黄芩及其同属近缘种的DNA条形码鉴定研究

目的 利用DNA条形码鉴定技术,快速、准确地鉴别黄芩及其同属近缘种（易混品）。方法 提取黄芩及其同属近缘种的DNA,对ITS和psbA-trnH序列扩增和测序,计算物种种内种间Kimura 2-parameter （K2P）遗传距离。采用相似性搜索法、最近距离法、构建Neighbor-joining（NJ）系统聚类树等方法进行鉴定分析。结果 黄芩及其同属近缘种种间的ITS和psbA-trnH序列的遗传距离为0.067 97～0.088 80和0.050 61～0.057 37,明显大于黄芩种内的遗传距离0～0.006 40和0～0.003 11。ITS和psbA-trnH分子系统树显示,黄芩8个居群个体均聚为一单系分支,支持率均为100%,与其5个同属近缘种很好地区分开。3种鉴定方法表明,ITS和psbA-trnH序列适合鉴别黄芩及其同属近缘种。结论 ITS和psbA-trnH序列可以有效准确鉴别中药材黄芩及其近缘种。     

鬼针草及其近缘种的分子鉴定和亲缘关系研究

目的 构建鬼针草Bidens pilosa及其与近缘种之间系统发育关系,准确鉴别鬼针草及其近缘种。方法 提取鬼针草及其近缘种DNA,对核基因ITS片段和叶绿体基因psbA-trnH序列扩增和测序,计算物种种内、种间Kimura 2-parameter （K2P）遗传距离。采用最近距离、相似性搜索、构建Neighbor-joining（NJ）系统聚类树3种方法进行鉴定分析。结果 ITS和psbA-trnH分子系统树支持鬼针草不同居群样本聚为一单系分支,支持率为79%和87%;其中,鬼针草与白花鬼针草构成一单系分支,金盏银盘与婆婆针构成姐妹群分支,上述两分支ITS和联合数据支持率均为100%;狼把草与柳叶鬼针草、大狼把草构成一单系分支（ITS和联合数据支持率为100%,psbA-trnH数据支持率为96%）。鬼针草及其近缘种种间ITS和psbA-trnH序列的遗传距离为0.007 94～0.128 80和0.005 18～0.074 52,均远大于鬼针草种内遗传距离0～0.001 59和0～0.002 52。结论 鬼针草与白花鬼针草亲缘关系最近,金盏银盘与婆婆针构成姐妹群关系,狼把草与柳叶鬼针草、大狼把草亲缘关系较近。ITS和psbA-trnH序列可以准确鉴别鬼针草及其近缘种。     

娑罗子基原物种的DNA条形码鉴定研究

目的 筛选出适用于鉴定七叶树属药用植物的条形码序列。方法 考察了七叶树属10个物种42份样品的核ITS、ITS2与叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK序列的PCR扩增和测序效率、种内及种间变异、鉴定效率,对初筛后的序列进行barcoding gap检验及NJ树聚类分析。结果 psbA-trnH序列的PCR扩增和测序效率均为100%,种间最小变异大于其种内最大变异,且鉴定效率为候选序列中最高,barcoding gap检验结果表明该序列在种间、种内变异重合比例较小,且NJ树聚类分析结果也表明psbA-trnH序列能够提供充分的辨析效果。结论 psbA-trnH序列能准确鉴定七叶树属药用植物,可作为七叶树属药用植物条形码序列。     

碎米桠及其近缘种的分子鉴定和亲缘关系研究

目的 构建碎米桠Isodon rubescens及其与近缘种之间系统发育关系,准确鉴别碎米桠及其近缘种。方法 提取碎米桠及其近缘种DNA,对核基因ITS片段和叶绿体基因psbA-trnH序列扩增和测序,计算物种种内、种间Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离。采用最近距离、相似性搜索、构建Neighbor-joining（NJ）系统聚类树3种方法进行鉴定分析。结果 ITS和psbA-trnH分子系统树支持碎米桠5个居群样本聚为一单系分支,支持率为94%和68%;其中,碎米桠与毛叶香茶菜、香茶菜和内折香茶菜聚在一支,支持率为70%和51%;溪黄草和显脉香茶菜构成姐妹群分支,支持率为81%和63%。碎米桠及其近缘种种间ITS和psbA-trnH序列的K2P遗传距离为0.007 08～0.072 61和0.008 06～0.024 76,均远大于碎米桠种内的遗传距离0～0.001 76和0～0.002 68。结论 碎米桠与毛叶香茶菜、香茶菜和内折香茶菜亲缘关系较近,溪黄草和显脉香茶菜亲缘关系最近。ITS和psbA-trnH序列可以准确鉴别碎米桠及其近缘种。     

