天麻诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的：探讨天麻对体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞的影响：方法：通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养。中药天麻定向诱导分化为类神经元样细胞光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志物神经原烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)。结果：大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。天麻诱导2h后大部分可分化为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性,GFAP阴性。结论：大鼠MSC可诱导分化为神经元样细胞。     

电针血清与丹参注射液对骨髓间充质干细胞分化的影响

目的：研究电针血清与丹参注射液对骨髓间充质干细胞分化的影响。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养，MSCs用含10％健康大鼠电针血清、10％脑梗塞大鼠血清、10％脑梗塞大鼠电针血清和含10％丹参注射液的L-DMEM诱导MSCs，光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可以通过贴壁法成功分离，并可在体外大量扩增，健康大鼠电针血清、脑梗塞大鼠血清、脑梗塞大鼠电针血清诱导48小时之后未见神经元样细胞出现，免疫细胞化学染色NSE、Nestin阴性。丹参诱导4小时后，大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin染色呈阳性。结论：健康大鼠电针血清、脑梗塞大鼠血清、脑梗塞大鼠电针血清不能诱导MSCs体外分化；丹参注射液可以在体外诱导MSCs分化为神经元样细胞。     

益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的探讨益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用.方法采用密度梯度离心法分离获取SD大鼠骨髓单个核细胞层,将细胞经过传代培养使细胞得到扩增和纯化,用流式细胞仪鉴别.用益气活血方联合二甲亚砜(DMSO)、丁羟茴醚(BHA)和β-巯基乙醇(BME)等对碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导的MSCs诱导向神经细胞定向分化.用免疫细胞化学方法检测诱导1 h、3 h后巢蛋白(nestin)的表达,诱导5 h后神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,鉴定分化细胞的类型,并计数MSCs分化的各种细胞的阳性率.结果益气活血方体外诱导MSCs 1h、3 h后分化为nestin免疫细胞阳性率为45.5%±3.4%和38.3%±1.8%,诱导5 h后NSE和GFAP免疫细胞阳性率为82.3%±2.4%、12.1%±1.6%,与对照组相比有极显著性差异(P＜0.01).结论成年大鼠骨髓MSCs可以在体外培养扩增,益气活血方有体外定向诱导骨髓问充质干细胞向神经细胞分化的作用.     

阿魏酸钠诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的初步研究

目的 探讨阿魏酸钠诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可能作用。方法 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，采用阿魏酸钠对其进行诱导培养，倒置显微镜下观察诱导培养不同时间后细胞的形态变化，并应用免疫细胞化学方法鉴定诱导培养后细胞表面神经细胞特异性标志物神经丝蛋白(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果 阿魏酸钠诱导培养6h后即可见细胞形态发生明显变化，24h后表现为典型的神经细胞样形态，NF和NSE神经细胞特异性标志物呈阳性表达。结论 初步证实阿魏酸钠具有诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。     

隐丹参酮诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的：观察隐丹参酮体外定向诱导成人骨髓间质干细胞（MSC）分化为神经元样细胞。方法：采用Ficoll-Paque液分离成人MSC，体外扩增，FACScan流式细胞仪检测表面抗原表达，采用含隐丹参酮的无血清DMEM诱导MSC分化为神经元样细胞。免疫组化鉴定神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF－M，NF－H）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、巢蛋白（Nestin)的表达。结果：成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代可获得0.5×10^6个细胞，15代可获得（2－3）×10^12个细胞，流式细胞仪检测显示CD29、CD44、CD90、CD105、CD166表达阳性，CD11a、CD14、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性。加入隐丹参酮诱导后，MSC胞体收缩，突起伸出；免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF－M，NF－H、Nestin表达阳性，GFAP阴性。结论：隐丹参酮在体外可诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞。     

补肾填精法促进骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探讨补肾填精方右归丸含药血清体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞的作用.方法:用DMEM/F-12培养液培养Wistar大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs).用右归丸含药血清诱导BMSCs分化后,倒置显微镜观察细胞形态变化;用尼氏染色法观察神经细胞特征性结构;用免疫细胞化学染色法鉴定神经胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及神经细胞特异性标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE),微管相关蛋白-2(MAP-2)的表达.结果:诱导6h后,骨髓基质干细胞胞体收缩,有突起伸出;诱导24 h后突起增多形成网络结构;尼氏染色法显示诱导后的细胞胞体中有尼氏体.免疫细胞化学染色示NSE及MAP-2阳性表达,GFAP无表达.结论:右归丸含药血清可以体外诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞.     

