娑罗子基原物种的DNA条形码鉴定研究

目的 筛选出适用于鉴定七叶树属药用植物的条形码序列。方法 考察了七叶树属10个物种42份样品的核ITS、ITS2与叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK序列的PCR扩增和测序效率、种内及种间变异、鉴定效率,对初筛后的序列进行barcoding gap检验及NJ树聚类分析。结果 psbA-trnH序列的PCR扩增和测序效率均为100%,种间最小变异大于其种内最大变异,且鉴定效率为候选序列中最高,barcoding gap检验结果表明该序列在种间、种内变异重合比例较小,且NJ树聚类分析结果也表明psbA-trnH序列能够提供充分的辨析效果。结论 psbA-trnH序列能准确鉴定七叶树属药用植物,可作为七叶树属药用植物条形码序列。     

基于通用DNA条形码序列的黄精属药用植物分子鉴定

目的 分析4个通用植物DNA条形码序列(trnH-psbA、matK、rbcL和ITS2)及其组合对黄精属药用植物的物种鉴定分辨率，挖掘适用于黄精属种间鉴定的高分辨率分子标记。方法 以《中国药典》2020年版中收录的黄精属药用植物黄精Polygonatum sibiricum、滇黄精P. kingianum、多花黄精P. cyrtonema、玉竹P. odorati及其地方常见同属替代品、混伪品共12种79个野生个体为对象，将4个通用DNA条形码序列独立、联合分析，评估其种间、种内变异情况，并分别基于建树法(tree-based method)和PWG距离法(PWG-distance method)评估不同条形码及其组合的物种鉴定分辨率。结果 ITS2序列扩增成功率低，trnH-psbA、matK、rbcL序列的引物在黄精属植物中通用性较好；3组叶绿体序列的种间变异依次为matK＞trnH-psbA＞rbcL，种内变异差异不显著，种间、种内遗传距离无明显的Barcoding gap；各条形码独立及联合分析的物种鉴定分辨率普遍偏低，其中，组合条形码trnH-psbA＋matK＋rbcL在建树法分析中的分辨率最高，为25%，trnH-psbA＋rbcL在距离法分析中的分辨率最高，为50%。结论 4个通用DNA条形码序列及其组合都并非黄精属药用植物不同种间有效区分鉴定的理想分子标记，但多序列联合分析能在一定程度上提高物种鉴定成功率。     

基于ITS2和psbA-trnH条形码的藏党参的分子鉴定

目的 应用内转录间隔区（ITS）2及psbA-trnH条形码技术，对藏党参各物种之间进行分子生物学鉴定。方法 通过提取4个物种（灰毛党参Codonopsis canescens、脉花党参C. foetens subsp. nervosa、党参C. pilosula、长花党参C. thalictrifolia var. mollis）28份藏党参样品的基因组DNA，扩增ITS2及psbA-trnH序列并测序，并结合GenBank下载藏党参相关序列81条，包括15个物种，采用MEGA 6.0软件进行比对、变异位点分析、计算GC含量及种内和种间遗传距离，最大似然法（ML）、邻接法（NJ）、非加权组平均法（UPGMA）3种方法进行系统发育树的构建。结果 根据变异位点能将灰毛党参C. canescens、党参（党参C. pilosula、川党参C. pilosula subsp. tangshen及素花党参C. pilosula var. modesta）、西藏党参C. bhutanica、新疆党参C. clematidea、羊乳C. lanceolata、球花党参C. subglobosa及臭党参C. foetens区分；在系统发育树中，ITS2序列以ML法的聚类效果最佳，psbA-trnH序列以UPGMA法的聚类效果最佳，能对12个物种进行有效聚类区分。结论 ITS2及psbA-trnH条形码对单基原物种的鉴定率较高，但对变种与原变种间的鉴定仍存在一定局限性，这为后续藏党参物种之间的亲缘关系鉴定和临床应用等提供参考。     

绞股蓝属植物亲缘关系初步分析

采用DNA条形码ITS,matK,rbcL,psbA-trnH 4个片段,对绞股蓝属Gynostemma 9个种及变种共38份样品的序列进行分析,以雪胆属罗锅底Hemsleya macrosperma作为外类群,运用PAUP 4.0b10软件进行系统发育分析,基于ITS序列采用邻接法(NJ)和最大简约法(MP)构建系统发育树,探讨绞股蓝属下的亲缘关系.研究表明:①在NJ树和严格一致树中,广布种绞股蓝G. pentaphyllum var.pentaphyllum的8个个体没有形成单系分支;②怀疑长梗绞股蓝G. longipes 和光叶绞股蓝G. laxum是否应为独立的种;③支持绞股蓝属植物亚属的分类单位.     

