornea by alkali burn.Two weeks after injury, the rats received transplants of human limbal stem cells cultivated on amniotic membrane carrier. The therapeutic effect was evaluated by slit lamp observation, Hemotoxin and Eosin (HE) staining and immunofluorescent staining.Results On day 7 in primary culture, p63 and K19 were strongly expressed by most cells but only a few cells expressed K3. On days 14 and 21, p63 and K19 were still expressed by a majority of cells, but the expressive intensity of p63 decreased in a number of cells, while the proportion of K3 positive cells increased slightly and some cells coexpressed p63 and K3. RT-PCR showed that gene expression of both p63 and K12 were positive in cultivated limbal cells, but in mature superficial epithelial cells, only K12 was detected. BrdU labelling test showed that most cells were labelled with BrdU after 7 days‘ labelling and BrdU label retaining cells were observed after chasing for 21 days with BrdU free medium. For in vivo test, slit lamp observation, HE staining and immunofluorescent staining showed that the rats receiving transplant of human limbal stem cells cultivated on amniotic membrane grew reconstructed corneas with intact epithelium, improved transparency and slight or no neovascularization. A majority of epithelial cells of the reconstructed cornea were positive to antihuman nuclear antibody and cells expressing K3 were found mainly in superfacial epithelium.Conclusions Limbal stem cells can be cultivated in vitro: the cells are characterized by high proliferation and slow cycling and identified as p63/K19 positive and K3/K12 negative. During culture, some stem cells can proliferate and differentiate into mature cornea epithelial cells. Amniotic membrane is a suitable carrier for limbal stem cells. Transplantation of human limbal stem cells cultivated on amniotic membrane can functionally reconstruct rat cornea with limbal stem cell deficiency.     

板层角膜移植联合球结膜唇粘膜移植治疗烧伤重症睑球粘连

目的 观察角膜移植治疗烧伤后睑球粘连的效果。方法 应用板层角膜移植联合自体球结膜、唇粘膜移植术治疗28例（29眼）重症睑球粘连,将角结膜假性胬肉分离至穹窿部,保留板层角膜及胬肉上皮层并反转作为睑结膜或移植粘膜作为睑膜,用新鲜板层角膜作供体更替浑浊角膜,用同侧或对侧眼球结膜修补巩膜表面结膜创面。结果 一次手术者25眼,二次手术3眼,三次手术1眼,治愈20眼,明显好转6眼,复发3眼。结论 板层角膜移植联合球结膜、唇粘膜 后重症睑球粘连是一种良好的手术方法。     

Hoechst 33342标记恒河猴皮肤干细胞向结膜上皮细胞分化

 [目的]探讨皮肤干细胞诱导分化为结膜上皮细胞,为组织工程结膜探索一种新型的种子细胞,为严重眼表疾病的治疗奠定基础。[方法]在体外培养纯化鉴定恒河猴皮肤干细胞,并用Hoechst 33342标记,标记后的皮肤干细胞与结膜上皮细胞进行Transwell非接触共培养10d,然后对诱导后的细胞用细胞免疫化学以及流式细胞术检测结膜上皮细胞的特异性表面标志,包括角蛋白4和粘蛋白4,同时检测细胞的Hoechst 33342表达情况。[结果]纯化后的皮肤干细胞比例接近90%。Hoechst 33342标记后的皮肤干细胞胞核显示蓝色荧光。在与结膜上皮细胞共培养10d后,皮肤干细胞显示结膜上皮细胞的标志粘蛋白4和角蛋白4阳性,流式细胞术检测阳性细胞比例分别为49.9%和95.6%,同时细胞还显示胞核的Hoechst 33342表达。[结论]灵长类动物恒河猴的皮肤干细胞,在体外的适宜条件下,可诱导分化为有结膜上皮细胞特征的细胞。     

