右归丸含药血清诱导骨髓基质干细胞分化的最佳浓度探索

目的:探讨右归丸含药血清体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的最佳浓度。方法:用DMEM/F-12培养液培养Wistar大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs),采用不同浓度右归丸含药血清对其进行体外诱导,并用MTT法检测各组细胞生长情况,用免疫细胞荧光方法计算各组神经元样细胞阳性数加以比较。结果:BMSCs在2.5%含药血清培养液中活力最好。结论:2.5%右归丸含药血清培养液是诱导BMSCs分化实验的最佳浓度。     

黄芩甙诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的　黄芩甙体外定向诱导SD大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。方法　通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞 ,体外扩增培养。中药黄芩甙定向诱导分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态 ,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志物神经元烯醇酶 (NSE)、巢蛋白 (Nestin)、胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。结果　大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。黄芩甙诱导 5h后大部分骨髓间充质干细胞转变为神经元样细胞 ,出现胞体和突起 ,免疫细胞化学染色NSE及Nestin呈阳性 ,GFAP阴性。结论黄芩甙可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

天麻诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的：探讨天麻对体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的影响：方法：通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养。中药天麻定向诱导分化为类神经元样细胞光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志物神经原烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)。结果：大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。天麻诱导2h后大部分可分化为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论：大鼠MSC可诱导分化为神经元样细胞。     

地黄多糖对大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞诱导分化作用的研究

目的:探讨地黄多糖体外对大鼠骨髓间充质干细胞( BMSCs)分化为神经样细胞的诱导作用.方法:以大鼠BMSCs为研究对象,采用流式细胞仪检测BMSCs表面标志,MTT法检测细胞生长曲线,当第3代细胞爬片达到80％以上汇合时,分为对照组、化学方法诱导组(5 mmol·L -1,β-mercap toethanol)、脑源性神经生长因子(10 μg·L-1,BDNF)组和地黄多糖组(200 mg·L-1)进行诱导,6h后应用免疫细胞化学染色法检测各实验组神经元巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,RT-PCR检测nestin,NSE,βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)和GFAP mRNA的表达情况.结果:经分离鉴定培养5代以内大鼠BMSCs增殖旺盛、具有较好的细胞活力;免疫细胞化学染色和RT-PCR检测结果显示,对照组不表达神经细胞标志物,各诱导组诱导后有特异性神经细胞标志物表达.其中地黄多糖组Nestin,NSE阳性细胞率分别为( 56.74±1.36)％,(73.37±1.27)％,高于化学诱导组(28.21±2.43)％,(2.31±2.72)％和神经生长因子组(31.3±1.61)％,(28.87±1.65)％,(P＜0.05);GFAP阳性细胞率(20.17±1.27)％低于化学诱导组和神经生长因子组,差异具有统计学意义(P＜0.05);化学诱导组Nestin,NSE和GFAP阳性细胞率与生长因子组比较,差异无统计学意义.结论:地黄多糖具有诱导BMSCs向神经样细胞分化的作用,主要向神经元样细胞方向诱导.     

电针血清与丹参注射液对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的：研究电针血清与丹参注射液对骨髓间充质干细胞分化的影响。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养，MSCs用含10％健康大鼠电针血清、10％脑梗塞大鼠血清、10％脑梗塞大鼠电针血清和含10％丹参注射液的L-DMEM诱导MSCs，光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可以通过贴壁法成功分离，并可在体外大量扩增，健康大鼠电针血清、脑梗塞大鼠血清、脑梗塞大鼠电针血清诱导48小时之后未见神经元样细胞出现，免疫细胞化学染色NSE、Nestin阴性。丹参诱导4小时后，大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin染色呈阳性。结论：健康大鼠电针血清、脑梗塞大鼠血清、脑梗塞大鼠电针血清不能诱导MSCs体外分化；丹参注射液可以在体外诱导MSCs分化为神经元样细胞。     