中国红树类海桑属植物DNA条形码研究＊

目的 对中国的6种红树类海桑属植物进行DNA条形码研究，为该属植物鉴定、资源保护、合理开发等提供参考依据。方法 以核基因ITS2片段及叶绿体基因片段psbA-trnH作为DNA条形码，对分布在中国的海桑属植物进行基因组DNA提取、PCR扩增和双向测序。所得序列经CodonCode Aligner拼接获得叶绿体psbA-trnH基因间区序列和核ITS2序列，用软件MEGA6.0进行相关数据分析，构建NJ（邻接）树。结果 我国6种红树类海桑属植物的ITS2序列间存在明显差异，psbA-trnH序列间也存在一定的碱基差异，表明6种海桑属植物具有其各自独特的DNA条形码，可以相互区别，同时基于ITS2序列及psbA-trnH序列构建的邻接（NJ）树可以看出6种海桑属植物具有或近或远的亲缘关系。结论 核ITS2和叶绿体psbA-trnH序列作为DNA条形码可以有效地区分和鉴别我国6种红树类海桑属植物，为后续药用资源开发等相关研究提供了参考。     

基于DNA条形码的金槐系统发育和变异位点分析

目的 对来自不同居群的金槐资源的核糖体内转录间隔区2（ITS2）和叶绿体基因片段psbA-trnH、rbcL、matK进行系统发育分析，探索不同地理来源的金槐资源的遗传多样性。方法 用聚合酶链式反应（PCR）扩增获得金槐 ITS2、psbA-trnH、rbcL和matK的核酸序列，用邻接法（NJ）构建系统发育树，用Kimura 2-Parameter（K2P）模型分析遗传距离，用MEGA和BIOEDIT软件进行多重比对分析。结果 ITS2序列为278~279 bp；psbA-trnH为289 bp；rbcL为673 bp；matK为786~792 bp。ITS2和psbA-trnH都存在3个变异位点，rbcL没有变异位点，matK有13个变异位点。采用ITS2序列构建的系统发育树将金槐样品资源分为2个大类群，百宝实生树聚为一类，其余25份资源聚为一类。对于psbA-trnH序列，28份金槐资源的PCR扩增成功率为100%。psbA-trnH序列聚类结果显示，28份金槐资源可分为3个大的类群。庙头嫁接/实生树、枧塘嫁接树、文桥嫁接树、咸水实生树和大圩嫁接树组成一个类群；绍水实生树单独组成一个类群；其余21份资源组成一个类群。基于matK序列建立的发育树可将26份金槐资源分为2个类群，其中咸水实生树单独为一个分支，其余25份金槐资源聚为一支。对金槐的rbcL序列的聚类结果无法将28份资源区分开。基于ITS2+psbA-trnH+rbcL+matK组合序列构建的系统发育树可将金槐资源分为4个大类群，祁阳实生/嫁接树、道县实生树，庙头嫁接/实生树、永岁嫁接树、绍水实生树、石塘实生树、咸水实生树、枧塘实生树、文桥嫁接树、秧塘嫁接树、湘漓实生树聚为一支；文桥实生树聚为一支；大圩实生树聚为一支；其他金槐资源聚为一支。结论 系统发育和变异位点分析为金槐资源的进化研究、道地性评价奠定了理论基础，变异位点的分析可用于相关资源的鉴定。结果也表明将不同基因片段组合对植物进行鉴定，效果更佳。     

石蒜属叶绿体trnL-F序列的变异与系统聚类分析

目的：分析比较石蒜属和近缘属植物中国水仙trnL基因的部分序列和trnL-trnF间隔区的完整序列，为石蒜属物种鉴别和种间亲缘关系分析提供分子佐证。方法：采用PCR产物直接双向测序法，用Clustal X 1.81，MEGA 2.0软件进行序列分析，采用最大简约法(maximum parsimony，MP)构建系统发育树。结果：所测物种的序列全长在905～1 036 bp，经排序后，两端切平，得到886 bp的整齐序列，所测物种的核苷酸变异位点14个，信息位点10个，主要在trnL内含子区，这些位点可用于区分石蒜属物种；4个碱基“ATAT”缺失/插入是区别石蒜属与其近缘植物水仙的显著特征。重建的系统发育树表明：供试的石蒜属物种聚成3类，除稻草石蒜、忽地笑、香石蒜的系统位置有所不同之外，与经典分类结果基本相符。水仙属2个种形成1个单系类群，表明属间trnL-F序列差异明显。结论：分子系统树支持安徽石蒜是长筒石蒜的变种或杂交种观点，换锦花可能是玫瑰石蒜、红蓝石蒜的杂交母本。石蒜属种间trnL-F序列存在一定变异，是物种鉴别的有效分子标记。     

