铁皮石斛锌铁调控转运蛋白基因的克隆与表达分析

锌铁调控转运蛋白(ZRT, IRT-like protein, ZIP)在植物生长发育过程中起重要的调控作用。研究采用实时定量PCR(QPCR)和RACE技术,首次从珍稀濒危兰科药用铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆得到1个ZIP基因cDNA全长,命名为DoZIP1,提交GenBank获得注册号KJ946203。生物信息学分析显示,该基因开放阅读框1 056 bp,编码1条由351个氨基酸组成的肽链,相对分子质量37.57 kDa,等电点6.09。推定的DoZIP1蛋白具有保守的锌铁调控转运相关蛋白结构域,二级结构包含α螺旋50.71%、延伸链11.11%、β转角1.99%与随机卷曲36.18%,具有信号肽和8个跨膜域,预测定位在质膜。该蛋白质氨基酸序列与拟南芥、苜蓿、水稻等物种ZIP蛋白相似性较高,系统进化分析表明其与AtZIP10,OsZIP3蛋白的亲缘关系较近,聚在一个分支。QPCR分析表明,DoZIP1基因转录本在根中相对表达量较高,为茎中的4.19倍;叶次之,为茎的1.12倍。DoZIP1基因的分子特征为下一步研究其在铁皮石斛生长发育过程的生物学功能奠定基础。     

基于转录组数据分析药用大黄的密码子使用偏好性

目的研究药用大黄Rheum officinale转录组编码序列的密码子使用特点及其影响因素,为蒽醌类化合物异源合成的载体选择及药用大黄分子进化研究提供理论基础。方法利用perl程序及Codon W软件分析4733条药用大黄转录组编码序列的密码子使用偏好性。结果药用大黄转录组编码序列的GC、GC3平均含量分别为45.6%、44.73%,GC12与GC3存在显著正相关(r=0.215,P0.001);ENc-GC3中性图及偏倚性分析结果显示,大部分基因分布于远离期望曲线和平面中心点,大部分基因分布偏离期望曲线和中心点。通过基因高表达筛选密码子方法确定了29个药用大黄的最优密码子,大多数的最优密码子以U和A结尾。结论突变压力在药用大黄转录组编码序列的密码子使用偏好性形成过程这起到主要作用。     

铁皮石斛F-box蛋白基因DoSKP2A的克隆与表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用铁皮石斛F-box蛋白基因即S期激酶相关蛋白(S phase kinase-associated protein)基因DoSKP2A,并进行生物信息学和表达特征分析。方法采用RACE技术获基因全长;利用生物信息软件预测基因编码蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 7.0和MEGA 7.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建;借助定量PCR检测基因表达模式。结果克隆到DoSKP2A(GenBank注册号KU160472),c DNA全长1 507 bp,开放阅读框(ORF)长1 101 bp,编码蛋白含366个氨基酸,相对分子质量39 590,等电点7.9。DoSKP2A蛋白不含跨膜域和信号肽,包含F-box核心结构域(26～88)、亮氨酸重复序列LRR(202～226)和多个保守基序;Do SKP2A与植物SKP2As蛋白一致性为64.6%～72.4%,所在分支隶属于SKP2As分子进化的单子叶植物分支,与小兰屿蝴蝶兰SKP2A亲缘关系近;DoSKP2A基因转录本在石斛3种器官中为组成型表达,根中相对表达量较高,为叶中的6.16倍,茎中次之,叶中表达量很低。结论获得一个全新的铁皮石斛F-box蛋白基因DoSKP2A全长、生物信息及其表达特征,为研究其在铁皮石斛生长发育、信号传导和抗逆境胁迫的分子机制提供基础。     