川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞长期诱导效应的研究

目的 探讨川芎嗪提取液体对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的长期诱导效应.方法 分离培养大鼠骨髓MSCs,用1.50g/L川芎嗪提取液对MSCs进行诱导,倒置显微镜下观察诱导培养不同时间后细胞的形态变化,并应用免疫细胞化学方法鉴定诱导培养后细胞浆内Nestin和NSE蛋白表达.结果 川芎嗪诱导培养8h后即可见细胞形态发生变化,24 h后表现为典型的神经元细胞形态,Nestin和NSE神经细胞特异性标志物呈阳性表达,3d后诱导效果最好,6d后,有些细胞突起变长,出现分叉,并且有些细胞出现衰老死亡.结论 川芎嗪早期诱导BMSCs向神经元样细胞分化的效果较好,长期诱导的特异性不明显.但可促进细胞突起的生长,并且促进神经细胞的成熟和死亡.     

左归丸对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的影响

目的观察左归丸药物血清对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经样细胞分化的影响。方法采用全骨髓贴壁培养法原代培养、传代培养BMSCs;观察细胞形态,采用免疫细胞化学染色及流式细胞术检测细胞表面CD90、CD29、CD34和CD45表达以鉴定BMSCs;分别使用β-巯基乙醇及左归丸药物血清诱导BMSCs向神经样细胞分化,采用Western blot法检测诱导后神经标志蛋白(Nestin、NSE、GFAP)表达。结果培养至第3代的骨髓间充质干细胞,CD90、CD29表达阳性,CD34和CD45表达阴性;分别经β-巯基乙醇、左归丸药物血清诱导后,BMSCs可见典型的神经元样改变,神经标志蛋白(Nestin、NSE、GFAP)表达均显著增高(P0.05)。结论左归丸药物血清可以诱导大鼠BMSCs分化,且分化细胞具备神经细胞的形态及特征,该研究为临床治疗提供了新思路、新方法;但是诱导过程中的作用机制还不清楚,有待进一步的研究。     

阿魏酸钠诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的初步研究

目的 探讨阿魏酸钠诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可能作用。方法 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，采用阿魏酸钠对其进行诱导培养，倒置显微镜下观察诱导培养不同时间后细胞的形态变化，并应用免疫细胞化学方法鉴定诱导培养后细胞表面神经细胞特异性标志物神经丝蛋白(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果 阿魏酸钠诱导培养6h后即可见细胞形态发生明显变化，24h后表现为典型的神经细胞样形态，NF和NSE神经细胞特异性标志物呈阳性表达。结论 初步证实阿魏酸钠具有诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。     

大鼠脑组织匀浆对其BMSCs向神经元样细胞分化的影响

目的探讨大鼠脑组织匀浆上清对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向神经元样细胞分化的影响。方法全骨髓培养法从Wistar大鼠中分离培养BMSCs,流式细胞仪鉴定,预诱导24h后,分为4组。空白对照组（A组）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）20 ng/mL组（B组）、bFGF20 ng/mL＋正常脑匀浆上清100μL/mL组（C组）、bFGF 20 ng/mL＋损伤脑匀浆上清100μL/mL组（D组）,诱导48 h至细胞分化。免疫细胞化学染色分别检测各组诱导分化后神经特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白-2（MAP-2）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果第4代BMSCs CD29、CD44和CD34的表达率为99.8%、99.7%和2.2%;诱导后的细胞均具有神经细胞形态特征。免疫组化染色结果：NSE在诱导各组（B组、C组、D组）的表达率为44.50%、63.10%和73.30%,MAP-2的表达率为45.70%、65.30%和75.60%,各组均不表达GFAP。结论大鼠脑组织匀浆上清能提高BMSCs向神经细胞方向分化的阳性率,损伤脑匀浆的作用更强。     

益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的探讨益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用.方法采用密度梯度离心法分离获取SD大鼠骨髓单个核细胞层,将细胞经过传代培养使细胞得到扩增和纯化,用流式细胞仪鉴别.用益气活血方联合二甲亚砜(DMSO)、丁羟茴醚(BHA)和β-巯基乙醇(BME)等对碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导的MSCs诱导向神经细胞定向分化.用免疫细胞化学方法检测诱导1 h、3 h后巢蛋白(nestin)的表达,诱导5 h后神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,鉴定分化细胞的类型,并计数MSCs分化的各种细胞的阳性率.结果益气活血方体外诱导MSCs 1h、3 h后分化为nestin免疫细胞阳性率为45.5%±3.4%和38.3%±1.8%,诱导5 h后NSE和GFAP免疫细胞阳性率为82.3%±2.4%、12.1%±1.6%,与对照组相比有极显著性差异(P＜0.01).结论成年大鼠骨髓MSCs可以在体外培养扩增,益气活血方有体外定向诱导骨髓问充质干细胞向神经细胞分化的作用.     

