LAPTM4B-35蛋白作为肝癌血清学诊断新标志物的探讨

目的: LAPTM4B-35是北京大学基础医学院发现和鉴定的一个肿瘤驱动基因LAPTM4B所编码的蛋白质同型分子(isoform)之一,其在多种恶性肿瘤中[如肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌等]均超高表达。实验室和临床资料均证明,LAPTM4B-35蛋白的过表达促进肿瘤生长、转移和多药耐药,LAPTM4B-35的蛋白表达水平与肝癌的复发相关。本文的目的在于鉴定患者体内的肝癌细胞和体外培养的肝癌细胞系是否释放出LAPTM4B-35蛋白到血液和细胞培养液中,以及其可能的存在形式,为建立肝细胞癌等肿瘤的血清学诊断新方法奠定基础。方法: 采用免疫印迹分析(Western blot)、酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)鉴定LAPTM4B-35蛋白,应用超滤和超离心方法从肝癌细胞培养上清液中分离、纯化外排体(exosome)。结果: 特异性抗体的ELISA结果表明,肝细胞癌患者的血液中存在LAPTM4B-35蛋白,体外培养的肝癌细胞以外排体形式释放LAPTM4B-35蛋白到培养基的上清液中。ELISA夹心法检测表明,肝细胞癌患者(n=43)血淸中LAPTM4B-35蛋白的平均水平和中位值均显著高于正常人(n=33)。结论: 肝癌细胞以外排体形式释放到其外环境中的LAPTM4B-35蛋白有望成为肝细胞癌血清学诊断的新标志物。     

LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建

目的:LAPTM4B基因是肝癌中高度表达的新基因.为下一步LAPTM4B启动子的活性分性,本文构建了LAPTM4B基因启动子调控的报告基因重组表达质粒.方法:以LAPTM4B基因组cDNA为模板扩增翻译起始位点上游DNA序列.PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,并经限制性内切酶消化鉴定.结果:通过酶切鉴定和基因测序,证明成功地构建了三种不同长度的pGL3-LAPTM4B-Luc荧光素酶表达质粒,形成了系列的LAPTM4B启动子重组体.结论:充分利用生物信息学资源,利用已知基因的启动子序列,可快速,准确地克隆已知基因启动子序列并构建启动子载体.LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建为LAPTM4B启动子的活性分析奠定了基础.     

γ射线诱发的白血病小鼠胸腺细胞蛋白质酪氨酸磷酸化水平的变化

目的 :探讨γ射线体外诱发的白血病小鼠胸腺细胞总蛋白质酪氨酸磷酸化水平的变化。方法 :35 3只 BAL B/ c小鼠分为照射组及对照组 ,照射组经 6 0 Coγ射线全身照射后 ,病理证实出现白血病者为癌变组 ,未出现任何肿瘤者为未癌变组 ;对照组为正常 BAL B/ c小鼠 ,未经γ射线照射 ,与照射组同步喂养。分离胸腺细胞 ,应用免疫沉淀法及 Western印迹分析检测蛋白质酪氨酸磷酸化水平。 结果 :癌变组胸腺细胞中蛋白质酪氨酸磷酸化水平总体上明显高于对照组及未癌变组 ,尤以相对分子质量 (4 7.5～ 83)× 10 3及 32 .5× 10 3附近蛋白变化最为明显 ;相对分子质量为 35× 10 3的蛋白在癌变组中酪氨酸磷酸化明显 ,而在对照组及未癌变组中未检测到磷酸化的发生。 结论 :γ射线诱发的白血病小鼠胸腺细胞中一些蛋白分子的酪氨酸磷酸化可能与辐射致癌的发生有关     

肝癌中高表达的新基因LAPTM4B对细胞增殖及成瘤性的影响

目的：研究在肝细胞癌中高表达的新基因LAPTM4B对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响，探讨LAPTM4B基因的生物学功能。方法：构建真核表达质粒pcDNA3-TM4B，利用脂质体稳定转染LAPTM4B cDNA至NIH3T3细胞中，用RT～PCR、Northem和Western杂交法筛选和鉴定转染后LAPTM4B基因高表达的单克隆细胞株，研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果：与转染空载体的对照组相比，转染了LAPTM4B cDNA的NIH3T3细胞表面发生明显变化，微绒毛的数量和长度增加，多分枝且缠绕成团。转染细胞在纤黏连蛋白、人工基膜和层黏连蛋白基质上的黏附／铺展能力增强。生长曲线显示转染细胞的生长速率增高。流式细胞仪检测显示转染细胞的S期细胞数比未转染细胞显著增多，而G0-G1期细胞数减少。Western杂交显示Cyclin E蛋白在转染细胞中的表达显著增加。转染细胞对血清的依赖性下降并具有成瘤性。结论：LAPTM4B基因能影响细胞增殖的调节，促进NIH3T3细胞的增殖，并使NIH3T3细胞具有成瘤性，在肿瘤发生过程中具有重要的作用。     