基于psbA-trnH序列的辽宁省黄精药材DNA条形码研究

目的 基于psbA-trnH序列,运用DNA条形码技术对辽宁省12个地区及省外2个地区黄精药材样本进行鉴别分析,为辽宁省黄精药材的鉴别和遗传多样性分析提供参考。方法 利用DNA试剂盒提取法,从38个黄精样本的药用部位中提取DNA,对psbA-trnH部分进行聚合酶链式反应（PCR）扩增及双向测序,并从GenBank下载药用植物黄精的不同来源和外群序列,运用SeqMan软件对测序结果进行拼接,使用MEGA软件对数据进行分析比对,计算K2P（Kimura 2-parameter）遗传距离,并采用邻接法（NJ）建立系统发育树进行分析。结果 根据NJ系统发育树结果可知,不同来源的所有黄精样品聚为一大支,外群猪牙花聚为一支,区别较明显;辽宁省、湖北省及贵州省黄精与美国国家生物技术信息中心（NCBI）所下载的黄精聚为一支,并且结合变异位点与遗传距离可知,辽宁省、湖北省及贵州省的黄精物种为黄精Polygonatum sibiricum Red.,种间差异较小,辽宁省所收集的黄精有4个样品出现了变异位点,其余样本碱基序列均相同。结论 使用psbA-trnH序列DNA条形码技术能够对黄精药材不同的基原植物进行区分鉴别且成功率较高,可用于对黄精属物种进行种内和种间鉴别,为保障辽宁省黄精药材来源的准确鉴定提供参考。     

22种樟科植物DNA条形码分子鉴定

目的 筛选适合樟科植物的DNA条形码，对采集的22种樟科植物进行鉴定分类。方法 以22种樟科植物为实验材料，提取其DNA，使用不同的DNA条形码引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，电泳检测后进行双向测序。采用Codon Code Aligner软件对测序峰图和序列进行校对、拼接并去除正反向引物序列。将序列导入DNAMAN，进行多序列对比，查看并分析碱基变异位点。用MEGA计算不同种植物的遗传距离（K2P），根据遗传距离分析变异程度，基于邻接法构建系统进化树。结果 采用3对DNA条形码通用引物对22种樟科植物的DNA进行扩增测序后通过比较基因序列的特异碱基位点成功鉴别出其中20种植物。结论 matK序列能鉴定4个木姜子属植物；rbcL除粗脉桂外，对实验材料中楠属的3个物种都能进行区分；matK+rbcL+rpoB序列结合可鉴别20种樟科植物。其中matK序列对樟科植物鉴定效果最好，结果也表明将DNA条形码对植物进行组合鉴定，效果更佳。从分子角度研究樟科植物之间的亲缘关系，同时也为药用植物资源调查、栽培种植、开发保护利用提供依据。     

基于叶绿体DNA条形码的披麻草药材及其混伪品的分子鉴定

目的 分析trnV-atpE、psaC-ndhE序列变异特点,并通过该序列鉴别披麻草不同基原植物与其混伪品。方法 分别提取披麻草3种基原植物及其混伪品的总DNA,以trnV-atpE、psaC-ndhE为DNA条形码候选序列进行聚合酶链式反应（PCR）扩增和测序。采用DnaSP、MEGA软件统计其片段长度、鸟嘌呤（G）+胞嘧啶（C）占比、变异位点个数、简约信息位点、插入或缺失位点,并计算样品K2-P（Kimura 2-parameter）遗传距离和构建邻接法（NJ）系统发育树。结果 trnV-atpE、psaC-ndhE序列长度分别为373~381、491~534 bp,简约信息位点分别为18、15个。trnV-atpE和psaC-ndhE序列中披麻草3种基原植物最大遗传距离均小于与混伪品之间的最小遗传距离。基于2个序列构建的NJ系统发育树显示,披麻草与其混伪品能明显区分。结论 综合分析序列特点和种内、种间变异性,trnV-atpE和psaC-ndhE序列均可将披麻草3种基原植物与其混伪品区分开。     

