秦艽5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因（GmDXR）的克隆和表达分析

目的从药用植物秦艽Gentiana macrophylla中克隆了萜类成分合成途径的关键酶——5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase,DXR)基因,分析其序列特征及表达方式。方法克隆了秦艽DXR基因(GmDXR),分析了GmDXR编码蛋白序列的特征,并采用实时定量分析了GmDXR的表达模式。结果秦艽GmDXR基因包含1个完整的长1 428 bp的ORF框,编码475个氨基酸;GmDXR与萝芙木、番茄等植物DXR蛋白具有很高的同源性(≥85%),无跨膜结构域、信号肽等结构,主要定位于叶绿体中。定量PCR结果显示,GmDXR主要在秦艽的叶中进行表达,受到植物激素茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)的诱导。结论 GmDXR含有DXR蛋白的保守结构特征;在秦艽不同器官中GmDXR基因表达不同,且受到MeJA的诱导。该研究为今后研究秦艽环烯醚萜类化合物的生物合成机制提供了依据。     

雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析

根据雷公藤转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用全长PCR方法克隆TwMCT全长cDNA,分析序列同源性,预测TwMCT蛋白结构,并进行序列多重比对和构建系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR),以actin为内参,分析雷公藤悬浮细胞受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后0~72 h TwMCT基因的相对表达量。克隆得到全长1318 bp TwMCT全长cDNA,具有完整编码框,编码311个氨基酸,蛋白相对分子质量为34.14 kDa,理论等电点为8.65;RT-qPCR结果表明该基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。克隆雷公藤TwMCT全长cDNA和分析表达特性,为进一步研究该基因的功能和雷公藤次生代谢调控提供了基因元件。     

不同种源高良姜1,8-桉油精含量及挥发油成分分析

目的:对不同种源高良姜1,8-桉油精及挥发油化学成分进行分析,为高良姜优良种源的选择及品种选育奠定基础。方法:采用水蒸汽蒸馏法提取高良姜药材中挥发性化学成分,采用气相色谱-质谱技术(GC-MS)对其化学成分进行分离鉴定。结果:野生及人工栽培高良姜药材1,8-桉油精含量均达到《中国药典》要求;人工栽培药材1,8-桉油精含量随着栽培年限的延长而增加;从挥发油中共分离鉴定28种化合物,含量较高的主要为L-α-松油烯、反式-石竹烯、γ-杜松烯、1,8-桉油精、法尼烯等成分。结论:不同种源不同生长年限高良姜1,8-桉油精含量及挥发油成分存在较大差异。     

雷公藤4α-甲基氧化酶基因(TwSMO1)的cDNA全长克隆及表达分析

目的:克隆得到雷公藤一型4α-甲基氧化酶(Tw SMO1)(Gen Bank KX987126)全长基因,并对其进行序列分析及初步的功能验证。方法:根据雷公藤转录组数据,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到雷公藤4α-甲基氧化酶基因(TwSMO1),并利用相关软件对所得核酸序列及其所编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。用茉莉酸甲酯(MeJA)诱导雷公藤悬浮细胞,用实时荧光定量(RT-PCR)的方法分析诱导不同时间点后雷公藤悬浮细胞中的TwSMO1基因的相对表达量。结果:克隆所得的TwSMO1基因cDNA全长1505 bp,开放阅读框900 bp,编码299个氨基酸,在线预测其所编码蛋白分子量为34.55 k Da,理论等电点为6.89。多重序列比对结果显示其与其他物种的SMO1氨基酸序列有较高同源性,且包含SMO1基因家族的3个保守域,系统进化树将其归为4α-甲基氧化酶第一家族基因,遂将其命名为TwSMO1。RT-PCR结果表明MeJA诱导后TwSMO1基因在1 h后表达量达到最高,约是对照组的450倍。结论:本研究首次克隆得到雷公藤TwSMO1基因,并对其进行生物信息学分析及MeJA诱导表达分析,为深入研究此基因功能及阐述雷公藤甾醇生物合成途径奠定基础。     

