丙型肝炎病毒1bDY株ns5a基因的克隆及其所表达融合蛋白的免疫原性分析

目的:克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因,为进一步研究和应用该基因及其表达产物奠定基础。方法:采用基因重组技术完成实验。设计特异的引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出目的片段,约480bp;将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,再与原核表达载体pET-28a重组;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达。采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白表达水平。结果:含有HCV 1b DY株ns5a基因的重组体构建成功,并得以表达蛋白,并且NS5A蛋白具有与HCV患者阳性血清中的多克隆的结合活性,具有很好的免疫原性。结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV 1b DY株ns5a基因,为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造条件。     

HCV不同编码区重组基因的蛋白表达丰度分析

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)不同基因片段重组载体在pET大肠杆菌系统中的蛋白表达情况.方法:分别将构建好的含有HCV C、NS3、NS5片段基因的pET重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中.通过卡那霉素抗性筛选转化子.经过IPTG诱导表达相应的重组蛋白,通过Ni-NTA凝胶亲和层析纯化各目标蛋白,并分别计算各重组蛋白的浓度.结果:分别诱导表达含有HCVC、NS3、NS5片段基因的重组蛋白,各蛋白的浓度分别为:3.557(1型NS3)、4.238(6型NS3)、2.087(NS5)、1.490g/L(C).结论:在相同条件下,诱导表达含有HCV不同基因片段的重组载体,所得到的蛋白丰度存在差异.     

弓形虫ZS株P22基因片段的克隆、表达与融合蛋白的纯化

目的 克隆弓形虫ZS株表面抗原P22编码基因，构建原核重组表达质粒pThioHieA，B，C／P22，并在大肠杆菌(Top10)中进行表达及纯化融合蛋白。方法 PCR扩增及限制性内切酶Pst Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切496bp的弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段，胶回收纯化，插入表达质粒裁体pThioHisA，B，C多克隆位点，构建置组体pThioHisA，B，C／P22，并转化大肠杆菌(E.coli)Topl0，筛选阳性克隆，以限制性酶切分析及测序鉴定后，以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导，在E.coli Top10中表达，用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达产物并纯化．结果 PCR扩增出约496bp的P22编码基因目的片段，与预期片段大小相符；所构建的pThioHisA，B，C／P22重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定，与预期结果一致；SDS—PAGE与免疫印迹显示，表达融合蛋白产物约35．4kD．结论 成功构建弓形虫ZS株表面抗原P22编码基因pThioHisA，B，C／P22表达质粒，诱导表达弓形虫表面抗原P22蛋白，并纯化该融合蛋白。     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建及其在HL-7702细胞中的高效表达

目的：构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A基因的真核表达载体，并在正常人肝细胞株(HL-7702细胞)中进行表达，为今后研究HCV NS5A蛋白功能奠定基础。方法：从含HCV NS345序列的重组质粒pCDNA3.1（+）/ NS345中扩增出HCV NS5A基因片段，构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒。用脂质体将其转染HL-7702细胞，通过Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白。结果：用PCR方法扩增的HCV NS5A基因全长1 344 bp,与PGEM-T重组，测序证实所克隆的NS5A基因片段大小正确；成功地构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒，瞬时转染HL-7702细胞表达NS5A蛋白，Western blotting印迹法显示其相对分子质量约为56 000。结论：HCV NS5A的真核表达载体pCI-neo/ NS5A在HL-7702细胞中能有效表达NS5A蛋白，NS5A蛋白可导致病毒复制、肝细胞癌发生，且NS5A区为IFN敏感性决定区。     

丙型肝炎NS5A基因多克隆抗体的制备

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）NS5A蛋白原核表达载体,获得高产量的纯化目的蛋白,并制备其多克隆抗体。方法：应用聚合酶链反应技术,PCR扩增获得NS5A基因,将NS5A基因插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠埃希菌DH5α提取质粒,验证正确后,转化大肠埃希菌BL21中,以IPTG诱导,获得NS5A融合蛋白的可诱导性表达．通过SDS—PAGE电泳、Western blot免疫印迹分析证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni^＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：NS5A融合蛋白表达成功,成功获得了融合蛋白及兔抗NS5A多克隆抗体。结论：成功表达NS5A基因融合蛋白．获得高特异性、兔抗NS5A多克隆抗体,为研究NS5A基因的生物学功能提供了重要制剂。     

PTD-Cyclin D1融合蛋白的原核表达及纯化

目的:构建融合重组表达载体并对其进行诱导表达和蛋白纯化以获得大量重组融合蛋白.方法:通过PCR方法扩增出Cyclin D1基因,克隆入pMD-18T载体,进行测序分析,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-16b中PTD的下游构建重组质粒pET16b-PTD-CCND1,转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析.结果:构建了重组融合表达质粒pET16b-PTD-CCND1,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在约Mr 38×103处出现了一条新生的蛋白条带,经灰度扫描检测,表达量约占菌体总蛋白的22%,纯化后得到了目的蛋白.结论:成功地克隆了小鼠的Cyclin D1基因并纯化了融合基因PTD- CCND1的原核表达产物.     