基于DNA条形码的玉叶金花属植物鉴定研究

目的利用DNA条形码进行玉叶金花属植物的分子鉴定。方法对玉叶金花属20种、89份个体进行叶绿体片段rbc L、mat K和trn H-psb A以及核基因片段ITS的PCR扩增和测序,计算种内和种间Kimura 2-parameter(K2-P)遗传距离,利用序列相似性法和邻接法进行单一片段、核心片段、组合片段以及ITS2片段的分析。结果单一片段分析结果表明玉叶金花属种间遗传距离(0.002~0.012)明显大于种内遗传距离(0.000 3~0.000 7)。trn H-psb A扩增率最低,ITS2片段的分辨率最高,其次是mat K和ITS片段,rbc L片段的分辨率最低。片段组合后的分辨率明显提高,基于序列相似性法和邻接法,mat K+rbc L+ITS和mat K+rbc L+trn H-psb A+ITS的分辨率相当,且比其他片段组的分辨率更高,分别为77%和75%,成功鉴定了15个近缘类群,包括2个药用种类广西玉叶金花和黐花。结论鉴于trn H-psb A扩增率较低,建议mat K+rbc L+ITS作为玉叶金花属物种鉴定的DNA条形码,并作为其药用种类的分子鉴定工具。     

基于多基因组片段构建枸杞属药用植物DNA条形码

目的采用核基因组核糖体DNA ITS区、叶绿体基因组9个DNA片段和线粒体基因组2个DNA片段构建国产枸杞属药用植物DNA条形码。方法采集枸杞属黑果枸杞Lycium ruthenicum、黄果枸杞L.barbarum var.auranticarpum、宁夏枸杞L.barbarum、枸杞L.chinense和新疆枸杞L.dasystemum 5个分类群标本及实验样品,测定各样品的核糖体ITS区,叶绿体mat K、rbc L、rpo C1、trn L(UAA)intron、psb A-trn H、atp B-rbc L、trn S(GCU)-trn G(UCC)、rpl20-rps12、trn L(UAA)-trn F(GAA)和线粒体nad1第2内含子、nad5第4内含子序列;以全萼秦艽Gentiana lhassica为外类群,进行系统学分析。结果共获得108条序列,ITS区变异位点最为丰富;筛选出6个叶绿体DNA片段;2个线粒体DNA片段可作为该属3个物种的条形码推荐序列;构建各物种多基因组多片段组合DNA条形码。结论 ITS区及筛选的6个叶绿体DNA片段均具有物种鉴别意义;2个线粒体DNA片段具有一定鉴别意义;为枸杞类物种鉴定及遗传背景分析提供基础资料。     

中药地枫皮及其伪品假地枫皮的DNA条形码鉴定

目的:评价和比较几个常用DNA条形码候选序列对地枫皮及伪品假地枫皮的鉴定作用。方法:采集不同产地的地枫皮及假地枫皮样品,进行总DNA提取,选取核基因内转录间隔区2(ITS2)序列、叶绿体rbcL,mat K基因序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,纯化产物测序,利用Condon Code Aligner V3. 7. 1校对拼接。结果:地枫皮及假地枫皮rbcL序列进行多次PCR扩增及测序结果均不理想,初步推测地枫皮及假地枫皮rbcL序列太长,进化较慢,不适合作为地枫皮及假地枫皮种间鉴别;地枫皮及假地枫皮的matK基因序列测序成功率分别为0和76. 8%,可能是不同类群的植物matK序列的引物标准不一;对地枫皮及假地枫皮的ITS2序列PCR扩增及测序结果最为理想,测序的成功率分别为89. 3%及91. 2%,对测序结果序列进行分析,地枫皮的ITS2序列总长度均为268个碱基,存在2个变异位点;假地枫皮的ITS2序列总长度均为430个碱基,存在4个或3个变异位点。实验结果说明地枫皮及假地枫皮ITS2序列较短,有明显的变异性,便于扩增,表明ITS2序列用于地枫皮及假地枫皮的分子鉴定优于rbcL和matK序列。结论:ITS2序列作为标准的DNA条形码能够有效地鉴定地枫皮及其伪品假地枫皮。     

忍冬科药用植物DNA条形码通用序列的筛选

目的:从4条DNA片段(psbA-trnH,matK,rbcL,和ITS2)中筛选可用于忍冬科药用植物鉴定的DNA条形码通用序列。方法:通过比较各序列的PCR扩增成功率、测序效率、种内和种间变异、barcoding gap和鉴定成功率等指标评价不同序列在忍冬科植物中的鉴定能力。结果:对忍冬科13个属,33个物种,58个样本进行分析,ITS2序列在属水平上的鉴定成功率为100.0%,物种水平上的鉴定成功率为96.6%。结论:ITS2序列可以作为忍冬科植物的DNA条形码候选序列,同时推荐psbA-trnH序列作为ITS2序列的补充序列。     

