Nestin-GFP小鼠胚胎干细胞的建系及体外神经分化

【目的】 建立Nestin-GFP转基因小鼠的胚胎干细胞(mESC)系,并观察其示踪ES细胞系的神经分化过程。【方法】将E3.5的Nestin-GFP小鼠囊胚接种于小鼠胚胎成纤维细胞上(MEF经γ射线照射失去增殖活性)。4 ~ 6 d后将自囊胚长出的内细胞团(ICM)继续培养并传代扩增 ,检测所得细胞Oct-4、SSEA-1和AKP等胚胎干细胞特异性标志物的表达及在体内外向三胚层分化的能力;之后,诱导细胞向神经元样细胞及神经胶质样细胞分化,利用免疫荧光检测其标志性抗原。【结果】 免疫组化可见Nestin-GFP小鼠胚胎干细胞表达未分化细胞特异性标志Oct-4、SSEA-1、AKP染色呈强阳性,并具有向体内外三胚层分化潜能;在体外诱导其向神经分化,第6 d可见到明显的绿色荧光,并与免疫组化Nestin表达部位基本吻合。第12 d及第16 d分别可见神经元及神经胶质细胞特异性标志物表达,而此时Nestin的表达较前明显下降。【结论】 成功建立了Nestin-GFP小鼠胚胎干细胞系,该细胞具有自我更新的特性及多向分化潜能,并可用于在体外更直观的监测神经分化的阶段性变化并由此进行调控。     

Cdyl基因敲除的小鼠诱导多能干细胞系的建立及鉴定

【目的】 建立Cdyl 基因敲除的小鼠诱导多能干细胞系(iPSC)。【方法】 通过组织块贴壁法培养Cdyl-/-的胚胎成纤维细胞(MEF)。将pMx-Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4和hrGFP五种质粒分别转染Plat-E细胞,收集病毒上清,感染Cdyl-/- MEF获得Cdyl-/- iPSC,并对Cdyl-/- iPS细胞的分子标记及体内外分化能力进行检测。【结果】 取Cdyl-/-胎鼠皮肤,培养得到增殖旺盛的Cdyl-/- MEF。成功包装逆转录病毒并感染Cdyl-/-MEF,得到胚胎干细胞样的Cdyl-/- iPS细胞。该细胞表达AKP、Oct3/4、SSEA-1,在体内外可以分化为三胚层的细胞类型。【结论】 Cdyl-/- iPS细胞具有自我更新和多向分化能力的特性。Cdyl-/- iPS细胞系的建立为研究Cdyl在小鼠早期胚胎发育中的功能提供一个良好的细胞模型。     

胚胎干细胞来源造血细胞的细胞表型和功能分析

【目的】 分析经卵黄囊(YS)、胎肝(FL)和骨髓来源(BM)的基质细胞条件培养液(SCCM)诱导产生的胚胎干细胞(ES)来源造血细胞的细胞表型与功能差异。【方法】 制备YS-SCCM、 FL-SCCM及BM-SCCM,将3种基质细胞条件培养液分别加入ESE 14.1细胞分化培养体系培养7 d,通过对分化ESE14.1细胞造血发育表面标志FLK-1、Integrin-α4(整联蛋白-α4、Sca-1(干细胞抗原-1)、CD34的检测、体外高增殖潜能集落形成细胞(HPP-CFC)分析及体内脾集落形成单位(CFU-S)检测,评价3种基质细胞条件培养液对ESE14.1细胞体外造血发育的调控作用。【结果】 经FL-SCCM诱导的EB细胞Flk-1、Integrinα4+ 和Sca-1+ 细胞均高于YS-SCCM和BMSC-CM诱导组,分别为3.03%、2.9%和13.74%;经BMSC-CM诱导产生的CD34+ 细胞比例最高,为1.07% 。经FLSC-CM或BMSC-CM诱导产生的造血细胞其HPP-CFC产率明显高于对照组,分别为7.4个/105细胞(P < 0.01)和5.8个/105细胞(P < 0.05);经FLSC-CM或BMSC-CM诱导产生的造血细胞其CFU-S产率亦明显高于对照组,分别为8.5个/5 × 105细胞和6.75个/5 × 105细胞(P < 0.001)。【结论】 YS-SCCM、 FL-SCCM及BM-SCCM均可诱导ESE14.1向造血细胞分化,FL-SCCM和BM-SCCM造血定向诱导效率较高,所产生的细胞具备造血细胞的正常功能,FL-SCCM诱导产生的造血细胞原始程度高于BM-SCCM诱导产生的造血细胞。     