丙型肝炎病毒ns5b基因的克隆、表达及鉴定

目的：构建HCV ns5b基因的重组原核表达质粒，并获得NS5B蛋白的高效表达，为制备抗NS5B抗体及以其为靶位的抗HCV感染研究创造条件。方法：利用PCR技术扩增HCV ns5b基因，Xho I和Kpn I双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pRSETA上，转化大肠杆菌JM109菌株，获得阳性重组质粒pRSETA-ns5b，阳性质粒转化BL21(DE3)，IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE和Western Blot电泳进行鉴定，并以薄层扫描分析对其定量。结果：成功构建了HCV NS5B蛋白表达载体pRSETA-ns5b，经诱导明显表达出6His-NS5B融合蛋白，表达产物主要以包涵体形式存在，表达量占菌体蛋白25％，Western—Blot结果显示表达蛋白保持活性。结论：HCV NS5B蛋白在体外得到了有效表达。     

呼吸道合胞病毒NS1基因原核表达及其免疫原性分析

目的:原核表达呼吸道合胞病毒(RSV)非结构NS1蛋白,并对其免疫特性进行研究.方法 采用PCR技术获得NS1基因,将其插入pET41a(+)载体上,导人大肠杆菌后诱导表达;利用GST亲和层析柱对诱导表达的NS1蛋白进行纯化,免疫动物制备抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性.结果 重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测序完全正确,经IPTG诱导后融合蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中得到高效表达,表达产物经超声破碎和GST亲和层析纯化获得重组蛋白,分子量约42 000 Mr,以抗NS1蛋白的多克隆抗体为一抗进行Western blot检测,结果只有RSV感染细胞的样品在15 000 Mr处有特异性带显示,其他病毒感染的细胞和阴性对照没有相应条带.结论 NS1基因得到高效表达,免疫制备得到的抗体与RSV感染细胞有特异性反应,与其他常见呼吸道病毒感染细胞无交叉免疫反应.     

人可溶性CD83基因的克隆、原核表达和纯化

目的:构建人可溶性CD83基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:利用反转录PCR方法从正常人外周血单个核细胞中获得可溶性CD83基因,克隆到表达载体pET-32a载体,构成重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定.表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化.结果:经酶切鉴定及测序证实可溶性CD83蛋白基因的原核表达载体构建正确.经SDS-PAGE及Western blot显示在M,约32 000处出现融合表达条带.融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的45%.重组蛋白经Ni-NTA亲和层析进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白.结论:成功克隆人外周血单个核细胞来源的可溶性CD83基因片段,并在大肠杆菌B121(DE3)中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度融合蛋白.     

丙型肝炎病毒不同编码区His融合抗原的表达与纯化

目的:表达和纯化丙型肝炎病毒(HCV)-Core、NS3和NS4的His融合抗原H-C、H-NS3和H-NS4,并初步探讨其在抗体检测中的应用。方法:用重组基因工程技术,构建3种重组质粒C-pET-28a-c( )、NS3-pET-28a-c( )和NS4-pET-28a-c( )以及相应的工程菌;质粒经双酶切、PCR和测序鉴定正确后,IPTG诱导抗原表达,从IPTG使用浓度、诱导温度与时间3个方面优化抗原表达条件;用NTA柱纯化抗原后,分别用单片段重组抗原和混合抗原以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测100份HCV抗体阳性血清和40份健康人血清。结果:用单片段重组抗原和混合抗原检测的100份HCV抗体阳性血清中,H-C、H-NS3和H-NS4的抗体阳性率分别为91%、75%和52%,而H-C、H-NS3和H-NS4混合抗原的抗体检出率为100%;检测40份健康人血清,结果全部为阴性。结论:HCV不同编码区单片段His融合抗原具有不同的抗体检出率,但均低于混合抗原的阳性率;在开发HCV抗体诊断试剂时,应采用HCV混合抗原。