蜘蛛香香叶醇-10-羟化酶基因的克隆及表达分析

目的:克隆蜘蛛香香叶醇-10-羟化酶(geraniol-10-hydroxylase,G10H)基因,并对其进行生物信息学和基因表达量分析。方法:在已测得蜘蛛香转录组数据的基础上,设计全长特异引物,克隆出G10H基因全长,运用生物信息学进行基因序列同源性分析,并对编码蛋白进行各种理化性质分析。运用实时荧光定量PCR检测该基因在蜘蛛香不同部位的相对表达量,并利用茉莉酸甲酯处理蜘蛛香植株后,分时间取成熟叶片进行诱导表达分析。结果:从蜘蛛香中克隆得到了长度为1 500 bp的G10H基因(VjG10H)完整开放阅读框的cDNA序列,编码499个氨基酸。VjG10H编码的蛋白相对分子质量是55.92 kDa,理论等电点为7.61。实时荧光定量PCR检测结果表明,VjG10H基因在成熟叶中表达量最高,其次是根茎中,在新生叶中表达量最低;VjG10H对茉莉酸甲酯的诱导表现出敏感,茉莉酸甲酯诱导处理48 h后基因的表达水平达到最高。结论:成功从蜘蛛香植株中克隆得到可能参与环烯醚萜生物合成途径中的关键酶G10H基因。     

药用植物珊瑚菜GlAT基因的克隆和生物信息学分析

目的:对药用植物珊瑚菜Glehnia littoralis BAHD酰基转移酶(Acyltransferase,AT)基因序列进行生物信息学分析。方法:用茉莉酸甲酯(MeJA)处理珊瑚菜幼苗,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测GlAT候选基因的表达量,在已建立的珊瑚菜转录组数据中筛选出表达量较高且MeJA处理后上调表达的1条GlAT基因序列,对该基因cDNA序列进行全长克隆;根据所得的氨基酸序列进行蛋白质理化性质、二级结构、三级结构分析,利用MEGA 6.0构建该蛋白序列的NJ系统进化树。结果:GlAT的全长开放阅读框ORF(Open Reading Frame)为1443 bp,编码480个氨基酸。该蛋白相对分子质量为52844.14,等电点为6.92,为亲水性蛋白,属于转移酶超家族。珊瑚菜GlAT蛋白与同科植物胡萝卜Daucus carota subsp.sativus的AT蛋白亲缘关系最近。结论:首次获得珊瑚菜GlAT基因的ORF全长序列并进行了生物信息学分析,为进一步开展该基因的功能和遗传调控机制研究奠定了基础。     

白木香AsNINJA1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的茉莉酸甲酯诱导表达

目的 克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis互作蛋白(jasmonate Zim-domain,JAZ)基因(NINJA),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法 以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆白木香NINJA基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qRT-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)处理的白木香愈伤组织中AsNINJA1基因的表达模式。结果 获得白木香NINJA基因全长cDNA,命名为AsNINJA1。序列分析表明,该基因的序列全长为1 982 bp,包含一个1 221 bp的开放阅读框,编码406个氨基酸,蛋白质相对分子质量为43 697,等电点为6.02。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理4 h后AsNINJA1基因相对表达量最高,是对照(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的近100倍,随后显著下降。结论 获得AsNINJA1基因全长cDNA序列,该基因对MeJA诱导极为敏感,且能在伤害早期响应。     

白木香JAZ1基因全长cDNA克隆及其在愈伤组织中的伤害诱导表达分析

目的克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis茉莉酸(JA)信号途径核心抑制蛋白基因(jasmonate-zim-domain protein,JAZ),为深入研究其在沉香倍半萜合成途径中的功能奠定基础。方法以白木香总RNA为模板,采用RACE法和RT-PCR方法,克隆JAZ基因cDNA全长,并进行生物信息学的分析;采用实时荧光定量(qR T-PCR)方法分析经茉莉酸甲酯(MeJA)和机械伤害处理的白木香愈伤组织中JAZ基因的表达模式。结果获得白木香JAZ基因全长cDNA,命名为AsJAZ1,GenBank登录号为KP677281。序列分析表明,该基因的序列全长为1507 bp,包含一个990 bp的开放阅读框,编码330个氨基酸,蛋白质相对分子质量为34280,等电点为6.89。qRT-PCR结果显示,经MeJA处理0.5 h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经MeJA处理的白木香愈伤组织)的27倍,随后显著下降;经机械处理2h后AsJAZ1基因相对表达量最高,约是对照组(未经机械处理的白木香愈伤组织)的17倍,随后又快速降低,到24h基本恢复正常。结论获得AsJAZ1基因全长cDNA序列,该基因对伤害诱导极敏感,且能在伤害早期响应。     