丙型肝炎病毒H株包膜蛋白在昆虫细胞中的表达及意义

目的　获得丙型肝炎病毒 (HCV) H株包膜糖蛋白的重组杆状病毒 ,在昆虫细胞中稳定表达包膜糖蛋白 E1和 E2 ,并初步应用于丙型肝炎患者血清抗体的检测。方法　用 PCR方法自 HCV H株扩增出包膜蛋白 E基因 ,构建重组杆状病毒 ,并在昆虫细胞中稳定表达包膜糖蛋白 E1和 E2。免疫荧光及 Western blot方法鉴定表达产物。用表达的 E1和 E2蛋白与 35例丙型肝炎患者血清反应。结果　昆虫细胞中表达的 E蛋白呈现 3种分子大小 ,E1的相对分子量为 2 1× 10 3和 33× 10 3 ,E2的相对分子量为 6 0× 10 3。在 35份感染者血清中 ,有 4例 E1抗体阳性 ,其中 1例检出 E2抗体。在 9例 PCR检测 HCV RNA阳性而抗 HCV检测阴性的血清中 ,有 3例血清与表达的 E蛋白反应。结论　 HCV E蛋白基因可在昆虫细胞中稳定表达 ,表达的 E1和 E2蛋白可用于 HCV患者的血清学诊断     

HULC RNA在肝癌细胞中的表达及其对邻近基因SLC35B3表达的影响

目的 探讨长片段非编码RNA--肝癌高表达基因(HULC)RNA在不同的肿瘤细胞系中的表达情况以及对其邻近基因表达的影响.方法 应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法 在不同来源的肿瘤细胞系中检测HULC RNA的表达情况,并通过生物信息学的方法 寻找与其邻近的基因,再通过实时PCR技术检测HULC对邻近基因的表达情况的影响.结果 在检测的8株细胞系:人胚肾细胞系293T,食管癌细胞系EC9706、KYSE150,结肠癌细胞系HCT116,肝癌细胞系SMMC7721、HepG2以及肺癌细胞系H446、H1229中,非编码RNA HULC在HepG2细胞中的表达量特异性升高.HULC基因的附近(＜1000 bp)没有编码基因存在,与其距离最近的基因是SLC35B3,且间距在约200 000 bp.与HULC RNA表达量较低的SMMC-7721细胞相比,内源性高表达HULC RNA的HepG2细胞中SLC35B3的转录更高[(0.477±0.040)%比(0.129±0.004)%,P＜0.01].在SMMC7721细胞中转染pcDNA3.1-HULC质粒后,其邻近基因SLC35B3表达略微升高.而通过RNA干扰的方法 敲降HULC RNA后,SLC35B3基因的表达也随之下降.HepG2细胞转染2条小干扰RNA(siRNA)后,SLC35B3基因的表达分别为[(0.283±0.007)%和(0.387±0.015)%],并且第1条siRNA转染后与阴性对照[(0.477±0.042)%]比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 肝癌细胞HepG2中特异性高表达的非编码RNA HULC对其邻近基因SLC35B3的表达有一定影响作用.     

氧化砷诱导人肝癌细胞凋亡相关基因的实验研究

目的：探讨氧化砷（As2O3)对人肝癌细胞诱导凋亡作用的分子机制。方法：以As2O3作用于体外培养的人肝癌细胞株HepG2，通过免疫组化技术对bcl-2,bax,p53,Fas及c-myc五种基因编码蛋白的表达进行检测。结果：经As2O3作用的人肝癌细胞bcl-2基因编码蛋白表达减少，bax,Fas基因编码蛋白表达增加，p53,c-myc基因编码蛋白表达改变不明显，结论：As2O3诱导肝癌细胞凋亡分子机制可能是下调bcl-2基因编码蛋白表达，增强box,Fax基因编码蛋白表达。     