ITS和psbA-trnH序列鉴别绿绒蒿属藏药植物

目的 应用核基因ITS和叶绿体psbA-trnH序列对绿绒蒿属Meconopsis Vig. 藏药进行鉴别。方法 采集欧贝3种基原植物罂粟科绿绒蒿属毛瓣绿绒蒿Meconopsis torquata、红花绿绒蒿Meconopsis punicea、全缘叶绿绒蒿Meconopsis integrifolia,才温2种基原植物罂粟科绿绒蒿属总状绿绒蒿Meconopsis racemosa、多刺绿绒蒿Meconopsis horridula,对植物核糖体DNA内转录间隔区、叶绿体psbA-trnH非编码区序列进行测定与分析。结果 ITS序列分析显示,总状绿绒蒿与多刺绿绒蒿序列一致,其余任意两种间具有变异位点;psbA-trnH序列分析显示,任意两种间均有变异位点;两者结合可有效对所有5种植物进行区分鉴定。结论 ITS和psbA-trnH序列相结合可用于绿绒蒿属藏药欧贝和才温的分子鉴定。     

蕨类药材石韦及其混伪品的psbA-trnH序列鉴定

为考察psbA-trnH序列鉴定蕨类药材的可行性,该研究以蕨类药材石韦及其混伪品作为研究对象,对其106份样品提取基因组DNA,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增其叶绿体psbA-trnH序列,并采用Mega6.0软件进行多序列比对,计算种内及种间K2P遗传距离,采用最大似然法（ML）构建系统聚类树。结果表明：石韦药材3个基原植物的psbA-trnH序列种内最大遗传距离均小于其与混伪品的种间最小遗传距离;ML树显示石韦药材可与其混伪品明显分开;psbA-trnH序列可作为蕨类药材的DNA条形码,能准确、稳定鉴定蕨类药材石韦及其混伪品。     

基于叶绿体DNA序列的多基原黄精分子鉴定

目的 通过分析rpl20-rps12、trnL-trnF及psbA-trnH序列变异特点,评价其对3种不同基原黄精的鉴定能力。方法 分别提取3种基原黄精总DNA,以rpl20-rps12、trnL-trnF及psbA-trnH引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增和测序。采用MEGA 5软件寻找其特异位点,计算样品K2-P（Kimura 2-parameter）遗传距离,并构建邻接（neighbor-joining,NJ）系统聚类树。结果 rpl20-rps12、trnL-trnF及psbA-trnH序列长度分别为722~737、293、457~531 bp,简约信息位点占比分别为0.4%、1.0%和2.4%。rpl20-rps12和psbA-trnH序列中种内最大遗传距离均小于种间最小遗传距离。基于3个序列构建的NJ树显示,3种基原黄精都表现出良好单系性,能明显区分。结论 从序列特点和种内、种间变异性综合分析,rpl20-rps12序列更适宜黄精的基原鉴定。     

基于ITS2和psbA-trnH序列对细小种子类药材车前子的鉴定比较

为考察ITS2 序列和psbA-trnH 序列对车前子药材及其常见混伪品的鉴定能力,该研究对车前子2个基原物种及7种混伪品共71份样本进行了研究。采用MEGA 5.1对获得的ITS2和psbA-trnH进行序列比对,计算种内和种间kimura 2-parameter（K2P）遗传距离,并构建系统发育树。结果显示,车前和平车前的ITS2 序列长度分别为199,200 bp;两者的ITS2序列种内最大 K2P 遗传距离均小于与混伪品的最小种间K2P 遗传距离;基于ITS2 序列构建的NJ 树中,车前、平车前及其混伪品都表现出良好单系性,都能相互明显区分。表明ITS2序列能将车前子药材与混伪品进行很好的区分。车前和平车前的psbA-trnH序列长度均为340 bp,两者的psbA-trnH 序列种内最大K2P 遗传距离小于与混伪品的最小种间K2P 遗传距离;基于psbA-trnH 序列构建的NJ 树结果显示,除大车前外,车前子药材与其余混伪品可以明显区分。因此,ITS2序列作为DNA条形码,车前子及其混伪品具有良好的鉴别能力,对保障车前子用药安全具有重要意义。     