雷公藤4-(5''-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因的全长克隆与表达分析

4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶[4-(cytidine-5-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase, CMK]是雷公藤甲素等萜类成分生物合成途径上关键酶之一。根据获得的雷公藤转录组数据中TwCMK片段设计特异性引物,采用全长PCR方法克隆TwCMK全长cDNA,并进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测茉莉酸甲酯(MeJA)诱导雷公藤悬浮细胞后0~72 h TwCMK基因的表达水平。结果表明,TwCMK全长cDNA由1732个核苷酸组成,具有完整的开放阅读框,共编码387个氨基酸,蛋白相对分子质量为42.85 kDa,理论等电点为5.79;TwCMK基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到最高值。为进一步研究雷公藤甲素等萜类成分次生代谢调控和生物合成奠定了基础。     

铁皮石斛倍半萜合成酶基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛Dendrobium officinale倍半萜合成酶(sesquiterpene synthase,SES)基因,分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及在信号分子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)诱导下的表达模式。方法采用RACE技术克隆铁皮石斛SES(DoSES)cDNA全长,利用相关软件和在线网站对其进行生物信息学分析,并使用实时荧光定量PCR技术分析DoSES的表达模式。结果获得的DoSES cDNA序列(Gen Bank登录号为KX278311)全长1 890 bp,含有1个1 659 bp的完整开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸的多肽链,与其他科属植物的同源性达到60%左右。DoSES基因在铁皮石斛茎中表达量最高,从高到低依次是叶、花、原球茎、根;且受到Me JA的诱导。结论克隆了铁皮石斛DoSES基因,为进一步研究调控铁皮石斛萜类代谢奠定了理论基础。     

鱼腥草1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因克隆与差异表达

目的 克隆鱼腥草1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)基因,并分析其差异表达.方法 采用RT-PCR方法获得DXR基因cDNA序列,并对DXR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测了该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR方法检测了DXR基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况.结果 克隆获得的DXR基因长为1 416 bp,编码471个氨基酸.生物信息学预测DXR蛋白不含跨膜区,不含信号肽.DXR基因在鱼腥草的叶片中表达丰度最高,其次是地下茎,再次是地上茎,花中表达量最低.结论 首次从鱼腥草中克隆了DXR基因,为进一步阐明该基因在鱼腥草萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础.     

Anti-inflammatory,anti-nociceptive,and anti-psychiatric effects by the rhizomes of Alpinia officinarum on complete Freund's adjuvant-induced arthritis in rats

Ethnopharmacological relevance

Alpinia officinarum Hance (Zingiberaceae) is an annual plant. Its rhizome has long been used as an anti-inflammatory, an analgesic, a stomachic and a carminative in traditional medicine.

Objective

The aim of this study was to test the anti-inflammatory effects of Alpinia officinarum rhizomes on acute and chronic arthritis in SD rats.

Methods

Alpinia officinarum rhizomes were extracted by refluxing using 80% ethanol. The fractions were prepared by the fractionation of ethyl acetate (EtOAc), n-butanol, and water. This extract was administrated to rats by peroral injection. Acute arthritis was induced by a subcutaneous injection of carrageenan into the hind paw of SD rats. Chronic arthritis was stimulated by a subcutaneous injection of complete Freund's adjuvant (CFA) into the hind paw of SD rats. The paw volume was measured using a plethysmometer, thermal hyperalgesia was tested using a thermal plantar tester, hyperalgesia was evaluated by ankle flexion evoked vocalizations, and the expression of c-Fos in the brain hippocampus was measured with the avidin–biotin-peroxidase technique. Nitric oxide (NO) production was evaluated on nitrite by a Griess assay in lipopolysaccharide (LPS)-induced murine macrophage RAW 264.7 cells.

