鱼腥草1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因克隆与差异表达

目的 克隆鱼腥草1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因,并分析其差异表达.方法 采用RT-PCR方法获得DXR基因cDNA序列,并对DXR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测了该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR方法检测了DXR基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况.结果 克隆获得的DXR基因长为1 416 bp,编码471个氨基酸.生物信息学预测DXR蛋白不含跨膜区,不含信号肽.DXR基因在鱼腥草的叶片中表达丰度最高,其次是地下茎,再次是地上茎,花中表达量最低.结论 首次从鱼腥草中克隆了DXR基因,为进一步阐明该基因在鱼腥草萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础.     

鱼腥草查耳酮合成酶1基因cDNA克隆、差异表达及其蛋白质序列分析

目的 克隆鱼腥草查耳酮合成酶1（CHS1）基因并分析其蛋白质序列。方法 根据已经克隆的植物CHS基因的保守序列设计一对引物,以鱼腥草总RNA为模板,采用RT-PCR和SON-PCR的方法快速获得CHS基因序列并连接到pMD18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段1 188 bp的序列,序列分析表明,该片段编码395个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在62.3%以上,生物信息学分析表明,该蛋白含有CHS家族的特征多肽序列“RLMMYQQGCFAGGTVLR”和“GVLFGFGPGL”,不含信号肽序列。相对荧光定量PCR分析表明,CHS1基因在花中的表达量最高,其次是地上茎,再次是地下茎,叶片中表达量最低。结论 首次从鱼腥草中克隆了CHS1基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

鱼腥草HMGR基因cDNA克隆、差异表达及蛋白质结构分析

目的克隆鱼腥草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因并分析其差异表达。方法采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法获得HMGR基因cDNA序列并对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测该蛋白功能;利用RT-PCR方法检测HMGR基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGR基因cDNA全长为1 626 bp,编码541个氨基酸。生物信息学预测HMGR蛋白含2个跨膜区,不含信号肽。HMGR基因主要在鱼腥草的花中表达,其他器官中表达相对较低,地下茎中表达量最低。结论首次从鱼腥草中克隆了HMGR基因,为进一步阐明该基因在鱼腥草萜类化合物代谢途径中的作用奠定基础。     

西伯利亚白刺L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶基因克隆与序列分析

目的 克隆西伯利亚白刺Nitraria sibirica维生素C合成过程中L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶（L-galactose-1-phosphate phosphatase,GPP）编码基因。方法 利用生物信息学方法对西伯利亚白刺三代转录组数据进行分析,共鉴定出2个GPP基因,并从西伯利亚白刺中成功克隆得到2条NsGPP基因序列,进一步利用生物信息学方法对其理化性质、蛋白结构、保守序列以及系统进化等进行分析,并结合RNA-seq数据分析其在盐胁迫下的表达模式,利用qRT-PCR实验检测其在不同组织中的表达水平。结果 从西伯利亚白刺中成功鉴定克隆出2个NsGPP基因,2个NsGPP基因所编码蛋白均含有保守的FBPase/IMPase/glpX-like（FIG）结构域,且与其他植物GPP蛋白具有较高的相似性。利用多个物种的GPP蛋白序列构建系统进化树,结果显示西伯利亚白刺与灌木或半木质化草本植物亲缘关系更近。Motif分析发现NsGPP蛋白与拟南芥等GPP蛋白较为相似,但也存在差异,并且2个NsGPP蛋白之间也存在差异。此外,NsGPP1与NsGPP2的蛋白三维结构之间也存在微小差别。RNA-seq分析表明,不同浓度NaCl处理下,NsGPP1的表达逐步升高的趋势,而NsGPP2的表达量则较低,且在盐胁迫后其表达水平逐渐降低。qRT-PCR实验结果显示,白刺GPP基因的表达存在组织表达特异性,且在同一组织中NsGPP1的表达水平显著高于NsGPP2。结论 从西伯利亚白刺中成功克隆到2个NsGPP基因,其编码蛋白均含有保守的FIG结构域,且与拟南芥等草本植物的GPP蛋白更为相似。NsGPP基因在不同组织中表达水平具有显著差异,其中NsGPP1可能参与西伯利亚白刺维生素C生物合成并参与白刺抵抗盐胁迫。为进一步解析白刺维生素C生物合成以及耐盐分子机制提供了理论依据。     