三七总皂苷在骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞中的调解作用研究

目的:探讨三七总皂苷在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞中的调解作用。方法:①实验材料:成年健康Wister大鼠(雌雄不限),SRF级,体质量(150±30)g;②实验方法:无菌的条件下从大鼠的股骨中分离并继代培养MSCs细胞,当传至第5代时,先用完全培养液[含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]进行预诱导,再更换无血清培养液(含三七总皂苷0.25g/L)进行诱导,采用免疫组织化学SABC法检测神经丝蛋白(NF-M)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白43(GAP-43)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:①采用三七总皂苷诱导后,大多数MSCs呈神经元样细胞分化。经免疫组织化学鉴定,上述细胞表现为NSE、MAP-2和NF染色阳性,呈棕黄色,而GFAP染色阴性。②采用三七总皂苷进行诱导时,MSCs的胞体逐渐增大,并伸出细长的突起,在突起的末端出现分支,有些相邻细胞的突起还成网状连接。③三七总皂苷诱导MSCs转变为类似于神经元样的形态,经免疫组织化学鉴定,大多数细胞表现为NF-M、NSE、nestin、MAP-2和GAP-43染色阳性,并在胞质和突起中有棕黄色的物质,而GFAP染色均为阴性。SABC法显示NSE和MAP-2阳性细胞数分别为(72.64±2.04)%和(73.5±2.17)%。结论:三七总皂苷在体外能使MSCs向神经元样细胞转化,且具有神经元样细胞的特性,这为MSCs治疗相关疾病提供了理论基础。     

复方扶芳藤合剂含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞Notch信号通路的影响

目的:观察复方扶芳藤合剂含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs) Notch信号通路的影响.方法:采用全骨髓贴壁法分离纯化培养大鼠骨髓间充质干细胞;制备复方扶芳藤合剂含药血清,将30只SD大鼠随机分为2组,每组随机15只,分别为ig复方扶芳藤合剂2 g·kg-1 ·d-1 ig的药物干预组和生理盐水2 mL·kg-1·d-1ig的阴性对照组.取10％的含药血清及阴性对照组血清分别干预大鼠BMSCs,采用RT-PCR方法检测Notch1,Jagged1,Hes1 mRNA表达变化;采用免疫细胞化学法检测Notch1,Jagged1表达变化.结果:RT-PCR显示药物干预组Notch1,Jagged1,Hes1的mRNA表达水平均高于阴性对照组(P＜0.05),免疫细胞化学显示药物干预组Notch1,Jagged1蛋白表达均高于阴性对照组(P＜0.05),差异有统计学意义.结论:复方扶芳藤合剂含药血清可以引起大鼠BMSCs Notch信号通路上的关键基因和蛋白表达上调,激活Notch信号通路.     

加味丹参饮含药血清诱导BMSCs移植IRI大鼠对心肌bFGF的影响

目的:观察加味丹参饮(JWDSY)含药血清诱导的骨髓间充质干细胞(BMSCs),移植于心肌缺血再灌注损伤(IRI)大鼠梗死心肌边缘后,对心肌细胞碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)蛋白表达的影响.方法:全骨髓贴壁法培养BMSCs,流式细胞术鉴定细胞表面抗原CD90,CD34,CD45.传至P3代时,用JWDSY含药血清诱导3d.建立大鼠心肌IRI造模,在心肌梗死区边缘移植血清诱导的细胞悬液.3,7,14 d后,取心肌组织用免疫组化法检测心肌细胞bFGF表达.结果:JWDSY血清组bFGF的积分吸光度(IA)在3,7,14d后分别升高至5 758.18±465.17,6 589.61±432.89,8 015.62±366.34;与模型组差异有统计学意义(P＜0.05),且随时间逐渐升高,比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:JWDSY血清诱导的BMSCs移植于IRI大鼠心梗区边缘后,可以改善心肌组织的病理学形态,增加心肌细胞bFGF蛋白表达,提示JWDSY含药血清诱导的BMSCs对IRI大鼠的心肌细胞有一定的保护作用.     

骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化中褪黑素受体和多效蛋白的表达

目的体外诱导成人骨髓间充质干细胞（MSCs）向神经元样细胞分化，并探讨分化过程中多效蛋白（PTN）和褪黑素（Mel）受体亚型MT1、MT2 mRNA的表达，以探索MSCs向神经元样细胞分化的特性和机制。方法密度梯度离心加贴壁培养法分离成人MSCs，原代和传代培养。取第6代MSCs设对照和实验组进行诱导，诱导后30min至3d，观察细胞形态并计数。免疫细胞化学法和RT—PCR法测定分化后细胞神经细胞特异性表面标志神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白-2（MAP-2）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和诱导前、诱导后12hPTN和MT1、MT2 mRNA的表达。结果接种24h后MSCs开始贴壁，呈圆形或椭圆形。3d后可见梭状细胞呈集落状生长，10d～14d融合。第5代～第6代时呈现较均一的成纤维细胞样形态。诱导后胞体向胞核收缩；出现双极及多极细胞。12h变形细胞增多，细长突起相互连接。24h后变形细胞增多不明显。诱导后12h大部分细胞表达NSE、MAP-2，未检测到GFAP的表达。实验组诱导后12h细胞有PTN和MT1 mRNA的表达。结论PTN和Me1信号传导可能参与调控了MSCs向神经元样细胞的分化。     

富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞对兔股骨头坏死的影响

目的:研究富血小板血浆(PRP)联合骨髓间充质干细胞(BMSCs)对兔股骨头坏死的治疗效果.方法:随机将50只新西兰兔随机分为空白对照组、模型组、PRP(3％)组、BMSCs(1×106/mL)组、PRP与BMSCs联合组.无菌环境下,建立兔股骨头坏死模型,术后4周PRP组1次性注射植入RPR 12 mg,BMSCs组单纯1次性注射植入BMSCs 1 mL,PRP与BMSCs联合组股骨头内髓芯减压后1次性注射植入BMSCs 1 mL与PRP12 mg复合物,空白对照组与模型组不植入任何物质作为对照.造模后第12周,取材.采用HE染色,光镜下观察骨髓腔内骨小梁结构和骨细胞、脂肪细胞的变化情况;蛋白质印迹法(Western blot法)检测损伤的兔股骨髓中血小板衍生因子(PDGF)蛋白的表达水平.结果:与空白对照组比较,模型组骨髓腔内骨小梁变细或坏死,骨细胞减少,骨头疏松,脂肪细胞增多.骨陷窝空缺率高(P＜0.05).与模型组比较,各治疗组骨髓腔内骨小梁变粗,排列整齐,骨细胞增多,脂肪细胞减少.骨陷窝空缺率降低,差异有显著性意义(P＜0.05).PRP组、BMSCs 组、PRP与BMSCs联合组骨髓组织PDGF蛋白表达水平与模型组相比均有明显的提高,其中PRP与BMSCs联合组PDGF蛋白表达水平最高(P＜0.05).结论:PRP,BMSCs在一定程度上可使骨细胞增殖,减少骨陷窝空缺率,抑制骨髓腔内脂肪细胞,增加损伤股骨头中骨髓组织PDGF蛋白表达,促进股骨头再生.     

