大鼠骨髓基质干细胞在成骨诱导剂条件下的成骨能力

目的:观察在有成骨诱导剂存在的条件下,大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞转化的能力。方法:实验于2005-07/12在锦州医学院中心实验室完成。选取清洁级2月龄SD大鼠6只,无菌条件下取双侧股骨,制备单细胞悬液。采用贴壁培养与传代结合方法分离纯化大鼠骨髓基质干细胞,将2代细胞置于含有1×10-7mol/L地塞米松、10mol/Lβ-甘油磷酸钠、50mg/L抗坏血酸成骨诱导剂的培养基中,培养21～30d。应用倒置显微镜观察骨髓基质干细胞与诱导后细胞形态,描绘生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并用碱性磷酸酶染色和VON-KOSSA法检测成骨能力。结果:6只大鼠均进入结果分析。①骨髓基质干细胞形态学观察结果:在成骨诱导剂里细胞增殖变缓慢,呈长梭形、成纤维细胞样或不规则形。②细胞生长曲线:1～2d为潜伏期,细胞增殖不明显;3d后细胞增殖明显加快,进入对数生长期;6d后增殖变慢为平台期。经计算细胞群体倍增时间为38h。③细胞增殖周期检测结果:G0/G1期为(82.12±4.60)%,S期为(14.35±2.32)%,G2/M期为(0.87±0.30)%。④成骨能力检测结果:细胞碱性磷酸酶染色阳性率为86%,VON-KOSSA染色提示有钙结节形成。结论:大鼠骨髓基质干细胞在有成骨诱导剂存在的情况下成骨能力较高。     

改良高选择性脊神经后根部分切断术中前后根神经分束的应用解剖(英文)

背景:高选择性脊神经后根部分切断术中前后根的神经分束应达到神经小束水平,分束越多越利于电刺激选择,利于准确地切断阈值低的引起痉挛的Ia类神经纤维,也越可能最大限度地保留后根中的感觉神经纤维。目的:根据限制性和高选择性脊神经后根切断术的要求,对脊神经前后根进行显微解剖,确定神经小束的分束标准和数目,为临床手术提供可靠的依据和新的手术标准。设计:以成人尸体标本为观察对象,单一样本实验。单位:锦州医学院附属第一医院骨科和锦州医学院解剖教研室。对象:实验于1999-12在锦州医学院解剖学实验室进行。以志愿捐献的15具成人尸体标本为观察对象,男11具,女4具,生前均签署志愿捐献书。方法:①在15具(30侧)成人脊柱标本上,对L1～S2节段的脊神经前后根进行形态学观察和显微测量。②取新鲜尸体的L5脊神经前后根进行免疫组化染色,将脊神经后根起始部、中间部和椎间孔外部3个部位切片,分别测定神经纤维总数、引起痉挛的Ia类神经纤维的数目及其占神经纤维总数的百分率,比较3个部位Ia类神经纤维的分布规律和数量。主要观察指标:①脊神经根神经分束情况及神经小束的直径。②脊神经后根起始部、中间部和椎间孔外部计数100μm2神经纤维总数及Ia类神经纤维占神经纤维总数的百分率。结果:①脊髓圆锥部脊神经根是由根丝逐步汇合而成。应用显微外科技术,后根一般可分为10～18小束,前根一般分为6～11小束,其小束的直径是基本一样,数值较为恒定。②脊神经后根起始部、中间部和椎间孔外部计数100μm2总的神经纤维数为(3243±143)根,Ia类神经纤维为(1702±85)根,占总神经纤维数的52.5%。Ia类神经纤维在后根内呈均匀分布,没有集中分布区。结论:改良脊神经后根部分切断术的最大特点即脊神经前后根的分束标准应尽量细,这样有利于准确切断Ia类神经纤维,一般前根达到6～11小束,后根达到10～18小束,切断最大比例应不超过后根神经纤维总数的1/2。     

提高胚胎大鼠神经干细胞数量的实验方法

目的：通过培养了解神经干细胞的生物学特性，着重从胎龄选择、优化分离和换液方法上提高神经干细胞的增殖能力和生长数量。方法：实验于2004-04／2005-09在锦州医学院中心实验室完成。①雌性SD大鼠35只，每日做阴道细胞涂片，排卵期雌雄合笼，以出现精栓计为受孕第0．5天。分别于孕10．5，11．5，12．5，13．5，14．5，16．5，18．5d取出大鼠胚胎体，每时间点各5只。②通过采用机械分离和酶消化分离相结合的方法分离培养不同胎龄大鼠脑神经干细胞。③换液首次采用分瓶法以后采用低速离心半量换液。④采用免疫细胞化学技术分别检测神经干细胞特征性标志巢蛋白表达和用血清诱导分化为大量神经元微管组合蛋白2和神经胶质纤维酸性蛋白表达。结果：①胎龄为12．5d的胎鼠提取的神经干细胞集落最多，其次为13．5d。②在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈巢蛋白阳性的神经球。③用血清诱导分化为大量表达微管组合蛋白2阳性的神经元和胶质纤维酸性蛋白阳性的神经胶质细胞。结论：考虑到生长因子在孕13-15d能够很好地发挥作用，故选择胎龄为13．5d胎鼠作为实验材料较为合适。通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离和原液首次采用分瓶法显著提高了神经干细胞的培养数量，培养出的细胞具有自我更新能力和增殖能力，可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。     