Results

An 80% ethanolic extract showed acute anti-inflammatory activity that it reduced the edema volume in carrageenan-stimulated arthritis and inhibited NO generation in LPS-induced RAW 264.7 cells. In addition, this extract showed chronic anti-rheumatic and analgesic activities by suppressing the swelling volume, by recovering the paw withdrawal latency, and by inhibiting the flexion scores in CFA-induced arthritis. Particularly, this medicine had potent meaningful effects on the second signal of the left hind paw in the form of an immunological reaction compared to its effects on the first signal in the right hind paw after the CFA treatment. This also shows an anti-psychiatric effect through control of the expression of the c-Fos protein of the brain hippocampus in CFA-stimulated arthritis. On the other hand, each fraction showed acute anti-inflammatory effects; the action of the EtOAc fraction may have resulted from the suppression of NO production.

Conclusions

Alpinia officinarum rhizomes may be viable therapeutic or preventive candidates for the treatment of acute and chronic arthritis.     

丹参2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)基因全长克隆及其生物信息学分析

目的:从丹参毛状根中克隆2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环焦磷酸合成酶(SmMCS)全长基因,并进行生物信息学分析.方法:根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆SmMCS全长cDNA,并对SmMCS进行蛋白结构预测、序列多重比对和构建进化树等分析;同时采用实时定量PCR检测Ag+诱导子诱导丹参毛状根不同时期的SmMCS基因转录水平.结果:克隆的SmMCS全长cDNA由988个核苷酸组成,具有完整编码框,编码234个氨基酸,蛋白相对分子质量约24.6 kDa,等电点pI 8.53;实时定量PCR结果表明该基因受Ag+诱导后表达水平在12 h时急剧上升并达到最高值.结论:从丹参毛状根中克降得到一条SmMCS全长cDNA,为进一步研究丹参酮类成分的生物合成和萜类次生代谢提供靶基因.     

Antimicrobial compounds from Alpinia conchigera

Ethnopharmacological relevance

The rhizome of Alpinia conchigerahas been used as a condiment in the northern states of Peninsular Malaysia and occasionally in folk medicine in the east coast to treat fungal infections. In some states of Peninsular Malaysia, the rhizomes are consumed as a post-partum medicine and the young shoots are prepared into a vegetable dish. This study aimed to investigate the chemical constituents of the pseudostems and rhizomes of Malaysian Alpinia conchigera and to evaluate the antimicrobial activity of the dichloromethane (DCM) extracts of the pseudostems, rhizomes and the isolated compounds against three selected fungi and five strains of Staphylococcus aureus.

Materials and methods

The dried and ground pseudostems (0.8 kg) and rhizomes (1.0 kg) were successively extracted in Soxhlet extractor using n-hexane, dichloromethane (DCM) and methanol. The n-hexane and DCM extracts of the pseudostem and rhizome were subjected to isolation and purification using column chromatography on silica gel using a stepwise gradient system (n-hexane to methanol). Briefly, a serial two fold dilutions of the test materials dissolved in DMSO were prepared prior to addition of 100 μl overnight microbial suspension (108 cfu/ml) followed by incubation at 37 °C (bacteria) or 26 °C (dermatophytes and candida) for 24 h. The highest concentration of DMSO remaining after dilution (5%, v/v) caused no inhibition to bacterial/candida/dermatophytes’ growth. Antibiotic cycloheximide was used as reference for anticandidal and antidermatophyte comparison while oxacilin was used as reference for antibacterial testing. DMSO served as negative control. Turbidity was taken as indication of growth, thus the lowest concentration which remains clear after macroscopic evaluation was taken as the minimum inhibitory concentration (MIC).