西洋参根腐病抗性相关基因PqDELLA1的克隆及表达分析

目的 克隆西洋参PqDELLA1基因,进行生物信息学分析,并探讨其在西洋参抗根腐病中的表达模式。方法 根据已获得的西洋参转录组数据,设计PqDELLA1基因全长扩增引物,利用无缝克隆的方法获得全长互补脱氧核糖核酸（cDNA）;采用国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）在线Blastp、DNAMAN和MEGA 6.0等软件对序列进行生物信息学分析;通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测PqDELLA1基因的组织表达及诱导表达模式。结果 扩增得到西洋参PqDELLA1基因,其cDNA序列为1743 bp,编码580个氨基酸;PqDELLA1蛋白相对分子质量为63 910,理论等电点为5.01,不含信号肽,为非跨膜蛋白,定位于细胞核,与番茄SlDELLA蛋白氨基酸相似度最高。qPCR结果显示PqDELLA1基因在叶中表达量最高,其次为茎,根中最少;该基因的表达受根腐病病原菌茄病镰刀菌（Fusarium solani）的诱导,接种后5 d内持续升高后降低。结论 首次克隆出西洋参PqDELLA1基因并进行了生物信息学和表达特性分析,发现该基因可响应F. solani的侵染,为后续解析其参与西洋参抗病反应的分子机制提供参考。     

龙骨马尾杉PcFPS1基因克隆及序列分析

目的 对龙骨马尾杉Phlegmariurus carinatus法呢二磷酸合成酶（Farnesyl diphosphate synthase,FPS）基因PcFPS1编码区进行克隆及序列分析。方法 根据已获得的龙骨马尾杉转录组数据,从中获得1条编码FPS的转录本,采用RT-PCR方法获得PcFPS1的编码区序列,并对PcFPS1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析。结果 序列分析表明,所克隆的PcFPS1基因编码区长为1 119 bp,编码372个氨基酸残基,PcFPS1与挪威云杉Picea abies的FPS具有70%的序列相似性。生物信息学预测PcFPS1蛋白基本不含跨膜区,具有萜类合酶保守结构域,不含信号肽。结论 首次获得龙骨马尾杉PcFPS1基因的编码区序列,为进一步研究PcFPS1在石杉科植物萜类及甾醇类化合物生物合成途径中的功能及鉴定酶活性位点奠定基础。     

甘草UGDH1基因的克隆、生物信息学及表达分析

目的 对甘草尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UGDH）基因进行克隆、生物信息学及表达分析。方法 提取6周龄乌拉尔甘草幼苗根、茎、叶的总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）克隆GuUGDH1基因（Gu表示甘草）互补脱氧核糖核酸（cDNA）序列,测序并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术进行组织特异性分析。结果 克隆所得GuUGDH1基因的开放阅读框（ORF）全长1 443 bp,编码480个氨基酸残基（GenBank登录号MT968993）;生物信息学分析显示,GuUGDH1属于稳定的酸性亲水蛋白,相对分子质量53.056 kDa,等电点5.89,不含信号肽,不含跨膜螺旋且都在膜外;含有3个典型的保守结构域,属于尿苷二磷酸（UDP）-葡萄糖/鸟苷二磷酸（GDP）-甘露糖脱氢酶家族;系统进化分析表明,GuUGDH1基因与豆科植物大豆Glycine max,密花豆Spatholobus suberectus的亲缘关系较近;Real-time PCR检测结果表明,在6周龄甘草幼苗的根、茎、叶中都能检测到GuUGDH1基因的表达,根的表达量显著高于茎和叶。结论 本研究克隆得到了甘草UGDH1基因并对其蛋白序列特征进行了系统分析,可为进一步研究UGDH1蛋白的催化功能提供理论依据。     