体外分离培养人脐静脉内皮及内皮下间充质干细胞

目的:建立人脐静脉内皮及内皮下间充质干细胞体外培养和扩增的方法,探讨其生物学特性,建立间充质干细胞体外培养扩增体系。方法:实验于2006-04/2006-09在辽宁医学院解剖学实验室完成。解剖细胞培养室为无菌百级培养间。正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带由辽宁医学院附属第一医院提供,产妇及其家属均知情同意,并经医院伦理委员会批准。实验方法:①体外分离和培养贴壁细胞:无菌条件下取正常健康产妇分娩或剖宫产脐带,将其用预热PBS充分洗涤去血渍后,从脐静脉一端插入留置针,用预热PBS冲净静脉腔血后,用止血钳夹闭另一端,注入经预热至37℃的Ⅰ型胶原酶,置于37℃水浴箱中消化,30min后放出胶原酶,并用PBS冲洗血管腔,收集消化液和冲洗液,400r/min离心10min,吸弃上清液,重悬于M199培养基(含体积分数为0.15的胎牛血清,2mmol/L谷氨z酰胺,2μg/L碱性成纤维细胞生长因子,100U/mL青霉素,100U/mL链霉素)。以5×108L-1密度接种于6孔培养板中,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,48h后全量换液,以后每3d全量换液。待细胞80%融合时,0.25%胰酶消化,按1×108L-1传代培养。②间充质干细胞生长曲线的测定:取传代培养细胞,按2×107L-1密度接种于24孔培养板内,每天取3孔,将细胞消化计数,连测8d,绘制间充质干细胞生长曲线。③间充质干细胞表面抗原检测:在24孔塑料培养板内放置无菌的盖玻片,每孔中种植108L-1第2代细胞悬液1mL。采用免疫细胞化学方法进行细胞表面抗原检测。结果:①间充质干细胞的形态学观察:接种的细胞48h后细胞完全贴壁生长,其镜下形态有呈椭圆形、多角形的内皮细胞以及呈梭形的成纤维样细胞,有的形成漩涡状生长的集落。②间充质干细胞生长曲线的分析:传代培养的潜伏期约为24～36h,细胞倍增时间约为30～36h,对数增殖期约为二三天,对数增殖期后第5天进入平台期。③间充质干细胞表面抗原特性:免疫细胞化学分析结果显示,间充质干细胞表面抗原cd166、cd44阳性,而vWF阴性,说明分离获得的细胞具有间充质干细胞的特点。结论:所建立的分离和培养方法可获取人脐静脉黏附细胞中一组独特的细胞群,具有间充质干细胞的生物学特性。     

骨髓基质细胞在骨组织工程中的研究与进展

大面积骨缺损与骨不连等疾病一直是困扰临床骨科的难题,骨组织工程的提出为其治疗提供了一种可行的方法。种子细胞是骨组织工程的核心与基础,一直是人们普遍关注的热点。目前的种子细胞包括成骨细胞,骨细胞,骨膜成骨细胞,骨髓基质细胞等。其中骨髓基质细胞被公认为是一较理想的种子细胞:获取方便,来源较广泛,对供体损伤较小,体外培养技术成熟,细胞增殖较快,而且可以作为一些成骨因子基因转染的靶细胞。骨髓基质细胞、基质支架和/或成骨因子构成的复合材料能够修复骨缺损;特别是将含有成骨因子基因(如骨形态发生蛋白-2基因)的骨髓基质细胞与基质支架复合能够加快骨缺损的修复,这具有重要的临床意义。目前骨髓基质细胞在骨组织工程中应用面临的主要问题是细胞纯化、基因转染后的安全等问题,特别是后者亟待解决。     