丙型肝炎病毒NS5B在Hep3B细胞的表达及活性分析

目的丙型肝炎病毒NS5B基因转染人肝癌细胞系Hep3B细胞,检测NS5B的表达与细胞内RNA聚合酶活性。方法使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒NS5B基因的重组载体pcDNA-5B转染到Hep3B细胞。RT-PCR和Wes-tern blot鉴定NS5B基因的表达,荧光素酶检测NS5B的细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结果RT-PCR和Westernblot发现转染NS5B基因的Hep3B细胞产生NS5B mRNA和NS5B蛋白,荧光素酶分析表明Hep3B细胞表达的NS5B蛋白具有细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结论人肝癌细胞系Hep3B细胞可以成功表达NS5B基因,且表达的NS5B蛋白具备细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。     

LAPTM4B⁃35蛋白在涎腺腺样囊性癌中的表达及临床意义

目的：检测溶酶体相关4次跨膜蛋白B（lysosome?associated protein transmembrane?4 beta,LAPTM4B）?35蛋白在正常涎腺及涎腺腺样囊性癌中的表达水平,探讨其与肿瘤患者临床病理特征的相关性。方法：收集95例涎腺腺样囊性癌和20例正常涎腺组织,以及相关临床病理资料,应用免疫组织化学法检测LAPTM4B?35在正常涎腺组织、涎腺腺样囊性癌的表达水平,卡方检验或Fisher精确检验及多因素Logistic回归分析探讨LAPTM4B?35表达水平与涎腺腺样囊性癌临床病理特征的关系。结果：LAPTM4B?35蛋白在正常涎腺组织不同细胞中呈差异性表达：在腺泡细胞中表达为阴性,在导管和闰管细胞中表达很弱,在纹状管细胞中表达中等。在涎腺腺样囊性癌组织中,48.00%的高级别涎腺腺样囊性癌LAPTM4B?35表达增高,显著高于低级别涎腺腺样囊性癌。此外,LAPTM4B?35高表达与临床分期晚亦呈显著相关。结论：LAPTM4B?35蛋白在正常涎腺组织细胞中呈差异性表达,与涎腺腺样囊性癌的组织学分级和临床分期显著相关。     

Hepsin蛋白对肝癌细胞生长的影响

目的:探讨Hepsin蛋白对肝癌细胞生长和细胞凋亡的影响。方法:运用RT-PCR技术检测肝癌组织样品肝癌细胞系中Hepsin基因的表达水平,并从原发性肝癌患者的癌组织中扩增Hepsin基因编码区序列,该序列被克隆并构建pCMV-tag-HS表达质粒。将pCMV-tag-HS表达质粒转染人肝癌细胞系HepG2细胞、Bel-7402细胞,观察Hepsin蛋白对肝癌细胞的增殖能力和细胞凋亡效应的影响。结果:Hepsin基因在临床肝癌组织和人正常肝细胞L-02细胞中高表达,在人肝癌细胞系Bel-7402细胞、HepG2细胞和临床肝癌癌旁组织不表达或低表达,Hepsin蛋白可以增强肝癌细胞系的增殖能力,同时抑制肝癌细胞凋亡。结论:Hepsin蛋白促进肝癌细胞生长并抑制肝癌细胞凋亡。     

p27kip1过表达对肝细胞癌细胞株细胞周期的影响

目的探讨肿瘤抑制基因p27^kip1编码的P27蛋白过表达与HCC细胞株细胞周期的关系。方法本研究从野生型p27^kip1基因真核表达质粒pEYFP-P27（WT）出发,采用定点诱变技术构建了突变型p27^kip1基因表达载体pEYFP-P27（S10A）、pEYFP-P27（T157A）和pEYFP-P27（T187A）,然后用脂质体法将上述质粒转染HCC细胞株HepG2和Hep3B,Western Blotting检测内源和转入的P27蛋白表达,流式细胞仪检测P27蛋白过表达对HCC细胞株细胞周期的影响。结果野生型和3种突变型的P27融合蛋白在HepG2和Hep3B中的过表达都能增强G0／G1期阻抑;同时,对HepG2细胞,核定位位点突变体P27（T157A）比野生型P27蛋白及其他两个突变体具有更强的细胞周期阻抑活性,而对Hep3B细胞,3个突变体和野生型p27蛋白对细胞周期的影响无明显差异。结论P27蛋白过表达能够显著增强HCC细胞株的G0／G1期阻抑。     