荆芥柠檬烯-3-羟化酶基因克隆及生物信息学分析

目的 克隆荆芥（Schizonepeta tenuifolia）中的柠檬烯-3-羟化酶基因（limonene-3-hydroxylase,StL3OH）,并对该基因的cDNA序列进行生物信息学分析。方法 根据荆芥转录组数据库设计特异性引物,通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术克隆StL3OH基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析。结果 荆芥StL3OH基因的cDNA序列长为1 598 bp,包含1个长度为1 497 bp的完整开放阅读框,编码498个的氨基酸,其StL3OH蛋白理论相对分子质量为56.40 kDa,为亲水性不稳定蛋白。生物信息学分析表明,StL3OH蛋白无信号肽,具有1个跨膜区,可能定位于内质网膜上。多重序列比对和聚类分析表明,荆芥StL3OH蛋白与植物留兰香柠檬烯-3-羟化酶蛋白（MsL3OH）的氨基酸序列高度相似,均含有细胞色素P450血红素结合区,属于细胞色素CYP71家族中的D亚家族。密码子偏性分析表明,该基因偏好使用以鸟嘌呤/胞嘧啶（G/C）结尾的密码子,具有27个偏性密码子,烟草为该基因最适合的外源表达宿主。结论 首次从荆芥中克隆得到StL3OH基因的cDNA序列,为下一步研究StL3OH蛋白的结构与功能和该基因在荆芥单萜类成分的累积与生物合成的调控机制提供依据。     

菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列，利用原核系统表达融合蛋白，为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增CnTPS1的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体，体外诱导目的蛋白表达。结果 CnTPS1编码序列全长1749bp，编码582个氨基酸；基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高；原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1，运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测，分析了该基因的组织表达模式，并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白，这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。     

当归DXR基因保守区克隆和组织特异性表达分析

目的 克隆当归Angelica sinensis 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）编码基因部分保守区序列,分析DXR基因在当归根、茎、叶中的特异性表达。方法 根据已克隆的植物DXR保守序列设计一对简并引物,以当归叶片总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增出DXR片段并连接到pGEM-T Easy载体上,转化大肠杆菌菌株Escherichia coli DH5α,阳性克隆经PCR检测后测序。运用RT-qPCR方法,以当归肌动蛋白基因Actin为内参基因,检测DXR在当归不同组织中的表达量。结果 得到一段564 bp的DXR基因序列,并在GenBank注册（登录号：KJ000259）。序列分析表明,该片段编码187个氨基酸,与GenBank中注册的海岛棉Gossypium barbadense等6个物种的DXR核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均在80%以上;DXR在叶中表达量最高,相对表达量分别是茎和根组织中的2.5倍和3.2倍（P<0.01）。结论 本研究首次从当归中克隆出了DXR部分保守区序列,并揭示了DXR在不同组织中的差异表达,为有效利用该基因奠定前期工作基础。     

鱼腥草乙酰辅酶A酰基转移酶基因克隆、表达及生物信息学分析

目的通过克隆鱼腥草乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-Co A C-acetyltransferase,AACT)基因c DNA全长,并展开生物信息学分析和表达分析,为解析鱼腥草萜类次生代谢产物的生物合成机制奠定基础。方法采用RT-PCR方法获得AACT基因c DNA序列并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法检测了AACT基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的AACT基因c DNA全长为1 218 bp,编码405个氨基酸。生物信息学预测AACT蛋白不含跨膜区,不含信号肽。AACT基因在鱼腥草地上茎中的表达量最高,达到1.49,其次是地下茎0.96,花和叶中的表达量相对较低,分别为0.20和0.10。结论首次从鱼腥草中克隆了AACT基因,为进一步阐明该基因在鱼腥草萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础。     