改良高选择性脊神经后根部分切断术中前后根神经分束的应用解剖

背景:高选择性脊神经后根部分切断术中前后根的神经分束应达到神经小束水平,分束越多越利于电刺激选择,利于准确地切断阈值低的引起痉挛的Ia类神经纤维,也越可能最大限度地保留后根中的感觉神经纤维.目的:根据限制性和高选择性脊神经后根切断术的要求,对脊神经前后根进行显微解剖,确定神经小束的分束标准和数目,为临床手术提供可靠的依据和新的手术标准.设计:以成人尸体标本为观察对象,单一样本实验.单位:锦州医学院附属第一医院骨科和锦州医学院解剖教研室.对象:实验于1999-12在锦州医学院解剖学实验室进行.以志愿捐献的15具成人尸体标本为观察对象,男11具,女4具,生前均签署志愿捐献书.方法:①在15具(30侧)成人脊柱标本上,对L1～S2节段的脊神经前后根进行形态学观察和显微测量.②取新鲜尸体的L5脊神经前后根进行免疫组化染色,将脊神经后根起始部、中间部和椎间孔外部3个部位切片,分别测定神经纤维总数、引起痉挛的Ia类神经纤维的数目及其占神经纤维总数的百分率,比较3个部位Ia类神经纤维的分布规律和数量.主要观察指标:①脊神经根神经分束情况及神经小束的直径.②脊神经后根起始部、中间部和椎间孔外部计数100 μm2神经纤维总数及Ia类神经纤维占神经纤维总数的百分率.结果:①脊髓圆锥部脊神经根是由根丝逐步汇合而成.应用显微外科技术,后根一般可分为10～18小束,前根一般分为6～11小束,其小束的直径是基本一样,数值较为恒定.②脊神经后根起始部、中间部和椎间孔外部计数100μm2总的神经纤维数为(3 243±143)根,Ia类神经纤维为(1 702±85)根,占总神经纤维数的52.5%.Ia类神经纤维在后根内呈均匀分布,没有集中分布区.结论:改良脊神经后根部分切断术的最大特点即脊神经前后根的分束标准应尽量细,这样有利于准确切断Ia类神经纤维,一般前根达到6～11小束,后根达到10～18小束,切断最大比例应不超过后根神经纤维总数的1/2.     

视黄酸通过降低心转录因子Tbx20的表达抑制早期心的形成

目的:研究过量视黄酸抑制爪蟾早期心形成的机制.方法:用过量视黄酸培养发育到第14期的胚胎.4h后,胚胎用MEMPHA固定进行转录因子Tbx20的胚胎整体原位杂交.取发育第14期胚胎形成心的组织,并分别加入视黄酸和骨形成蛋白进行培养.4h时后,用MEMPHA固定并进行Tbx20的胚胎整体原位杂交.结果:视黄酸降低Tbx2...     

转染hBMP-2基因的骨髓基质细胞与生物活性陶瓷复合材料异位成骨能力观察

目的:观察转染了hBMP-2基因的兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,MSC)与生物活性陶瓷(bioactiveglassceramicsics,BGC)复合后植入兔股部肌袋中生物复合材料的异位成骨能力。方法:实验时间为2003-07/2004-05。实验地点为锦州医学院解剖学骨组织工程研究所。应用脂质体介导的方法将携带hBMP-2基因的重组载体PcDNA3-hBMP2导入体外培养的MSC中,用G418筛选获得阳性细胞,应用ELISA检测hBMP-2基因在MSC内蛋白质水平的存在与表达状况;将携带hBMP-2基因的MSC与BGC复合并植入兔股部肌袋内,术后4周行组织学检察。结果:用ELISA方法从实验组细胞的培养基中可检测到约54ng的hBMP-2蛋白质。携带hBMP-2基因的MSC与BGC具有良好的生物相容性,且具有异位成骨能力。结论:MSC可以作为hBMP-2基因的受体细胞,基因表达可分泌hBMP-2蛋白质,与BGC复合后具有异位成骨能力,认为转染了hBMP-2基因的MSC可作为骨组织工程学中的种子细胞。     

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化：Wnt3a信号分子的诱导作用**★

背景：Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节。已有证据显示此通路参与了对神经前体细胞增殖、分化以及决定细胞命运的调控。目前有关Wnt信号通路对间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用还少见报道。 目的：寻找促进间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子。 方法：采用密度梯度离心法在体外分离培养SD大鼠股骨间充质干细胞并培养。传代后通过形态学和流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44、CD34、CD45,筛选并鉴定培养细胞。采用神经营养因子碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a和Wnt5a诱导方案，通过免疫组化和RT-PCR的方法比较Wnt3a、Wnt5a在间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用，以碱性成纤维细胞生长因子单独培养为对照。 结果与结论：间充质干细胞经培养、传代后，细胞贴壁生长，形态均一，呈长梭形，流式细胞学检测细胞表面标志物CD29、CD44高表达, CD34、CD45低表达。Wnt3a诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性，胶质纤维酸性蛋白无明显表达，诱导后细胞的活力良好；Wnt5a诱导组及对照组巢蛋白呈弱阳性表达，神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性。RT-PCR结果显示，Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达，神经元特异性烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带，10 d后更加明显；胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后有比较弱的扩增条带出现。结果说明Wnt3a分子能够促进体外培养的间充质干细胞向神经元样细胞分化。     

提高局部解剖学实验教学效果的思考

<正>解剖学是一门极其重要的医学基础课。医学中有1/3以上的名词来自解剖学。恩格斯说过:"没有解剖学就没有医学。"由此可见,解剖学得好坏,