刺五加注射液体外诱导骨髓间充质分化机制的研究

目的:探讨刺五加注射液对体外培养的骨髓间充质干细胞诱导为神经元样细胞的作用机制。方法:体外分离培养骨髓间充质干细胞,以刺五加注射液对其进行体外诱导,免疫组化鉴定NSE、MAP-2等神经标志物及尼氏体染色。结果:刺五加注射液可体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,NSE、MAP-2反应及尼氏体染色均阳性。结论:刺五加注射液的诱导机制可能与其具有补肾益精及抗氧化性有关。     

中药诱导大鼠间充质干细胞向神经干细胞分化研究

目的筛选具有诱导大鼠自体骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的有效中药成分。方法用分别舍有黄芩苷、三七总皂角苷、红景天苷和察丹酚酸B的诱导培养基对经培养传代的大鼠间充质干细胞进行诱导培养．并设对照组,再将以上4种中药单体诱导的间充质干细胞和对照组细胞用抗神经元特异烯化酶（NSE）抗体、抗胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）抗体和抗Nestin抗体进行免疫组化鉴定,以明确大鼠间充质细胞经这4种中药单体诱导后生长的细胞的性质。结果4种中药单体诱导的间充质干细胞都表达NSE、GFAP和Nestin,这些细胞形态均表现出具有丰富的胞体和明显的突起,对照纽则为胞体较小、呈圆形或椭圆形,突起少且短,甚至没有突起的细胞。结论三七总皂苷、红景天苷、黄芩苷和察丹酚酸B具有诱导间充质干细胞向神经细胞分化的作用．     

川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞长期诱导效应的研究

目的 探讨川芎嗪提取液体对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的长期诱导效应.方法 分离培养大鼠骨髓MSCs,用1.50g/L川芎嗪提取液对MSCs进行诱导,倒置显微镜下观察诱导培养不同时间后细胞的形态变化,并应用免疫细胞化学方法鉴定诱导培养后细胞浆内Nestin和NSE蛋白表达.结果 川芎嗪诱导培养8h后即可见细胞形态发生变化,24 h后表现为典型的神经元细胞形态,Nestin和NSE神经细胞特异性标志物呈阳性表达,3d后诱导效果最好,6d后,有些细胞突起变长,出现分叉,并且有些细胞出现衰老死亡.结论 川芎嗪早期诱导BMSCs向神经元样细胞分化的效果较好,长期诱导的特异性不明显.但可促进细胞突起的生长,并且促进神经细胞的成熟和死亡.     

冬虫夏草含药血清诱导神经干细胞定向分化的影响

目的研究神经干细胞具有自我更新、未分化和多向分化潜能,冬虫夏草中的氨基酸、核苷和糖蛋白等能诱导神经干细胞的定向分化。方法取新生24 h内的Wistar大鼠大脑海马区分离培养神经干细胞三代后,加入低、中、高剂量冬虫夏草含药血清与对照血清进行培养,观察其对神经干细胞影响,通过MTT检测神经细胞生长曲线,免疫组化法和RTPCR半定量检测神经干细胞向神经元分化的情况。结果新生大鼠海马分离培养的神经克隆球,经免疫细胞化学染色检测为Nestin阳性细胞。NSC贴壁分化的细胞呈NSE、GFAP阳性。冬虫夏草低、中药物实验组诱导神经干细胞分化为神经元的阳性细胞明显高于对照组,且呈量效依赖关系,高浓度药物实验组与对照组没有明显差别。结论冬虫夏草药物血清可体外诱导神经干细胞向神经元方向分化,在一定范围内存在量效依赖关系。     

丹参素定向诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的 研究丹参素体外定向诱导骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)分化为神经元样细胞。方法 利用Ficoll-Paque液将骨髓细胞进行密度梯度离心和贴壁筛选分离出MSC,体外扩增,流式细胞仪检测MSC表面抗原表达。采用含丹参素的无血清L-DMEM诱导MSC分化为神经元样细胞,并且探讨丹参素不同浓度及不同作用时间对MSC诱导分化为神经元样细胞的影响。以免疫组化方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达、结果 MSC在体外传代扩增后,流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD166表达阳性,CDl4、CD34、CD45、HLA-DR为阴性。丹参素诱导后,MSC胞体收缩,突起伸出,呈典型的核周体形态,类似神经元;免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF-M、nestin表达阳性,GFAP阴性。结论 丹参素可以在体外诱导MSC分化为神经元样细胞,其诱导转化率与丹参素浓度和作用时间有关。     

三七总皂苷在骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞中的调解作用研究

目的:探讨三七总皂苷在骨髓间质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞中的调解作用。方法:①实验材料:成年健康Wister大鼠(雌雄不限),SRF级,体质量(150±30)g;②实验方法:无菌的条件下从大鼠的股骨中分离并继代培养MSCs细胞,当传至第5代时,先用完全培养液[含10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)]进行预诱导,再更换无血清培养液(含三七总皂苷0.25g/L)进行诱导,采用免疫组织化学SABC法检测神经丝蛋白(NF-M)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(nestin)、微管联合蛋白-2(MAP-2)、生长相关蛋白43(GAP-43)以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果:①采用三七总皂苷诱导后,大多数MSCs呈神经元样细胞分化。经免疫组织化学鉴定,上述细胞表现为NSE、MAP-2和NF染色阳性,呈棕黄色,而GFAP染色阴性。②采用三七总皂苷进行诱导时,MSCs的胞体逐渐增大,并伸出细长的突起,在突起的末端出现分支,有些相邻细胞的突起还成网状连接。③三七总皂苷诱导MSCs转变为类似于神经元样的形态,经免疫组织化学鉴定,大多数细胞表现为NF-M、NSE、nestin、MAP-2和GAP-43染色阳性,并在胞质和突起中有棕黄色的物质,而GFAP染色均为阴性。SABC法显示NSE和MAP-2阳性细胞数分别为(72.64±2.04)%和(73.5±2.17)%。结论:三七总皂苷在体外能使MSCs向神经元样细胞转化,且具有神经元样细胞的特性,这为MSCs治疗相关疾病提供了理论基础。     