无动物源性成分人胚胎干细胞培养体系与其它人胚胎干细胞培养体系的比较

【目的】通过比较hESC在各培养体系中未分化表面标记物及以多能性因子的表达,进一步筛选出更优化、安全有效的hESC培养体系。【方法】四种培养体系分别为:新建立的无动物源性的人包皮饲养层(XF-HFF)联合成分确定培养基(CDM)的无动物源性培养体系(XF-HFF/CDM),对照组为XF-HFF联合添加了200 mL/L人血清(HS)的培养基的培养体系(XF-HFF/HS),HS包被的培养皿联合CDM的无饲养层培养体系(HS-Matrix/CDM),以及传统的人包皮饲养层(XC-HFF)联合添加了200 mL/L血清替代物(KSR)的培养基的培养体系。通过观察克隆形态、细胞计数、免疫荧光、流式细胞术、荧光定量PCR,来比较4种hESC培养体系中的细胞增殖率、未分化表面标记物和多能性因子的表达情况,以及hESC在XF-HFF/CDM培养体系中长期培养后,对其未分化状态、多能性和染色体完整性的检测。【结果】在几种培养体系中,同一代次的hESC表达SSEA-4、TRA-1-60、Oct3/4和hTERT的情况在XF-HFF/CDM组和XC-HFF/KSR组中相似(P>0.01),且均高于其它两组培养体系(P<0.01)。hESC在XF-HFF/CDM培养体系中长期培养超过40代次,仍能表达hESC未分化表面标记物SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81及多能性因子hTERT、Oct3/4,在SCID小鼠体内能分化成含3个胚层的畸胎瘤,以及保持完整的二倍体核型。【结论】新构建的完全无动物源性的hESC培养体系的培养效率与传统添加KSR的培养体系相似,且优于相同CDM下的无饲养层培养体系以及相同饲养层下的含人血清的干细胞培养条件。     

人PC-3细胞系中前列腺癌干细胞的富集与鉴定

【目的】 从人前列腺癌PC-3细胞系中分离&#65380;富集并鉴定前列腺癌干细胞&#65377;【方法】 采用无血清培养液(SFM)悬浮细胞聚球法体外培养PC-3细胞系,通过传代更新&#65380;诱导分化&#65380;交替在含血清/无血清培养液中培养等方法鉴定PC-3悬浮成球细胞具有强增殖性&#65380;自我更新和分化潜能等肿瘤干细胞特性&#65377;以PC-3悬浮成球细胞为实验组,常规在含血清培养液(SSM)中单层贴壁培养的PC-3细胞为对照组,采用流式细胞术检测两种细胞中CD44+ CD133+细胞及侧群(SP)细胞比例&#65377;【结果】 PC-3成球细胞可以在SFM中生存并形成悬浮细胞球,悬浮培养第5天时开始可以观察到典型的悬浮细胞球形成,第10天时细胞球形成效率约为(2.6 ± 1.0)%,较第5天时明显增多(P < 0.05)&#65377;PC-3悬浮成球细胞具有自我更新和分化能力,在体外可以连续&#65380;稳定传代,在SFM中滴加血清后可以分化,交替培养于SSM和SFM中可以实现与贴壁细胞之间的相互转化&#65377;PC-3悬浮成球细胞中 CD44+ CD133+ 细胞比率为13.94%,SP细胞含量为3.1%,均显著高于常规培养的PC-3贴壁细胞(分别为0.77%和0.0%,P < 0.05)&#65377;【结论】 PC-3悬浮成球细胞具有肿瘤干细胞特性,采用无血清悬浮细胞聚球培养法可以从PC-3细胞系中简便&#65380;高效地富集前列腺癌干细胞&#65377;     