LAPTM4B在子宫内膜癌组织中表达及临床意义

目的 探讨LAPTM4B在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义。方法 选取2011年3月至2013年3月鄂东医疗集团黄石市妇幼保健院行手术治疗的子宫内膜癌患者76例, 同期, 选取正常子宫内膜组织40例作为对照组, 免疫组化法检测子宫内膜癌和对照组组织中LAPTM4B蛋白表达, 所有患者均进行随访, 随访截止日期2018年3月31日, 随访过程中失访4例, 随访率93.42%, 生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank检验, 影响患者预后的多因素分析采用Cox比例风险回归模型。结果 子宫内膜癌组织中LAPTM4B蛋白阳性表达率为73.68%, 高于对照组的27.50%, 差异有统计学意义 (χ2=22.911, P <0.001) ;LAPTM4B蛋白表达在不同FIGO分期、不同分化程度和是否淋巴结转移差异有统计学意义 (P <0.05) ;Kaplan-Meier生存分析结果显示, 阳性表达组平均生存时间 (42.76±4.16) 个月, 生存率33.96%, 阴性表达组则分别为 (71.53±4.78) 个月和78.95%, Log-Rank检验差异有统计学意义 (χ2=10.458, P=0.001) ;Cox比例风险回归结果显示, 分化程度、淋巴结转移和LAPTM4B蛋白表达是影响患者预后的因素 (HR=0.436、5.993和3.052, P <0.05) 。结论 子宫内膜癌组织中LAPTM4B蛋白表达升高, 且与肿瘤恶性进展有关及预后有关, 是影响患者预后的危险因素。     

p16/Rb蛋白表达及核因子-κB活性在肝细胞肝癌中的意义

目的　探讨 p16和Rb蛋白 (pRb)以及核因子 κB(NF κB)活性在肝细胞肝癌 (HCC)发生中的相互关系及作用。方法　以Western印迹检测 35例HCC及癌旁组织 (距肿瘤至少 3cm)中p16蛋白和 pRb表达 ;以凝胶电泳迁移实验 (EMSA)和竞争实验检测组织中NF κB转录活性。 结果HCC及癌旁组织 p16蛋白表达率分别为 37% (13/ 35 )和 4 8% (17/ 35 ) ;pRb表达率分别为 34%(12 / 35 )和 74 % (2 6 / 35 ) ,两组间差异有显著性 (P <0 0 1) ;NF κB有结合活性者分别为 77% (2 7/ 35 )和 86 % (30 / 35 )。p16蛋白和pRb均表达的HCC中NF κB有转录活性者占 4 0 % (4/ 10 ) ,两者均无表达的HCC中NF κB有转录活性者占 90 % (18/ 2 0 ) ,两组间差异有显著性 (P <0 0 1) ;p16和 pRb均表达的癌旁组织中核因子 κB有转录活性者占 76 % (13/ 17) ,两者均无表达的癌旁组织中NF κB有转录活性者占 89% (8/ 9) ,差异无显著意义 (P >0 0 5 )。结论　p16功能缺失在HCC发生过程中是早期事件 ,Rb功能缺失出现较晚 ;p16蛋白和Rb蛋白表达呈正相关关系 ;p16或Rb蛋白表达缺失 ,除影响细胞周期 ,还通过影响NF κB活性而抑制肝细胞凋亡 ,在HCC发生发展中发挥重要作用。     

肝细胞肝癌(HCC)中PDGF-A的表达及其临床意义

 目的    阐明血小板源性生长因子A(platelet-derived growth factor A,PDGF-A)在人肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达情况及临床意义。方法  在手术切除的50例HCC组织中,应用定量RT-PCR的方法检测PDGF-A mRNA水平,并分析其与临床病理分期之间的关系。采用Western blot检测正常肝细胞株L02和7株肝癌细胞株中PDGF-A蛋白质水平。运用免疫组化方法在43例HCC石蜡组织中检测PDGF-A蛋白质水平。再利用免疫荧光双染色方法检测HCC组织中间质区域炎症细胞中PDGF-A与炎症细胞标志物(CD4、CD8、CD19和CD68)共表达情况。结果    与相应癌旁肝组织相比,HCC癌组织PDGF-A mRNA水平升高,约50%(24/50例)癌组织PDGF-A mRNA水平是癌旁肝组织的2倍及以上,这种差异在BCLC 0期和C期的HCC病例中更为显著。PDGF-A蛋白质见于L02、SMMC-7721、HCCLM3和MHCC97-H细胞株,而HepG2、Hep3B、Huh7和BEL-7402细胞株未检测到该蛋白质。近60%的HCC病例中,肝癌细胞表达PDGF-A,阳性染色有两种分布方式:弥漫于胞质内及在细胞质/细胞膜局部聚集。PDGF-A也大量分布于肿瘤间质区域和紧邻癌组织间质区域的炎症细胞(CD4+、CD8+、CD19+和CD68+)中。结论    HCC癌组织PDGF-A基因表达高于癌旁肝组织,在早期和进展期(BCLC 0和C期)病例更为明显;PDGF-A蛋白表达于HCC癌细胞和间质炎症细胞。     