白鲜根转录组高通量测序与数据分析

目的获得白鲜Dictamnus dasycarpus根转录组信息特征。方法以白鲜根为研究对象,采用Illumina HiSeq TM 2000150PE进行高通量转录组测序并进行数据分析。结果转录组测序共获得69 643 286条高质量序列(clean reads),Trinity denovo组装获得49 050条unigenes,平均长度841 nt。BLAST分析显示分别有31 636(64.49%)、22 367(45.60%)、19 246(39.23%)、12 595(25.68%)条unigenes在NR、Swiss-port、KOG、KEGG数据库得到注释信息,可归为GO分类的生物过程、细胞组分和分子功能3大类42分支,涉及132个KEGG标准代谢通路,其中包括18个次生代谢标准通路。进一步分析获得90个基因参与多种生物碱生物合成通路。蛋白编码框序列1 908个,高等植物转录因子55个家族;借助MISA软件发现4 579个SSRs,三碱基重复最丰富,有2 021个,出现频率为44.1%;五碱基重复SSRs仅占3.5%。结论利用高通量测序技术获得白鲜根转录组信息特征,为后期白鲜基因功能鉴定、次生代谢途径解析及其调控机制研究奠定基础。     

铁皮石斛己糖转运蛋白基因DoHT1的分离和表达分析

该研究借助RACE技术克隆了铁皮石斛己糖转运蛋白(hexose transporter,HT)基因Do HT1,对其序列特征进行生物信息分析,并采用定量PCR分析基因表达模式。结果表明,Do HT1基因(Gen Bank注册号KU160469)c DNA全长1 586 bp,ORF长1 536 bp,编码1条由511个氨基酸组成的多肽,56.18 k Da,等电点9.08。Do HT1蛋白含有糖转运蛋白协助扩散超家族保守结构域(22~483)、糖转运基序1(139~164)、糖转运基序2(338~355)和功能基序;无信号肽,含11个跨膜域,预测定位在质膜,与多种植物HTs蛋白有较高的一致性(54.7%~80.7%),隶属于MST(单糖转运蛋白)分支,与小兰屿蝴蝶兰亲缘关系最近。Do HT1基因具有组织表达特异性,其转录本在石斛叶中显著最高,茎中次为,分别为根中的19.36,1.82倍。该研究获得Do HT1基因全长及分子特征,为进一步研究其在铁皮石斛糖代谢调控中的作用奠定基础。     

野生与栽培远志HPLC指纹图谱及化学模式识别研究

目的建立野生和栽培远志的HPLC指纹图谱,为不同来源远志鉴别和质量评价提供依据。方法利用HPLC法对20批不同产地野生与栽培远志进行测定,采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)计算相似度,运用主成分分析(PCA)和最小偏二乘法-判别分析(PLS-DA)对其进行模式识别研究。结果建立了野生与栽培远志HPLC指纹图谱共有模式,标定了24个共有峰,20批不同产地野生与栽培远志指纹图谱与对照指纹图谱的相似度均0.86。PCA可较好地将不同来源远志归为2类,PLS-DA则能将野生与栽培远志完全区分开,远志酮III和3,6′-二芥子酰基蔗糖等12个成分是导致二者差异的主要标记物。结论建立的远志指纹图谱特征性强,结合化学模式识别方法可有效评价远志质量以及区分其野生与栽培品,为远志的质量控制和化学计量分类学提供参考依据。     

掌叶大黄种子特性研究及无菌培养体系的构建c

目的 研究掌叶大黄种子形态和发芽特性并构建无菌苗和愈伤组织培养体系，为其快繁和次生代谢调控研究提供基础。方法 从大小、净度、千粒质量、生活力、发芽率及发芽势等方面进行10批掌叶大黄种子特性分析；利用正交试验筛选大黄无菌苗建立的消毒体系及愈伤组织诱导的激素配比；HPLC法分析无菌苗和愈伤组织中10种有效成分的含量。结果 10批不同产地来源掌叶大黄的果实及种子外观形态无显著差异，含水量、生活力、发芽率及发芽势有明显差异，和政县与渭源县大黄发芽特性最高；75%乙醇30 s、10% H₂O₂ 15 min为大黄种子无菌苗建立的最佳消毒组合；愈伤组织诱导最佳激素为6-苄氨基腺嘌呤（1.0 mg/L）+6-糠氨基嘌呤（2.0 mg/L）+1-萘乙酸（1.5 mg/L）；不同消毒剂处理种子对无菌苗10种成分的积累无显著影响（P>0.05），愈伤组织可检测出7种有效成分，含量显著低于无菌苗，大黄酚-8-O-葡萄糖苷含量较其他成分高。结论 以千粒质量、生活力、发芽率及发芽势等指标明确甘肃和政县与渭源县种子特性优良，成功建立掌叶大黄无菌苗与愈伤组织培养体系，为掌叶大黄下一步研究奠定基础。     