结直肠癌手术风险预测的临床应用评价

【目的】 探讨POSSUM、P-POSSUM、Cr-POSSUM及APGBI 4种评分系统预测结直肠癌手术风险的效果。【方法】 应用POSSUM、P-POSSUM、Cr-POSSUM及APGBI评分系统对2005年7月至2010年3月中山大学附属第三医院胃肠外科行手术治疗的320例结直肠癌患者进行评分分析,预测手术并发症发生率和死亡率,同时绘制各评分系统预测并发症和死亡率的ROC曲线。【结果】 POSSUM评分系统预测并发症的发生率(126例、39.4%)及死亡率(32例、10%)分别显著高于实际并发症率(82例、25.6%,P < 0.01)及死亡率(9例、2.8%,P < 0.01),但老年患者的并发症预测发生率与实际发生率无统计学差异,其C-Index为0.767,最佳临界值为45%、P-POSSUM、Cr-POSSUM及APGBI评分系统预测死亡率(分别为12例、3.8%,13例、4.1%及14例、4.4%)与实际死亡率(9例、2.8%)无统计学差异,其C-Index分别为0.872、0.906及0.936,最佳临界值分别为7%、5%及4%。【结论】 POSSUM评分系统能较准确地预测高危结直肠癌手术患者的并发症发生率,但过高预测死亡率,P-POSSUM、Cr-POSSUM及APGBI评分系统均能准确预测结直肠癌患者手术死亡率。     

三种不同型别小鼠骨髓来源间质干细胞的生物学特性分析

【目的】间质干细胞(MSC)是一种间质来源的多潜能基质细胞,目前人和多种动物来源的MSC均已被成功分离鉴定。然而由于小鼠骨髓MSC的分离相对人和其他物种更为困难,关于小鼠骨髓MSC的克隆分析结果也相对有限且结果不尽一致。为此,本研究拟进一步探讨小鼠MSC的体外分离方法,并对MSC克隆形成单位进行生物学特性分析。【方法】 取C57BL/6小鼠,冲洗股骨骨髓腔获得骨髓单个核细胞悬液,低密度接种培养,并通过有限稀释克隆挑选获得三种形态、生长特点不同的克隆形成单位(CFU)。采用流式分析技术对三种类型的CFU进行表型分析,并用油红O和茜素红分别进行成脂和成骨分化诱导鉴定。【结果】 低密度培养并结合克隆化培养分离技术成功获得C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,并观察到偏圆形(MSC1)、长梭形(MSC2)以及纺锤形、多边形(MSC3)三种贴壁形态细胞类型;免疫表型分析显示,三种细胞均强表达Sca-1,不表达CD11b、CD45,部分表达CD90.2;体外诱导分化实验证实,MSC1仅具有向脂肪细胞分化的潜能,MSC2仅具有向成骨细胞分化的潜能;MSC3则具有成骨、成脂双向分化能力。【结论】 低密度培养并结合克隆化培养分离技术可成功分离小鼠骨髓间充质干细胞;小鼠MSCs是一种高度异质性的细胞群,其中可能含有多能MSC或单一分化方向的前体细胞等处于不同分化阶段的细胞类型。     

蛛网膜下腔联合硬膜外腔阻滞用于分娩镇痛时机的探讨

【目的】 探讨实施蛛网膜下腔阻滞-硬膜外联合分娩镇痛时机对产程和分娩结局的影响。【方法】 370例产妇按照宫颈口开张程度分为2组,潜伏期组130例在宫颈口开张1 ~ 2 cm时开始实施蛛网膜下腔阻滞-硬膜外联合镇痛,活跃期组240例在宫颈口开张3 ~ 8 cm时开始实施镇痛,记录2组产妇年龄、孕周、孕次、产程、分娩方式、缩宫素应用情况、产后24 h出血量、胎儿窘迫、羊水粪染、新生儿体质量及新生儿生物物理评分(即1 min及5 min Apgar评分)、新生儿黄疸。【结果】 潜伏期组和活跃期组比较,潜伏期延长[(453 ± 203)min vs,(338 ± 182)min,P = 0.000]。活跃期组的活跃期时间明显延长[(229 ± 109) min vs(197 ± 101) min,P = 0.011]。第2、3产程和总产程比较差异无统计学意义(P = 0.200,P = 0.222,P = 0.091)。潜伏期组的缩宫素使用率较高(43.08% vs 23.33%,P = 0.012)。两组器械助产率、剖宫产率、产后24 h出血量比较差异无统计学意义(P > 0.05)。胎儿窘迫率、新生儿生物物理评分、新生儿高胆红素血症发生率2组比较差异无统计学意义(P >0.05)。【结论】 潜伏期实施联合分娩镇痛可能抑制子宫收缩、延长潜伏期,正确使用缩宫素可以减少分娩镇痛带来的不利影响。     

