碱性成纤维生长因子对脂肪干细胞分化为心肌细胞的影响

【目的】探讨碱性成纤维生长因子(b FGF)对脂肪干细胞(ADSC)分化为心肌细胞的影响。【方法】从SD大鼠中提取、分离、培养、鉴定ADSC后,评价ADSC分化能力。将成功建立心肌梗死(MI)模型的60只大鼠随机分4组(n=15/组):PBS组、b FGF组、ADSC组及b FGF+ADSC组。建立心梗1周后分别注射PBS、b FGF、ADSC及b FGF+ADSC,4周后用心脏超声测量心梗大鼠的左室射血分数(EF),取大鼠心脏检测左室梗死面积、微血管密度(MVD)及ADSC分化。【结果】成功分离ADSC,流式细胞分析显示大多数ADSC表达CD29和CD90,不表达CD34和CD45。ADSC能被诱导分化成成脂、成骨细胞。b FGF+ADSC组及ADSC组的EF高于PBS组和b FGF组(P<0.01),b FGF+ADSC组的EF高于ADSC组(P<0.01),PBS组和b FGF组的EF差别无统计学意义(P=0.33)。b FGF+ADSC组及ADSC组的梗死面积小于PBS组和b FGF组(P<0.01),b FGF+ADSC组的梗死面积小于ADSC组(P<0.01),PBS组和b FGF组的梗死面积差别无统计学意义(P=0.28)。四组中b FGF+ADSC组的MVD最大(P<0.01)。ADSC可分化为c Tn T阳性细胞、SMA阳性细胞及fⅧ阳性细胞。【结论】b FGF可促进ADSC分化成心肌细胞和新生血管,改善心脏功能。     

继发性肾源性异位甲状旁腺功能亢进的介入栓塞治疗

目的探讨介入栓塞治疗继发性肾源性异位甲状旁腺功能亢进的有效性、安全性及可行性。 方法术前通过高频超声、^99mTc-MIBI甲状旁腺核素显像、增强CT或增强MRI检查评估异位甲状旁腺的解剖位置及动脉血供情况,采用介入栓塞的方式阻断其供血动脉,从而使其逐渐缺血坏死失去功能。 结果第1例患者的异位甲状旁腺通过介入栓塞治疗后,其甲状旁腺素（parathyroid hormone,PTH）水平迅速下降,血钙、血磷亦迅速下降,皮肤瘙痒、周身骨痛等临床症状明显缓解;第2例患者因供血动脉显示不清,加之术中难以配合,仅完成部分血管栓塞,其PTH、血钙、血磷等指标呈一过性下降,但最终疗效不佳。 结论介入栓塞治疗异位甲状旁腺是一种创伤小、操作简便、疗效相对可靠、安全性高的方法,成功的关键是术前明确定位及供血动脉,术中尽量完全栓塞其供血动脉,但其长期有效性尚需进一步评价。     

利用多位点Gateway技术构建小鼠平滑肌肌动蛋白α基因启动子慢病毒载体

背景:平滑肌肌动蛋白α基因是相对局限于在血管平滑肌细胞中表达的少数几个基因之一,公认是血管平滑肌细胞表型转化的标志。目的:利用多位点Gateway技术构建慢病毒载体pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α控制绿色荧光蛋白基因的表达。方法:设计合成含有attB位点的小鼠平滑肌肌动蛋白α基因启动子引物,构建pUp-平滑肌肌动蛋白α;通过LR反应将pUp-平滑肌肌动蛋白α和pDown-绿色荧光蛋白(含att位点的绿色荧光蛋白入门克隆)连接到目的载体pDEST-puromycin,得到pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-绿色荧光蛋白表达载体;经PCR和测序鉴定,将载体质粒瞬时转染C2C12细胞系,并且用免疫荧光染色检测基因的表达。结果与结论:成功构建pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-绿色荧光蛋白报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;细胞转染实验以及免疫荧光检测证实构建的报告基因载体可以反映平滑肌肌动蛋白α基因的表达情况。     

人骨髓间充质干细胞靶向纳米基因载体制备及体外细胞磁共振成像

目的 探讨靶向纳米基因载体单链神经节苷脂抗体-聚乙二醇-聚乙烯亚胺-超顺磁性氧化铁（scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION）转染人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）的可行性、效率及体外细胞MR显像能力。方法 合成scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION后,采用凝胶阻滞实验评估其复合外源性基因的能力;动态光散射法测量scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA纳米复合物的粒径大小及表面电位;体外细胞毒性实验检测其对hBMSCs的细胞毒性。采用流式细胞仪检测scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION靶向转染hBMSCs的效率,并设置PEG-g-PEI-SPION组、cAbGD2-PEG-g-PEI-SPION组、抗体竞争抑制（scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2）组和同型抗体（scAbIgG2a-PEG-g-PEI-SPION）组,通过激光共聚焦显微镜及普鲁士蓝染色观察hBMSCs对纳米复合物的摄入。通过体外细胞MR扫描验证scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION的MR成像功能。结果 scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION细胞毒性小,复合外源性基因后能够形成稳定的纳米复合物,粒径80~100 nm。在相同的N/P比值下,scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION组的转染率明显高于其他组（P<0.001）。N/P=20时,靶向组具有最高转染率[（59.60±4.50）%]。同时,scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION中的SPION可有效标记hBMSCs,在MR T2/T2^*加权图像上呈低信号。结论 scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION是一种MRI可视的、可有效转染hBMSCs的靶向纳米基因载体。     