基于COⅠ基因对东北林蛙、中国林蛙等蛙属24种的鉴定

目的 利用DNA条形码线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因（COⅠ）技术对东北林蛙等24种进行鉴别,构建邻接（NJ）系统发育树,对24种进行系统聚类分析,为东北林蛙等蛙类的鉴别,分类及新种的发现提供一定的依据。方法 收集东北林蛙、中国林蛙、黑龙江林蛙、徂崃林蛙、桓仁林蛙各10只,提取其DNA并进行聚合酶链式反应（PCR）扩增,将扩增成功的序列测序,共测得50条COⅠ基因序列;从GenBank数据库中获得蛙科蛙属24种163条COⅠ基因序列及蛙科侧褶蛙属,臭蛙属,琴蛙属,水蛙属,湍蛙属各一条COⅠ基因序列;利用MEGA X进行序列比对,分析各物种COⅠ基因序列简约性信息位点,计算种内,种间遗传距离,构建NJ树进行系统聚类分析。结果 东北林蛙等24种COⅠ基因序列长度为554 bp,共有210个简约性信息位点,各物种种内遗传距离均<2%;除桑植蛙与明全蛙种间遗传距离为0.004外,其余各物种种间遗传距离范围为0.024~0.228;桑植蛙与明全蛙聚为一支,部分东北林蛙与Rana uenoi聚为一支,中国林蛙有2个独立的分支,其余各物种均独立聚为一支。结论 DNA条形码COⅠ技术能够对东北林蛙等21种进行鉴定及鉴别,支持桑植蛙与明全蛙,韩国林蛙与昆嵛林蛙为同物异名,其中一支中国林蛙可能是蛙科蛙属未下载的4个种之一或新种。这表明DNA条形码COⅠ技术不仅可以鉴定及鉴别东北林蛙等24种蛙类,也可以为蛙科蛙属的分类,新种或亚种的发现提供一定的科学依据。     

基于ITS2和psbA-trnH条形码的藏党参的分子鉴定

目的 应用内转录间隔区（ITS）2及psbA-trnH条形码技术，对藏党参各物种之间进行分子生物学鉴定。方法 通过提取4个物种（灰毛党参Codonopsis canescens、脉花党参C. foetens subsp. nervosa、党参C. pilosula、长花党参C. thalictrifolia var. mollis）28份藏党参样品的基因组DNA，扩增ITS2及psbA-trnH序列并测序，并结合GenBank下载藏党参相关序列81条，包括15个物种，采用MEGA 6.0软件进行比对、变异位点分析、计算GC含量及种内和种间遗传距离，最大似然法（ML）、邻接法（NJ）、非加权组平均法（UPGMA）3种方法进行系统发育树的构建。结果 根据变异位点能将灰毛党参C. canescens、党参（党参C. pilosula、川党参C. pilosula subsp. tangshen及素花党参C. pilosula var. modesta）、西藏党参C. bhutanica、新疆党参C. clematidea、羊乳C. lanceolata、球花党参C. subglobosa及臭党参C. foetens区分；在系统发育树中，ITS2序列以ML法的聚类效果最佳，psbA-trnH序列以UPGMA法的聚类效果最佳，能对12个物种进行有效聚类区分。结论 ITS2及psbA-trnH条形码对单基原物种的鉴定率较高，但对变种与原变种间的鉴定仍存在一定局限性，这为后续藏党参物种之间的亲缘关系鉴定和临床应用等提供参考。     

千斤拔属药用植物DNA条形码鉴定研究

目的筛选一种可准确、高效鉴别千斤拔属Flemingia Roxb.ex Ait.et Ait.f.药用植物的DNA条形码序列。方法对4种14份千斤拔属药用植物的ITS2、rbc L、psb A-trn H序列进行扩增和测序,同时查找NCBI数据库中千斤拔属植物的相应序列,共计7种20份,比较不同序列的扩增效率及测序成功率,并对其进行种内、种间变异分析,barcoding gap检验及NJ聚类图分析,以评估不同序列对千斤拔属植物的物种鉴别能力。结果测序成功率方面,ITS2与rbc L序列对所分析样品的测序成功率为100%,psb A-trn H的测序成功率为85.71%;3条序列中,只有ITS2在barcoding gap检验中具有显著gap;从NJ聚类图来看,ITS2可明显区分千斤拔属植物的不同物种(除F.philippinensis与F.stricta外)。结论 ITS2序列能准确鉴别千斤拔属药用植物,可作为千斤拔药材基原植物鉴定的条形码序列。     