接骨草HMGR基因cDNA克隆、不同器官中的差异表达及生物信息学分析

目的克隆接骨草Sambucus chinensis 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因并分析其差异表达。方法采用RT-PCR方法获得HMGR基因c DNA序列,并对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三级结构预测分析,并预测该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR方法检测HMGR基因在接骨草的根状茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGR基因c DNA全长为1 626 bp,编码593个氨基酸。生物信息学预测HMGR蛋白含2个跨膜区,不含信号肽。HMGR基因主要在接骨草的花和地上茎中表达较高,其他器官表达相对较低。结论首次从接骨草中克隆了HMGR基因,为进一步阐明该基因在接骨草萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础。     

茅苍术DXS基因的克隆与分析

目的:克隆茅苍术萜类化合物生物合成关键酶1-脱氧木糖-5-磷酸合酶(DXS)基因,并进行序列特征分析和组织特异性表达分析。方法:根据转录组测序所得的DXS基因片段,克隆出全长c DNA序列。运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),以tublin为内参基因,检测DXS基因在不同组织中的表达量。结果:克隆得到的DXS基因全长c DNA序列为2 151 bp,编码716个氨基酸,并在Gen Bank注册(登录号KY659208)。氨基酸序列系统发育分析表明,该序列与甜叶菊等菊科植物DXS基因有较高的同源性。Real-time PCR法检测发现茅苍术DXS在叶片中表达量最高,其次为花,而在根茎和根中表达很低。结论:获得了茅苍术DXS基因的全长c DNA序列,对其进行了初步生物信息学分析,揭示了其组织差异性表达特征,为进一步阐述该基因在茅苍术萜类成分生物合成途径中的功能奠定了基础。     

灰毡毛忍冬LmC3H1基因的克隆及表达模式与绿原酸含量相关性分析

目的:以灰毡毛忍冬为材料,克隆对-香豆酸3-羟化酶(LmC3H1)基因,进行生物信息学和表达模式分析,结合绿原酸含量,研究推测灰毡毛忍冬LmC3H1基因的功能。方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和RACE技术克隆LmC3H1基因的全长c DNA序列,对该序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和HPLC分别测定灰毡毛忍冬茎、叶及不同花期花中LmC3H1的相对表达量及绿原酸含量。结果:克隆得LmC3H1(Gen Bank:MN177695)基因,开放阅读框(ORF)长度为1 533 bp,编码510个氨基酸,推测其分子式为C_(2618)H_(4134)N_(718)O_(727)S_(22),相对分子质量为58 005.32,等电点8.92,为亲水性蛋白,定位于叶绿体中,具有跨膜区域LLLIPAVLFLISLVYPLI,含有细胞色素P450的保守结构域CYTOCHROME_P450(422-433 aa);Real-time PCR结果显示,LmC3H1在灰毡毛忍冬茎、叶及不同花期花有不同程度的表达,其中在花发育阶段,白色花蕾期相对表达量最高,花蕾初期及白色开花期次之;白色花蕾期花与茎、叶比,花的相对表达量最高,叶的最低;HPLC结果显示,从绿白色花蕾期到金黄色开花期绿原酸含量呈上升趋势,金黄色开花期含量最高,不同器官中,花中绿原酸最高,茎最低。结论:克隆得到灰毡毛忍冬LmC3H1基因,推测LmC3H1可能参与灰毡毛忍冬花绿原酸的生物合成。该研究为进一步研究该基因的功能及探究灰毡毛忍冬绿原酸生物合成和调节机制提供了依据,同时为遗传改良灰毡毛忍冬品质奠定了基础。     