早发精神分裂症全脑灰质体积的变化

【目的】 研究早发精神分裂症患者全脑灰质结构的变化。【方法】 对2009 年6月至2010 年11月共21例发病年龄小于18岁的精神分裂症患者和22例在年龄、性别、受教育年限与患者组相均衡的健康对照纳入研究。对所有受试者首先以1.5T磁共振系统以冠状自旋回波序列进行全脑T2加权和质子密度加权图像,排除全脑器质性病变。然后以矢度梯度回波序列得到T1加权成像。T1加权图像经MRIcro软件转化为统计参数图-V(SPM5)软件可以处理的图像。以SPM5软件对转化后图像进行基于体素形态学分析(VBM),完成标准化、分割、调整和平滑等步骤、对患者组和健康对照组的平滑后灰质图像以VBM方法进行两样本t检验。以阳性和阴性症状量表评估患者精神症状。【结果】 早发精神分裂症患者组灰质体积小于健康对照组的脑区有:右侧额下回(MNI: 43,20,-14;clutser = 407 voxels)、左侧额上回(MNI:-28,-3,65;cluster = 176 voxels)、右侧额上回(MNI: 48,-10,54;cluster = 141 voxels);未发现患者组灰质体积大于健康对照组的脑区。【结论】 早发精神分裂症存在右侧额下回和双侧额上回灰质异常,此异常改变可能与精神分裂症的神经病理机制有关。     

频域光学相干断层扫描在白内障患者术前检查中的应用

【目的】 探讨新一代频域光相干断层扫描(SDOCT)在白内障术前检查中的作用和成效。【方法】 随机选取2009年6月至2010年6月在我院行白内障超声乳化及人工晶体植入手术患者共计454例,实验组使用海德堡公司生产的Spectralis HRA-OCT,采用标准快速OCT检查模式,对白内障患者进行术前视网膜检查,获取OCT图像,判断视网膜疾病。对照组采用KOWA眼底相机采集视网膜图像,判断视网膜疾病。对比两种检查方法对视网膜疾病的检出率。【结果】 实验组共有312例成功获取OCT图像,占总数67.8%,检查出白内障术前病例共有37例存在不同类型的视网膜疾病,检出率为8.15%,其中有各期黄斑裂孔6例、糖尿病视网膜病变8例、视网膜前膜与高度近视性视网膜病变各4例、黄斑玻璃体牵拉症3例、老年性黄斑变性、视网膜色素变性、黄斑囊样水肿各2例、陈旧性中心性浆液性脉络膜视网膜病变、视网膜色素上皮脱离、结晶样视网膜病变、黄斑下疤痕增殖、视网膜劈裂及视网膜下出血各1例。对照组通过眼底彩照可检查出阳性病例12例,阳性率2.64%,其中有糖尿病视网膜病变8例、视网膜色素变性2例、视网膜结晶样变性1例、视网膜下出血1例。两种方法对视网膜疾病检出率有统计学差异(P < 0.05)。【结论】 与传统的眼科影像学方法相比,SDOCT可以有效提高白内障术前视网膜疾病的检出率,有利于对白内障预后效果的综合判断。     

猪诱导多能干细胞可定向分化为前脑GABA能神经元前体

目的 探讨猪诱导多能干细胞（iPSCs）体外定向分化为GABA能神经元前体的方法体系。方法 猪iPSCs诱导分化为GABA能神经元前体遵循两个阶段,第1阶段,猪iPSCs悬浮培养,第3天时形成类胚体,采用神经诱导培养基NIM（SB431542、DMH1、FGF2）继续诱导,第12天分化为原始神经上皮细胞。第2阶段,使用含Pur、B27的NIM培养基悬浮培养形成神经球,至第21天时形成GABA能神经元前体。CM-DiI标记后,定向移植帕金森（PD）模型大鼠黑质纹状体,检测其在宿主脑内存活、迁移及分化状况。结果 猪iPSCs在饲养层细胞上稳定传代,表达多能性标记OCT4、Nanog、SSEA1和TRA-160,并且核型分析显示没有其他物种来源细胞污染。第12天经诱导分化获得原始神经上皮细胞能够形成玫瑰花环结构,并表达其表面标记物（PAX6、SOX2 和 Nestin）与神经微管蛋白标志物 Tuj1。第 21 天诱导细胞高表达 GABA 能神经元前体的表面特异性抗原NKX2.1和前脑标志物FOXG1。移植8周后,体内可分化为GABA能神经元与多巴胺能神经元,明显改善PD大鼠运动行为。结论 结合无血清培养基筛选法逐步定向诱导猪iPSCs高效分化为前脑GABA能神经元前体,移植后能够显著改善PD大鼠的运动功能障碍,为诱导GABA能神经元前体移植治疗神经损伤疾病奠定基础。     