基于ITS2序列的海桐皮及其混伪品DNA分子鉴定

目的应用ITS2条形码技术,对海桐皮ErythrinaeCortex及其混伪品进行分子鉴定。方法通过提取31份海桐皮药材基原植物刺桐E.variegata、乔木刺桐E.arborescens及其混伪品的基因组DNA,扩增ITS2序列并测序;同时从GenBank下载混伪品序列15种38条,运用MEGA7.0软件进行序列比对,进行种间序列差异分析比较,并构建Neighbor-jioning(NJ)系统进化树,预测ITS2二级结构。结果在海桐皮2种基原中,刺桐的ITS2序列长度为232bp,乔木刺桐的ITS2序列长度为230bp,均为单倍型,可以明显区分;同时与其他刺桐属及易混品之间遗传距离较远。NJ树结果显示刺桐、乔木刺桐及其他易混品均单独聚为一支,表现出良好的单系性;依据ITS2二级结构,刺桐、乔木刺桐及其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异,可以直观地将刺桐与乔木刺桐,以及其与易混品进行区分。结论 ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确鉴别海桐皮药材,为保障安全用药提供了新的技术手段。     

罂粟属植物核心DNA条形码的筛选

DNA条形码(DNA barcoding)技术是一种准确、高效且对操作人员要求不高的物种鉴定技术。为了筛选出适合罂粟属的DNA条形码,从GenBank上获得罂粟属植物共69条序列,包括21条ITS序列,10条matK序列,8条psbA-trnH序列,14条rbcL序列和16条trnL-trnF序列。应用Mega 6.0软件分析了罂粟属的ITS,matK,psbA-trnH,rbcL,trnL-trnF序列的特征,通过计算序列的种内、种间距离,评估序列的Barcoding Gap和构建NJ,UPGMA系统发育树进行分析。分析结果表明:trnL-trnF不仅种内变异和种间变异差别最大,而且有明显的barcoding gap,种内变异和种间变异重合较少,能较好地区分不同种类的罂粟;所构建的NJ和UPGMA系统发育树,也能将全部物种区分开。综合考虑,建议把trnL-trnF作为鉴定罂粟属植物的核心条形码,结合其他片段作为组合条形码。     

基于ITS2条形码及其二级结构的菊科药用植物的系统发育分析＊

目的 采用ITS2（Internal transcribed spacer2，内转录间隔区2）序列作为条形码技术对菊科药用植物进行鉴别。方法 选取来自西藏及四川康定、乐山和峨眉地区的菊科样品44种，提取DNA并对其进行PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）扩增，后测序，测序结果提交至GenBank；同时从GenBank上下载17条样本序列。对提交和下载的61条序列用MEGA7.0软件计算种内与种间的遗传距离，采用邻接法（neighbor-joinging，NJ）构建系统聚类树直观反应鉴定结果。从ITS2数据库中预测并比较样本ITS2序列的二级结构差异。结果 菊科植物种间最小遗传距离0.031大于种内最大遗传距离0.009，有较明显的barcoding gap；NJ树显示种各属样本分别聚为一大枝，种内之间各自聚成小支，表现出良好的单系性；各属及各种样品ITS2二级结构存在明显差异。结论 以ITS2序列作为DNA条形码，能够对菊科药用植物进行准确、迅速的识别与鉴定，是物种间进化关系准确的分子鉴定依据，可为该科植物的分布、种群及种群数量的研究提供指导，为控制药品质量、合理开发利用及保护提供了新手段。     

利用DNA条形码检验中药制剂中的羚羊角药材

目的 研究以线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因作为DNA条形码检验中药制剂中羚羊角的可行性.方法 以不同厂家生产的8种含羚羊角中药制剂为材料,经充分研磨后,采用DNA提取试剂盒提取样品中DNA,以引物LCO1490和HCO2198或特异性引物0703扩增线粒体COI基因片段序列,PCR产物直接双向测序,将测序结果在GenBank中进行BLAST比对,并以DNAMAN和MEGA5.2软件构建同源树和NJ树,以赛加羚羊(gb|JN632700.1)和羚羊角标准药材序列为对照,判定制剂中羚羊角的真实性,并以Kimura-2-parameter模型计算种内、种间遗传距离.结果 8种中药制剂中羚羊角的COI基因序列长度均为658 bp,在同源树和NJ树中可与赛加羚羊和羚羊角标准药材聚成一支,并与outgroup完全分开.种内遗传距离为0～0.064,平均遗传距离为0.020,种间遗传距离为0.167～0.195.结论 以线粒体COI基因作为DNA条形码检验中药制剂中羚羊角方法是可行的,但因羚羊其他器官也含有相同基因,为保证检验结果的准确性,还需配合使用其他检验方法.     