人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定

目的 探讨人胎儿角膜缘干细胞的体外培养及鉴定方法。方法 应用消化培养法对人胎儿角膜缘上皮组织进行体外培养并观察记录培养细胞的生长特性；对胎儿角膜缘组织及培养细胞采用一系列单克隆抗体进行免疫酶细胞化学染色检测；并用扫描电镜观察原代细胞的表面状况。结果 胎儿角膜缘上皮细胞原代培养时生长旺盛，传代培养时保持高增殖速率。免疫酶细胞化学染色见培养前胎儿角膜缘组织基底层有多量AE5阴性、AE1和PCNA阳性细胞，并见较多HLA-DR阳性细胞；原代细胞绝大部分AE5和HLA-DR染色阴性，AEI和PCNA阳性；传代培养至第3代时AE5阴性细胞仍占大部分；扫描电镜观察原代细胞以球形或短圆柱形为主，表面多突起和微绒毛。结论 采用消化培养法可成功培养出具有高增殖力和低抗原性的人胎儿角膜缘干细胞．为临床眼表重建开辟了新的思路。     

人、兔结膜上皮细胞的原代培养

目的探索结膜上皮细胞体外培养的最佳方法，研究其生长特性，为毒理实验及体外结膜上皮移植提供基础。方法分别用3种培养方法：(1)组织块培养法；(2)混合肖化法；(3)组织块消化后贴壁法来培养人、兔的结膜上皮细胞，观察细胞状态、不同部位的长生特性等，并尝试在羊膜、饲细胞层上培养建系。结果3种培养方法中，组织块培养法能获得较纯的结膜上皮细胞但生长缓慢，消化法能获得大量细胞，生长较快，但常常混有其它杂细胞，组织块消化后贴壁法获得细胞量较少。观察到来自兔、睑结膜及穹隆部结膜上皮的细胞生长速度较快，细胞量多，来自球结膜的细胞生长较慢。应用间接免疫荧光染色，人结膜上皮细胞K13染色阳性。结论组织块培养法及混合消化法皆能培养结膜上皮细胞，各有利弊。     

以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养角膜缘上皮细胞的实验研究

目的 建立以兔去上皮浅层角膜为载体体外培养兔角膜缘上皮细胞的培养方法 ,观察细胞生物学特性。方法 用含5%胎牛血清的DMEM/F12（1∶1）培养液对兔角膜缘上皮细胞进行体外组织块法原代培养,待细胞形成单层后,传代种植于去上皮浅层角膜载体上。每天用倒置显微镜观察培养细胞的形态及生长情况,电镜观察培育细胞的超微结构并采用HE染色和抗增殖细胞核抗原（anti-proliferating cell nuclear antigen,PCNA）单克隆抗体免疫细胞化学染色对生长于去上皮浅层角膜载体上的细胞进行检测。结果 原代培养时,48小时后可见组织块边缘有细胞生长游出,10天左右,细胞汇合成单层。传代种植于载体上,细胞24小时贴壁伸展,第5天可见部分区域细胞逐渐融合成片,11天左右细胞形成良好单层。细胞呈卵圆形或多边形,类似角膜上皮细胞;电镜下,可见细胞表面有许多微绒毛,细胞间有桥粒连接;免疫细胞化学染色显示部分细胞PCNA单克隆抗体呈阳性反应。结论 含5%胎牛血清的DMEM/F12培养液适合角膜缘干细胞的体外培养,并能成功地在去上皮角膜浅层载体上培养出类似生理状态下的角膜上皮细胞。     

Amniotic membrane utilization in ophthalmological surgical procedures

The amniotic membrane, which is the innermost layer of the fetal membranes, is composed of a single layer of epithelial cells that lie on a basement membrane, and of a non-vascular collagenous stroma. These three components give the amniotic membrane its beneficial properties. The first therapeutic application of the amniotic membrane was in 1910, when it was used in skin transplantation. Thereafter, it was used in surgical procedures related to the abdomen, genitourinary tract and to the head and neck. In ophthalmology, De Roth, in 1940, was the first to use the amniotic membrane for conjunctival reconstruction. However, it was only in 1995 that publications on the subject started appearing again, when Tseng and many others began using the amniotic membrane again in the treatment of ocular surface (cornea and conjunctiva) diseases. In cases of total stem cell deficiency, amniotic membrane transplantation has been shown to be very useful when used in conjunction with limbal autografts or allografts. At this stage, however, further studies are needed to elucidate the real potential of the amniotic membrane in the treatment of different ocular surface (and other) disorders, and its exact mechanism(s) of action. This will help establish the applications of such treatment in medicine, in general, and in ophthalmology, in particular.