亚砷酸钠抑制肝癌细胞增殖与PML蛋白表达

目的：研究亚砷酸钠抑制肝癌（HCC）细胞增殖是否与早幼粒细胞白血病（PML）蛋白表达有关。方法免疫组织化学法、免疫荧光、蛋白免疫印迹法（Western blot）和荧光定量PCR检测HCC组织PML蛋白及基因表达。结果免疫组织化学分析显示随机选择15例高分化、中度分化和低分化HCC组织和细胞均不同程度表达PML蛋白。Western blot 分析发现24例HCC组织、HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC‐7721和 L02细胞均表达 PML 蛋白。免疫荧光提示 HuH7、HepG2、Hep3B、SMMC‐7721细胞核均有PML蛋白颗粒,其中 HuH7和 Hep3B细胞表达PML蛋白较 HepG2、SMMC‐7721细胞多。24例 HCC组织, Hep3B、HepG2、SMCC‐7721和HuH7细胞都表达PML基因。亚砷酸钠不仅可下调HuH7和原代 HCC细胞表达PML蛋白,而且亚砷酸钠抑制HuH7,HepG2,Hep3B和SMMC‐7721细胞生长,随着暴露时间延长亚砷酸钠对HCC细胞抑制作用增强。结论HCC 组织和细胞系普遍表达PML 基因和蛋白,PML 蛋白可能是砷剂直接靶向作用的分子基础。     

肾母细胞瘤过表达基因促进肝癌细胞的侵袭与转移

目的:探讨肾母细胞瘤过表达基因(NOV CCN3)在肝癌中的表达及在肝癌侵袭中的作用?方法:荧光定量PCR(real-time PCR)检测肝癌及癌旁组织中的CCN3的mRNA表达水平,同时检测肝癌细胞系及正常人肝细胞中CCN3的mRNA表达水平,Western blot检测肝癌及癌旁组织中CCN3蛋白的表达量;通过肝癌细胞过表达CCN3分析CCN3蛋白对肝癌细胞转移的作用;运用Transwell侵袭实验和划痕迁移实验研究CCN3过表达对肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响?结果:50对样本中有39对CCN3的mRNA表达水平在肝癌组织中高于癌旁组织,Western blot提示肝癌组织中CCN3蛋白表达量高于癌旁组织?体外肝癌细胞的功能试验中,过表达CCN3能促进MHCC-97H?SMMC-7721细胞的侵袭与转移?结论:CCN3在肝癌组织中高表达,过表达CCN3能促进肝癌的侵袭与转移,CCN3发挥作用机制的研究能为肝细胞肝癌的治疗提供新的思路?     

Sonic Hedgehog信号通路分子Shh和Smo在肝细胞肝癌中表达与意义

目的:探讨Sonic Hedgehog(SHH)信号通路分子Shh和Smo在肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及其意义?方法:用RT-PCR方法检测10例HCC组织及相应癌旁组织和肝癌细胞系HepG2?Huh7中Shh?Smo mRNA的表达?采用免疫组化方法检测30例肝癌组织及10例正常肝组织中Shh?Smo蛋白的表达?结果:RT-PCR结果显示HCC组织中Shh?Smo mRNA的表达率显著高于癌旁组织(P < 0.05);Shh?Smo mRNA在Huh7中的表达强度高于HepG2,但两者间无显著性差异(P > 0.05)?免疫组化结果显示Shh?Smo蛋白在HCC组织中阳性率分别为63.3%(19/30)?76.7%(23/30);Smo蛋白的表达与肿瘤大小相关(P < 0.05)?Shh?Smo蛋白在正常肝组织中均无表达?结论:Shh和Smo在肝癌中高表达,表明SHH信号通路可能参与肝癌的发生,为肝癌防治提供新的依据?