利用多位点Gateway技术构建小鼠平滑肌肌动蛋白α基因启动子慢病毒载体

背景：平滑肌肌动蛋白α基因是相对局限于在血管平滑肌细胞中表达的少数几个基因之一,公认是血管平滑肌细胞表型转化的标志。 目的：利用多位点Gateway技术构建慢病毒载体pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α控制绿色荧光蛋白基因的表达。 方法：设计合成含有attB位点的小鼠平滑肌肌动蛋白α基因启动子引物,构建pUp-平滑肌肌动蛋白α;通过LR反应将pUp-平滑肌肌动蛋白α和pDown-绿色荧光蛋白(含att位点的绿色荧光蛋白入门克隆)连接到目的载体pDEST-puromycin,得到pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-绿色荧光蛋白表达载体;经PCR和测序鉴定,将载体质粒瞬时转染C2C12细胞系,并且用免疫荧光染色检测基因的表达。 结果与结论：成功构建pLVpuro/平滑肌肌动蛋白α-绿色荧光蛋白报告基因载体,测序结果表明启动子序列正确;细胞转染实验以及免疫荧光检测证实构建的报告基因载体可以反映平滑肌肌动蛋白α基因的表达情况。     

过表达肝细胞核因子4 alpha对人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的作用

目的 应用转基因技术将肝细胞核因子4 alpha（HNF-4α）转导入人骨髓间充质干细胞（MSCs）内,使其连续过表达HNF-4α并促进MSCs向肝样细胞分化。方法 HNF-4α基因通过慢病毒表达载体pLV/Final-puro-hHNF4α-hrGFP转入人MSCs（UE7T-13细胞）内,用流式细胞分析法检测及分选后,收集hrGFP阳性的UE7T-13细胞进行扩增。体外成肝诱导一周后,免疫荧光染色检测过表达HNF-4α基因的UE7T-13细胞（E7-hHNF-4α细胞）的白蛋白（ALB）和细胞角蛋白（CK18）的表达情况,糖原染色检测UE7T-13细胞及E7-hHNF-4α细胞的糖原储存功能。结果 建立稳定、过表达hHNF-4α基因的E7-hHNF-4α细胞,持续过表达HNF-4α促进MSCs向肝样细胞分化,经过7天体外成肝诱导,E7-hHNF-4α细胞具有成熟肝样细胞表达ALB和CK18蛋白及糖原储存功能。结论 利用Gateway 技术可将HNF-4α高效转导入人MSCs细胞中,并有效促进MSCs向肝样细胞分化。     

Cdyl基因敲除的小鼠诱导多能干细胞系的建立及鉴定

【目的】 建立Cdyl 基因敲除的小鼠诱导多能干细胞系(iPSC)。【方法】 通过组织块贴壁法培养Cdyl-/-的胚胎成纤维细胞(MEF)。将pMx-Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4和hrGFP五种质粒分别转染Plat-E细胞,收集病毒上清,感染Cdyl-/- MEF获得Cdyl-/- iPSC,并对Cdyl-/- iPS细胞的分子标记及体内外分化能力进行检测。【结果】 取Cdyl-/-胎鼠皮肤,培养得到增殖旺盛的Cdyl-/- MEF。成功包装逆转录病毒并感染Cdyl-/-MEF,得到胚胎干细胞样的Cdyl-/- iPS细胞。该细胞表达AKP、Oct3/4、SSEA-1,在体内外可以分化为三胚层的细胞类型。【结论】 Cdyl-/- iPS细胞具有自我更新和多向分化能力的特性。Cdyl-/- iPS细胞系的建立为研究Cdyl在小鼠早期胚胎发育中的功能提供一个良好的细胞模型。     

经不同动脉入路治疗完全闭塞型自体动静脉内瘘的疗效及安全性观察

目的探讨经股动脉及肱动脉入路腔内血管成形术（percutaneous trans1uminal angioplasty,PTA）联合置管溶栓治疗完全闭塞型自体动静脉内瘘（arteriovenous fistula,AVF）的疗效、安全性及AVF远期通畅状况。 方法回顾性分析我院2016年3月至2018年6月期间收治的53例AVF闭塞且经动脉入路行PTA联合置管溶栓治疗的病例。分析患者基线资料、手术结局、并发症、射线暴露时间及剂量,随访观察患者AVF的通畅时间及通畅率。 结果经过治疗的53例AVF闭塞的患者中,成功48例,失败5例,总体技术成功率为90.6%;肱动脉入路组成功率优于股动脉入路组,两组之间差异有统计学意义（其中P<0.05）;两组之间并发症差异（P=0.234）及初级通畅率差异（P=0.278）无统计学意义;在统计手术射线暴露时间时发现,股动脉入路组射线暴露时间为（2 601.5±1 803.9）s,远长于肱动脉入路的（1 191.8±844.5）s,差异有统计学意义（P<0.05）;肱动脉入路组射线的暴露剂量为（25.15±26.06）mGy,明显小于股动脉入路组的剂量（97.58±69.85）mGy,差异有统计学意义（P<0.05）。 结论经股动脉及肱动脉入路PTA联合置管溶栓可以有效治疗完全闭塞型AVF,且术后的AVF在持续随访中有较好的远期通畅性;但在手术时射线暴露时间及剂量方面,肱动脉入路组明显优于股动脉入路组。