建立植入前遗传学检测人胚胎来源的无动物源性干细胞系

【目的】在无动物源性的干细胞培养体系中建立植入前遗传学检测（PGT）胚胎来源的人胚胎干细胞系,为医学研究提供疾病模型。【方法】在我们的研究中,对无动物源性的人类包皮成纤维细胞饲养层（XF-HFF）与成分确定的培养基（CDM）构建的无动物源性培养体系进行了评估。在该培养体系中,利用染色体平衡易位患者PGT来源的废弃胚胎建立一个新的人胚干细胞（hESC）细胞系。【结果】新建立的人胚胎干细胞系在无动物源性培养系统中可长期培养传代（>45个代次）。核型分析显示,在传代45代次后,新建立的人胚胎干细胞仍保持一致的核型。XF-HFF/CDM中的hESC仍保持多能性。通过荧光免疫染色检测到SSEA-3、SSEA-4、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81等多能标志物的表达;RT-PCR分析显示,在XF-HFF/CDM培养体系上生长的hESC中存在干细胞标记。小鼠体内实验也证实了hESC在体内维持其多能性。【结论】本研究建立了PGT来源的人胚胎干细胞系,为进一步建立携带遗传疾病基因的hESC系并为临床研究和治疗提供疾病模型打下了基础。     

类胚体中残留未分化胚胎干细胞的初步研究

目的 探讨类胚体中残留未分化胚胎干细胞（ESC）的特性。方法 小鼠R1和Oct-4-GFP转基因ESC细胞株,体外类胚体分化20 d后消化打散,重新给予ESC常规培养液培养。观察类胚体中残留未分化细胞形态;流式细胞仪和免疫荧光染色检测和观察残留细胞表面标志物及体外再次分化能力。将残留细胞扩增后注射入裸鼠背部皮下和大腿肌肉内,6周后注射部位取材进行大体和组织学检查。结果 分化20 d的类胚体中存在残留未分化ESC,生长形态呈克隆样,表达SSEA1、CD31、CD9和Oct-4等未分化ESC标志;细胞能反复传代,并可在体外再次分化和残留。残留细胞注射部位形成畸胎瘤,瘤体组织中存在成熟的内胚层、中胚层和外胚层组织。结论 胚胎干细胞分化为类胚体后仍存在残留未分化全能ESC,残留细胞在体内、外可再次分化,并能在体外分化中再次残留。     

无bFGF条件下简便有效建立C57BL/6J小鼠胚胎干细胞系

目的:在不含bFGF的Knockout血清替代品(knockout serum replacement,KSR)的培养条件下,简便、有效地建立小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)系.方法:以C57BL/6J小鼠3.5天囊胚为材料,改良巴氏德管机械法分离内细胞团,于加或不加碱性成纤维细胞生长因...     

神经干细胞的分离培养和鉴定及体外长期培养

目的探索新生SD大鼠神经干细胞的分离培养、鉴定及体外长期培养的方法。方法分离新生SD大鼠海马组织,用无血清培养技术培养神经干细胞,免疫组织化学荧光技术检测其巢蛋白(Nestin)的表达;并用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入试验,免疫荧光双标技术观测神经干细胞的增殖状况。诱导神经干细胞分化,分别用神经元特异性核抗原(NeuN)抗体、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体、2,3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)抗体进行免疫组织化学荧光染色鉴定分化细胞。结果获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团,并能分化为神经元和神经胶质细胞,且经传代培养10代以上仍具干细胞特性。结论成功培养出胚胎大鼠神经干细胞,培养出的细胞具有增殖、自我更新及多潜能分化能力,可分化为神经元及神经胶质细胞并可作为神经干细胞移植实验研究的供体细胞。     