铁皮石斛中性/碱性转化酶(DoNI2)基因的克隆和表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中性/碱性转化酶(alkaline/neutral invertase,NI)家族基因成员,并对其进行定量表达以及生物信息学分析。方法采用转录组测序和RACE技术相结合克隆NI基因的cDNA序列,利用生物信息学工具对其进行分析,并采用实时荧光定量PCR方法检测NI基因在铁皮石斛根、茎和叶中的表达情况。结果克隆获得1个新的铁皮石斛NI基因,命名为DoNI2(Gen Bank登录号KY794404),全长2 397 bp,开放阅读框(ORF)为1 836 bp,编码611个氨基酸。DoNI2蛋白预测的理论相对分子质量和等电点分别为69 050和6.38,不稳定系数为42.95,疏水性系数为-0.232。DoNI2基因在铁皮石斛根、茎和叶中均有表达,其中在茎中表达量最高,根中最低。不同生长年限茎中DoNI2基因表达量与NI酶活性呈显著正相关。结论克隆了线粒体型的DoNI2基因的全长c DNA序列,为进一步阐明该基因在铁皮石斛蔗糖代谢途径中的重要作用奠定基础。     

陆英HMGS基因cDNA克隆、不同器官中的差异表达及生物信息学分析

目的克隆陆英Sambucus chinensis 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGS)基因并分析其差异表达。方法采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法获得HMGS基因c DNA序列并对HMGS蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测了该蛋白功能;利用RT-PCR方法检测了HMGS基因在陆英的根状茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGS基因c DNA全长为1 401 bp,编码466个氨基酸。生物信息学预测HMGS蛋白无跨膜区,不含信号肽。HMGS基因主要在陆英的花和根状茎中表达较高,在叶中表达相对较低。结论首次从陆英中克隆了HMGS基因,为进一步阐明该基因在陆英萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础。     

滇龙胆香叶醇-10-羟化酶基因克隆、生物信息学分析和表达

目的克隆滇龙胆Gentiana rigescens香叶醇-10-羟化酶(geraniol-10-hydroxylase,G10H)基因,对其进行定量表达以及生物信息学分析。方法采用PCR技术获得G10H的c DNA序列,对G10H蛋白进行理化性质、二级结构和三级结构等生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR方法检测G10H基因在滇龙胆根、茎、叶中的表达情况。结果克隆得到滇龙胆G10H基因,全长为1 400 bp,ORF 1 248 bp,编码415个氨基酸。生物信息学预测该基因编码蛋白质分子式为C_(2131)H_(3390)N_(586)O_(615)S_(17),等电点为7.62,不稳定系数为44.20,疏水性系数GRAVY为-0.245。G10H基因在滇龙胆根、茎、叶中均有表达,其中在根中表达量最高,茎中最低。结论首次从滇龙胆中克隆得到了G10H基因,为进一步阐明该基因的羟基化功能在滇龙胆龙胆苦苷生物合成途径中的重要作用奠定基础。     

长柄石杉L-赖氨酸脱羧酶基因克隆及序列分析

目的在对长柄石杉Huperzia serrata、闽浙马尾杉Phlegariurus minchegensis、华南马尾杉Phlegariurus austrosinicus和有柄马尾杉Phlegariurus petiolatus 4种石杉科植物的L-赖氨酸脱羧酶(L-lysine decarboxylase,LDC)基因编码区进行克隆的基础上,对长柄石杉的LDC基因全长序列进行分析并预测其蛋白结构。方法采用RT-PCR技术,以石杉科植物叶片提取的总RNA为模板克隆得到LDC基因编码区序列,通过BLAST比对和MEGA5.0软件对克隆的序列进行分析。采用RACE技术获得石杉科广布种长柄石杉的LDC基因全长序列,并对其蛋白的二级结构及三维结构进行预测分析。结果克隆的4种石杉科植物LDC基因序列与数据库中被注释为编码LDC的基因序列保持高度的相似性,长柄石杉LDC蛋白与NCBI中的蛇足石杉LDC氨基酸序列相似度很高,与蕨类植物江南卷柏的同源性也较高。长柄石杉LDC基因编码区全长为1 266 bp,编码403个氨基酸,Gen Bank登录号KF040056。结论克隆得到4种石杉科植物的LDC基因,分析了长柄石杉LDC基因的全长序列并预测其蛋白结构,为进一步阐明石杉科植物石杉碱甲生物合成途径奠定基础。