掌叶大黄RpNAC1基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

目的 克隆掌叶大黄Rheum palmatum转录因子基因RpNAC1,进行生物信息学、亚细胞定位及表达模式分析。方法 根据转录组中一个NAC unigene,利用RT-PCR克隆开放阅读框（open reading frame,ORF）。通过生物信息软件预测基因编码蛋白的理化性质、结构域等分子特征。采用DNAStar 6.0和MEGA 7.0分别进行氨基酸序列比对和进化分析。构建绿色荧光蛋白（GFP）融合表达载体,以农杆菌侵染烟草叶片的瞬时表达法分析亚细胞定位。运用qRT-PCR检测基因表达模式。结果 分离到RpNAC1基因,ORF（1269 bp）,编码一个由422个氨基酸组成的蛋白质,相对分子质量47 070,等电点5.80,包含一个保守NAC结构域（32～181）,与多种植物NAC蛋白一致性较高（62.42%～88.7%）,聚在植物NAC分子进化树的NAC2分支,与甜菜NAC（XP_010694507）亲缘关系较近。RpNAC1-GFP融合蛋白定位在烟草细胞核内。RpNAC1基因在一年生植株根中表达量最高,根茎中表达量最低,相对表达量分别为叶中的5.37、0.012倍;该基因响应200 μmol/L赤霉素（gibberellin,GA3）处理后在24 h内总体上调,200 μmol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）处理1 h和12 h基因显著上调,200 μmol/L水杨酸（salicylic acid,SA）处理12 h显著诱导基因表达,200 μmol/L脱落酸（abscisic acid,ABA）处理抑制基因表达,200 μmol/L乙烯（ethylene,ET）处理未见明显变化。结论 获得掌叶大黄RpNAC1基因序列及表达特征,为进一步研究其在蒽醌类成分合成与积累中的转录调控作用提供支撑。     

老年人残根残冠的保存治疗与修复

老年人残根残冠的保存治疗与修复周奉海，李光清，李依民，张康宁，吕广辉，孙汉权我科于１９８７～１９９１年对１２４例老年人１７９颗残根残冠牙进行保存治疗，并用简单桩冠，光固化复合树脂，附支架、桩钉、银汞充填，锤造冠等修复。通过１～４年的临床观察，有效率达...     

基于RNA-seq的银线草转录组分析

目的获得银线草Chloranthusjaponicus根茎转录组信息特征。方法用高通量测序平台IlluminaHiSeq TM2000150PE进行银线草根茎转录组测序分析。结果转录组测序共获得68458750条高质量序列(cleanreads),Trinitydenovo组装获得56 096个unigenes,平均长度801 nt。BLAST分析显示分别有25 773(45.94%)、17 801(31.73%)、16 082(28.67%)、9649(17.20%)个unigenes在NR、Swiss-port、KOG、KEGG数据库得到注释信息,可归为GO分类的生物过程、细胞组分和分子功能3大类40分支,涉及131个KEGG标准代谢通路,其中包括16个次生代谢标准通路。进一步分析获得170个基因参与单萜、二萜、倍半萜、三萜等萜类化合物生物合成通路。同时,转录组预测编码蛋白框序列1 887个;高等植物转录因子54个家族。借助MISA软件发现8 987个简单重复序列(SSRs),二碱基重复SSRs数量最丰富,有5 948个,出现频率为66.2%,五碱基重复SSRs相对较少,占1.3%。结论基于RNA-seq分析获得银线草根茎转录组信息特征及萜类合成代谢通路关键基因,为后期银线草活性成分次生代谢途径解析及调控研究奠定基础。