从小鼠胚胎干细胞文库中筛选PIASx相互作用蛋白

目的应用酵母双杂交系统,从小鼠胚胎干细胞cDNA文库中筛选与PIASx(protein inhibitor ofactivated STAT x,PIASx)相互作用的蛋白。通过对其相互作用蛋白的筛选和研究,探讨PIASx在干细胞分化中的作用机制。方法以pGBKT7-PIASx为诱饵质粒,从小鼠胚胎干细胞cDNA文库中筛选出与PIASx相互作用的阳性克隆,对验证后的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,进一步采用直接酵母双杂交进行相互作用验证。结果经过筛选、测序、同源性分析及直接酵母双杂交验证,发现了6种与PIASx相互作用的蛋白。结论应用酵母双杂交系统,共筛选得到了6种不同的基因,其编码蛋白与PIASx相互作用,可能与小鼠胚胎干细胞的增殖与分化相关。对PIASx相互作用蛋白的筛选有助于揭示PIASx在胚胎干细胞中的作用机制。     

细胞外基质的程序性应用促进胚胎干细胞的神经分化

目的 探讨细胞外基质(ECM)在胚胎干细胞(ESCs)诱导分化中特定时期的作用.方法 将ESCs悬浮培养形成胚胎小体(Embryonic bodies,EBs),用高浓度维甲酸(RA)诱导,再将EBs接种在GL、FN、LPO基质上进行分化,利用免疫荧光方法 比较这些基质对神经分化的影响;进一步检测LPO对神经突起生长的影响.结果 高浓度RA启动并加速了nestin阳性的神经前体细胞的分化;FN对ESCs的神经分化具有剂量依赖性的促进作用,可提高神经元的分化率;LPO基质能够促进神经细胞的突起生长,进一步诱导神经细胞的成熟.结论 不同基质在分化的特定阶段起到了不同作用,在诱导神经前体分化阶段应用FN以及在诱导神经细胞分化阶段应用LPO的联合作用对ESCs向神经细胞分化作用最显著.     

人类胚胎干细胞体外分化形成包含多种细胞的类胚体

目的:研究人类胚胎干细胞的体外多向分化能力.方法:胚胎干细胞在无饲养细胞、无碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、悬浮条件下培养形成类胚体.采用RT-PCR方法检测不同培养时间类胚体中某些功能细胞的特征分子标志.结果:在无饲养细胞、无bFGF、悬浮条件下培养,胚胎干细胞自动聚集形成细胞团,逐渐长大并分化为囊实性类胚体.RT-PCR显示,类胚体表达多种细胞前体及功能细胞的分子标志,如神经前体细胞、胰岛前体细胞以及成熟神经细胞、表达胰岛素的β细胞、表达胰高血糖素的α细胞和肝细胞等等.不同细胞标志在类胚体中出现的时间段有差异,先出现分化程度低的前体细胞分子标志,然后出现成熟细胞的分子标志.结论:人类胚胎干细胞体外可自然分化为表达多种细胞标志的类胚体,是进行深入体外诱导分化研究的基础.     

类胚体中残留细胞分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子的关系

目的 研究小鼠胚胎干细胞体外类胚体分化后残留未分化细胞的分化能力,探讨其分化全能性维持与外源性白血病抑制分化因子（LIF）的关系。方法 小鼠R1胚胎干细胞体外经20 d的类胚体诱导分化后,胰酶消化为单细胞悬液,在不含LIF的DMEM培养液中贴壁培养。扩增后的细胞用流式细胞仪分析未分化及分化表面标志（CD9、SSEA1和Flk-1）的表达情况。分别于再次类胚体诱导分化前后,RT-PCR检测Oct-4、Nanog、Rex1、FGF5、Nestin、Brachyury、Flk-1和GATA6表达。将扩增后的残留细胞注射至裸鼠皮下,检测畸胎瘤形成能力。Oct-4/GFP 转基因小鼠胚胎干细胞在半固体培养基上作单细胞分化,20 d后统计分化残留率。结果 在不含LIF的DMEM培养液中的残留细胞呈克隆样生长,表达未分化胚胎干细胞标志CD9、SSEA1、Oct-4、Nanog和Rex1。残留细胞体外可再次诱导分化,表达3个胚层的分化标志。残留细胞裸鼠皮下注射6周后形成畸胎瘤。单细胞分化实验表明,常规培养的小鼠胚胎干细胞中约14%的细胞具有分化残留能力。结论 残留胚胎干细胞全能性维持不依赖外源性白血病抑制分化因子;常规培养的胚胎干细胞仅部分具有残留能力。