基于DNA条形码技术的知母种子基原鉴定

目的:建立基于中药材DNA条形码技术的知母种子基原鉴定方法,保障知母种子基原的真实性。方法:收集知母的30份基原植物样品和9份生药材样品,获取其参考DNA条形码序列,采用克隆测序方法验证参考序列的准确性。收集51份待检测知母种子样品,获取其DNA条形码序列,基于BLAST法、遗传距离法和邻接(NJ)系统发育树法进行物种鉴定。结果:对于基原植物和生药材样品,由于基因组内存在异质性,核糖体DNA第2内部转录间隔区(ITS2)序列无法稳定获得,但可成功获得psbA-trnH序列。知母psbA-trnH序列分为6个单倍型,有3个变异位点,2处插入/缺失,种内变异最大值0.003 5,种间变异最小值0.1,在NJ系统发育树上聚为独立的支。共获得153条知母种子的psbA-trnH序列,经BLAST法、遗传距离法和NJ系统发育树法鉴定均为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides。结论:psbA-trnH是知母种子鉴定的适合条形码序列,可用于知母种子的真实性鉴定。所收集51份知母种子样品的基原均符合2015年版《中国药典》(一部)相关项下规定,未发现伪品。     

PCR增强剂对药材DNA分子鉴定的影响

评价PCR增强剂对中药材DNA分子鉴定的影响,筛选获得适用于中药材DNA分子鉴定的PCR增强剂。文章分别利用CTAB法和碱裂解法提取180个中药材DNA样品,分析在PCR反应体系中使用PCR增强剂对通用引物ITS2,psbA-trnH,rbcL,matK,trnL-trnF片段PCR成功率的影响及实时荧光定量PCR反应体系中使用增强剂对PCR扩增效率的影响。结果表明BSA与PVP组合可以明显增加ITS2,psbA-trnH,rbcL片段的PCR成功率,且PCR增强剂也能消除位点特异性鉴别假阴性结果,提高分子鉴定的准确性,但降低了实时荧光定量PCR的扩增效率。本研究说明BSA和PVP作为PCR增强剂能增加中药材DNA的PCR扩增成功率和分子鉴别的准确性。     

基于居群DNA条形码的药用植物黄芩的产地鉴别研究

目的:利用居群DNA条形码阐明不同产地(居群)黄芩的遗传分化程度,对其进行产地鉴别。方法:应用进化速率快和母系遗传的叶绿体DNA基因间序列,基于分子谱系地理学理论筛选出居群间遗传分化明显的片段,构建单倍型网状进化树,根据单倍型在网状进化树中的位置、出现的频率和地理分布范围的大小,划分出不同层次的居群DNA条形码,以用于地理分布范围宽窄不同的产地鉴别。结果:本实验筛选出3个叶绿体DNA基因间序列atpB-rbcL,trnL-trnF和psbA-trnH对17个黄芩野生居群进行分子谱系地理学分析,得到13个多态位点,共20个单倍型,其中3个分布最广、频率最高的单倍型可用于较广地域的产地鉴别,称为区域居群DNA条形码;3个分布次之、只存在于2～3个邻近居群的单倍型可用于较窄地域的产地鉴别,称为地区居群DNA条形码;另有8个仅局限在某一个居群的单倍型可用于特定居群的鉴别,称为居群特有DNA条形码。结论:叶绿体基因间序列在居群间存在明显遗传分化,可用于地理分布范围宽窄不同的黄芩产地鉴别。     

基于DNA条形码的芦荟属6种植物的分子鉴定

目的筛选出适合芦荟属6种植物的DNA条形码序列。方法采用试剂盒法提取芦荟属6个品种基原植物的18份样本基因组DNA,应用通用引物扩增其核基因ITS2序列和叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK基因序列并进行双向测序,采用Sequencher 4.1.4软件对测序峰图进行校对拼接,应用MEGA 5.0软件分析不同候选序列的特征,计算物种的种内、种间Kimura 2-Parameter(K2P)遗传距离,比较其种内、种间变异的大小,评估序列的条形码间距(barcoding gap),采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统聚类树。结果共获得72条序列,ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK基因序列各18条,测序成功率均为100%。比对后序列长度为255~723 bp,GC量范围为30.6%~68.2%。psbA-trnH基因序列的最大种内遗传距离均小于最小种间遗传距离,有明显的barcoding gap,ITS2、rbcL、matK序列的种内变异和种间变异有一些重叠,没有明显的barcoding gap。基于psbA-trnH序列的发育树能将芦荟属6个品种完全区分,而其他3个序列在区分这些芦荟属品种时存在模糊鉴定。结论 DNA条形码技术可以准确鉴别芦荟属植物,psbA-trnH序列可以作为鉴别芦荟属植物的优选序列。