地黄多糖对大鼠骨髓间充质干细胞向神经样细胞诱导分化作用的研究

目的:探讨地黄多糖体外对大鼠骨髓间充质干细胞( BMSCs)分化为神经样细胞的诱导作用.方法:以大鼠BMSCs为研究对象,采用流式细胞仪检测BMSCs表面标志,MTT法检测细胞生长曲线,当第3代细胞爬片达到80％以上汇合时,分为对照组、化学方法诱导组(5 mmol·L -1,β-mercap toethanol)、脑源性神经生长因子(10 μg·L-1,BDNF)组和地黄多糖组(200 mg·L-1)进行诱导,6h后应用免疫细胞化学染色法检测各实验组神经元巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,RT-PCR检测nestin,NSE,βⅢ-微管蛋白(βⅢ-tubulin)和GFAP mRNA的表达情况.结果:经分离鉴定培养5代以内大鼠BMSCs增殖旺盛、具有较好的细胞活力;免疫细胞化学染色和RT-PCR检测结果显示,对照组不表达神经细胞标志物,各诱导组诱导后有特异性神经细胞标志物表达.其中地黄多糖组Nestin,NSE阳性细胞率分别为( 56.74±1.36)％,(73.37±1.27)％,高于化学诱导组(28.21±2.43)％,(2.31±2.72)％和神经生长因子组(31.3±1.61)％,(28.87±1.65)％,(P＜0.05);GFAP阳性细胞率(20.17±1.27)％低于化学诱导组和神经生长因子组,差异具有统计学意义(P＜0.05);化学诱导组Nestin,NSE和GFAP阳性细胞率与生长因子组比较,差异无统计学意义.结论:地黄多糖具有诱导BMSCs向神经样细胞分化的作用,主要向神经元样细胞方向诱导.     

成人骨髓间质干细胞诱导分化为神经元样细胞及其与细胞分裂的关系

目的探讨成人骨髓间质干细胞(hMSC)向神经元样细胞分化过程中分化与细胞分裂的关系。方法从成人骨髓中分离骨髓间质干细胞(MSC),培养扩增。用参芪液诱导MSC分化为神经元样细胞,经免疫组化鉴定其神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。诱导后进行神经元样细胞计数,掺入Brdu测定,计算标记系数。采用双标记间接免疫荧光法检测神经元样细胞特异性表面标记(NSE、NF)与细胞分裂的标记Brdu的关系。抑制DNA合成,计算Brdu、NSE和NF阳性细胞数。结果MSC经参芪液诱导后,可见神经元样细胞。免疫组化显示诱导出的神经元样细胞NSE、NF阳性,GFAP阴性。MSC诱导分化后的细胞总数增加,诱导分化后12h内细胞增殖较快。30%以上分化的神经元样细胞在表达NSE和NF的同时可见Brdu标记,而另一部分分化的神经元则无Brdu标记。抑制DNA合成,并不会阻止神经元的分化,仍有70%的分化神经元表达神经元特异性标记蛋白NSE。结论MSC诱导分化的部分神经元样细胞可进行细胞分裂,但抑制细胞分裂不影响神经元分化。     

香丹注射液定向诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的:研究香丹注射液对成年SD大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)的诱导分化作用.方法:rMSCs取自大鼠的下肢骨,贴壁筛选法和营养缺陷培养基(α-MEM完全培养液)分离纯化.加碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导第5代的rMSCs 24 h,换无血清培养液(D/F12 N2 bFGF)和香丹注射液(1%～5%)诱导6～8 h,观察细胞形态变化;细胞免疫化学和反转录-PCR法鉴定神经元标记物(神经元特异性烯醇化酶NSE、神经丝蛋白NF-200、微管相关蛋白MAP-2及胶质纤维酸性蛋白GFAP)的表达及相对表达量,并得到相应的诱导率.结果:诱导3 h,rMSCs出现神经元样的形态学变化,诱导6～8h,神经元的诱导率达83.5%±3.8%;诱导组中,神经元样细胞NSE、NF和GFAP的阳性率分别为82.9%±2.98%、84.1%±4.45%、3.49%±1.67%;对照组细胞和诱导组未变化细胞上述染色均呈阴性;RT-PCR法示:只有诱导组有NSE、MAP-2(HWM)、GFAP的表达且前两者的表达量均分别高于后者(P＜0.01).结论:1%～5%香丹注射液在体外能定向诱导rMSCs分化为神经元样细胞.