基于ITS2序列的清风藤属药用植物分类鉴定研究＊

目的 探讨核基因内部转录间隔区2（internal transcribed spacer 2，ITS2）序列在清风藤属（Sabia）药用植物中的分类鉴定可行性与系统关系。方法 对9种38个产地的清风藤属药用植物ITS2序列进行PCR扩增和测序。基于（Kimura 2-parameter）K2P计算遗传距离，分析种内和种间变异与鉴定效率，应用最大似然法（maximum likelihood，ML）构建系统发育树。结果 清风藤属药用植物ITS2序列长度均为241 bp，GC含量为51.9-64.7%。38个产地清风藤属药用植物ITS2序列，共具有保守位点168个，变异位点数目为73个，简约信息位点数目为65个。ITS2在清风藤属药用植物中的种内变异为0-0.074，种间变异为0.007-0.205，种间变异较小，种间遗传距离与种内遗传距离存在交叉，没有形成明显的间隔。ML系统树表明，属内种间具有较高的自展支持率，基本能单独聚成一支，可对清风藤属药用植物种间进行有效分类鉴定。结论 ITS2序列在清风藤属植物中具有较好的通用性与鉴定效率，可用于清风藤属DNA条形码与分类鉴定研究。本研究为清风藤属植物的分类鉴定与系统演化研究提供了一定参考。     

基于通用DNA条形码序列的黄精属药用植物分子鉴定

目的 分析4个通用植物DNA条形码序列(trnH-psbA、matK、rbcL和ITS2)及其组合对黄精属药用植物的物种鉴定分辨率，挖掘适用于黄精属种间鉴定的高分辨率分子标记。方法 以《中国药典》2020年版中收录的黄精属药用植物黄精Polygonatum sibiricum、滇黄精P. kingianum、多花黄精P. cyrtonema、玉竹P. odorati及其地方常见同属替代品、混伪品共12种79个野生个体为对象，将4个通用DNA条形码序列独立、联合分析，评估其种间、种内变异情况，并分别基于建树法(tree-based method)和PWG距离法(PWG-distance method)评估不同条形码及其组合的物种鉴定分辨率。结果 ITS2序列扩增成功率低，trnH-psbA、matK、rbcL序列的引物在黄精属植物中通用性较好；3组叶绿体序列的种间变异依次为matK＞trnH-psbA＞rbcL，种内变异差异不显著，种间、种内遗传距离无明显的Barcoding gap；各条形码独立及联合分析的物种鉴定分辨率普遍偏低，其中，组合条形码trnH-psbA＋matK＋rbcL在建树法分析中的分辨率最高，为25%，trnH-psbA＋rbcL在距离法分析中的分辨率最高，为50%。结论 4个通用DNA条形码序列及其组合都并非黄精属药用植物不同种间有效区分鉴定的理想分子标记，但多序列联合分析能在一定程度上提高物种鉴定成功率。     

藏药兔耳草常用基原的ITS2序列鉴定研究

目的 利用DNA条形码内转录间隔区2（internal transcribed spacer 2,ITS2）序列针对自采及流通使用环节的不同基原兔耳草进行分析,建立一种快速鉴定常用兔耳草的方法,并分析市场流通的主流品种。方法 采用试剂盒提取101份兔耳草样品的DNA,针对其ITS2片段进行PCR扩增并双向测序,获取ITS2序列信息;并从GenBank上下载相关序列28条。运用MEGA6.0对129条ITS2序列进行比对分析,计算种内和种间K2P遗传距离,构建邻接法（neighbor-joining,NJ）系统进化树,并预测ITS2二级结构。采用BLAST法及NJ聚类分析法分析市场流通兔耳草基原。结果 除四川部分区域所产全缘兔耳草Lagotis integra与革叶兔耳草L.alutacea种间亲缘关系近外,短筒兔耳草L.brevituba、全缘兔耳草、圆穗兔耳草L.ramalana、革叶兔耳草、短穗兔耳草L.brachystachya及紫叶兔耳草L.praecox的种内最大遗传距离均小于种间最小遗传距离,具有明显的条形码间距。系统进化树显示短筒兔耳草、圆穗兔耳草、短穗兔耳草及紫叶兔耳草单独聚为一支,四川部分区域所产全缘兔耳草与革叶兔耳草聚为一支,其余全缘兔耳草聚为一支。通过ITS2二级结构发现,各基原兔耳草在茎环数目、大小及位置均有一定差异,可区分亲缘关系近的全缘兔耳草与革叶兔耳草。市场分析显示,市面上流通的兔耳草有6种基原,以全缘兔耳草使用占比最高,短筒兔耳草次之,短穗兔耳草及圆穗兔耳草较低,紫叶兔耳草及革叶兔耳草最低。结论 ITS2序列可以作为DNA条形码用来鉴别常用藏药兔耳草的基原,市场主流兔耳草品种为全缘兔耳草、短筒兔耳草及短穗兔耳草。