富血小板血浆联合骨髓间充质干细胞不同 配比浓度对兔软骨缺损的影响

目的: 研究富血小板血浆(PRP)与骨髓间充质干细胞(BMSCs)不同的配比浓度对兔软骨缺损的治疗效果。方法: 随机将60只新西兰兔随机分为模型对照组、PRP组(3%)、BMSCs组(1×10⁶/mL)、不同配比浓度的PRP+BMSCs联合组(1:5,2:5,3:5)。建立兔软骨损伤模型,术后第2周靶侧肌肉注射不同配比浓度的PRP与BMSCs,每周1次,连续给药4周。采用Masson's三色染色法,观察关节软骨缺损情况;采用Pineada法进行关节软骨组织学半定量计分,并通过观察患兔术膝切口,了解术后愈合情况。结果: 与模型对照组比较,不同配比浓度的PRP与BMSCs联合组中的关节软骨半定量分值均减少(P<0.05)。不同配比浓度的PRP与BMSCs联合组中,关节软骨半定量分值随PRP浓度的增加而减少,关节软骨半定量分值与PRP值呈现线性关系,其中PRP与BMSCs配比浓度为3:5的效果最为明显,差异有显著性意义(P<0.05)。结论: PRP,BMSCs在一定程度上可促进骨组织恢复;关节软骨缺损恢复程度与PRP浓度表现出一定的量效关系。     

疏血通脉胶囊含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的:探讨疏血通脉胶囊含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)凋亡的影响以及作用机制。方法:体外培养大鼠BMSCs,以不同浓度双氧水(H2O2)诱导BMSCs凋亡,取最适宜浓度1.0 mmol·L~(-1)用于实验。疏血通脉胶囊低、中、高剂量(含生药1.81,3.62,7.24 g·kg~(-1))灌胃给药制备大鼠含药血清。选择第3代BMSCs,随机分正常组(不做处理,加入体积分数为15%正常大鼠血清培养液),模型组(H2O2诱导细胞凋亡,加入体积分数为15%正常大鼠血清培养液)和疏血通脉胶囊低、中、高剂量含药血清组(H2O2诱导细胞凋亡,分别加入对应剂量、体积分数为15%的疏血通脉胶囊含药血清培养液),共5组,作用24 h后噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞相对存活率,Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)mRNA的表达。结果:H2O2能体外模拟缺血缺氧环境诱导BMSCs凋亡。MTT结果显示疏血通脉胶囊低、中、高剂量含药血清组细胞存活率较模型组有明显提高(P0.01),且存活率随剂量增加而增高(P0.05);Annexin V-FITC/PI流式细胞术结果显示疏血通脉胶囊含药血清可以降低H2O2诱导的BMSCs凋亡率(P0.01)。Real-time PCR结果显示H2O2诱导可以增加BMSCs的Caspase-3 mRNA表达,降低Bcl-2 mRNA表达。疏血通脉胶囊含药血清处理下调了Caspase-3 mRNA的表达(P0.01),上调了Bcl-2 mRNA的表达(P0.01)。结论:疏血通脉胶囊含药血清可通过上调Bcl-2基因表达,负性调控Caspase-3基因,从而抑制H2O2导致的BMSCs凋亡。     

股骨头坏死愈胶囊含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞凋亡的保护作用

目的:观察股骨头坏死愈胶囊含药血清对体外大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)凋亡的保护作用。方法:在体外分离、筛选、培养大鼠BMSCs细胞,制备0.36,0.72,1.44 g·kg-1灌胃处理得到的股骨头坏死愈胶囊含药血清作用后,选择第3代大鼠BMSCs,实验分为空白组(加入不含大鼠血清的培养液),正常组(加入体积分数为20%正常大鼠血清培养液),模型组(加入体积分数为20%正常大鼠血清培养液和全反式维甲酸诱导细胞凋亡)和中药血清低、中、高剂量组(培养过程中分别加入对应剂量、体积分数为20%的股骨头坏死愈胶囊含药血清培养液和全反式维甲酸诱导细胞凋亡),共6组,MTT法检测各组细胞相对存活率,流式细胞仪检测各组细胞周期,进行比较。结果:与正常组比较,模型组,中药血清低、中、高剂量组相对存活率下降,细胞周期中G1期比例上升,G2及S期比例下降,差异有显著性意义(P0.01)。与模型组比较,中药血清低、中、高剂量组相对存活率上升,G1期比例减少,G2及S期比例增加,且随着中药剂量增加而差值明显,差异有显著性意义(P0.01)。结论:股骨头坏死愈胶囊含药血清可提高大鼠BMSCs的存活率,对全反式维甲酸所致的细胞凋亡有保护作用。