Results

The isolation of n-hexane and DCM extracts of the rhizomes and pseudostems of Alpinia conchigera via column chromatography yielded two triterpenes isolated as a mixture of stigmasterol and β-sitosterol: caryophyllene oxide, chavicol acetate 1, p-hydroxy cinnamaldehyde 2, 1′S-1′-acetoxychavicol acetate 3, trans-p-coumaryl diacetate 4, 1′S-1′-acetoxyeugenol acetate 5, 1′-hydroxychavicol acetate 6, p-hydroxycinnamyl acetate 7 and 4-hydroxybenzaldehyde.The DCM extract of the rhizome of Alpinia conchigera indicated potent antifungal activity against Candida albicans, Microsporum canis and Trycophyton rubrum with MIC values of 625 μg/ml, 156 μg/ml and 156 μg/ml, respectively. It also showed significant inhibitory activity with MIC values between 17.88 and 35.75 μg/ml against the mutant Staphylococci isolates MSSA, MRSA and Sa7.Amongst the isolated compounds, the lowest inhibition observed were of 1′S-1′-acetoxyeugenol against the dermatophytes (MIC 313 μg/ml) followed by trans-p-coumaryl diacetate against both dermatophytes and candida (MIC 625 μg/ml). The compound p-hydroxycinnamyl acetate strongly inhibited Staphylococcusaureus strain VISA (MIC 39 μg/ml) followed by trans-p-coumaryl diacetate and 1′-hydroxychavicol acetate with MIC value of 156 μg/ml.

Conclusion

In conclusion, the observed antibacterial, anticandidal and antidermatophyte activity of the extracts and compounds obtained from the rhizome confirm the traditional use of Alpinia cochigera rhizome in the treatment of skin infection.     

不同种源高良姜遗传多样性的AFLP分析

目的:研究不同种源高良姜的遗传多样性,探求各种质间的亲缘关系,为合理利用高良姜种质资源及优良品种选育奠定理论基础.方法:采用扩增片段长度多态性(AFLP)技术,对8个种源地的高良姜进行遗传多态性分析,将扩增出的条带作为原始矩阵,用NTSYSpc-2.11F软件计算并分析高良姜种质间的相似度,构建遗传系统进化树.结果:通过筛选得到8对AFLP引物组合,共扩增出1120个DNA条带,多态性条带为1044个,多态性位点平均为92.57%;通过构建系统进化树,将8个种源地的高良姜种质分为3类.结论:高良姜种质间存在较高多态性,遗传多样性丰富.     

滇重楼鲨烯合酶基因PpSQS的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆滇重楼鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)基因(PpSQS),对该基因进行序列分析及原核表达。 方法: 采用同源克隆和RACE技术获得PpSQS的cDNA,并对其进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET-30b(+)-PpSQS,在大肠杆菌Escherich coli BL21(DE3)中进行诱导表达。 结果: PpSQS基因cDNA全长1 498 bp,包含1个1 212 bp的开放阅读框(ORF),可编码403个氨基酸;PpSQS理论标准分子质量为46.36 kDa,等电点为pI 6.83;SDS-PAGE分析表明,经1 mmol·L^-1 IPTG诱导后,重组PpSQS蛋白在大肠杆菌中获得表达。 结论: 首次获得了滇重楼PpSQS基因cDNA全长序列,该基因编码产物具有植物SQS同源蛋白的典型特征,实现重组PpSQS在大肠杆菌中的表达。     

北柴胡UGT基因的克隆及其过量表达和RNAi转基因载体的构建

目的:克隆北柴胡中可能参与柴胡皂苷生物合成的UGT基因,构建其过表达和抑制表达的转基因载体,为通过转基因验证其功能奠定基础。方法:在454高通量测序已获得部分cDNA序列基础上,通过RACE和LD-PCR方法扩增全长cDNA克隆。设计含有酶切位点的PCR引物,PCR扩增UGT基因的ORF和部分片段后,酶切,分别插入到pCAMBIA-SUPER1 300和pHANNIBAL中。重组的pHANNIBAL经Not I酶切后插入到pART27中。最终以构建出过表达和抑制表达的转基因载体。结果:扩增到了北柴胡1个UGT基因全长cDNA克隆,构建了这一基因的过表达和抑制表达转基因载体。结论:通过UGT基因的全长cDNA克隆和转基因载体构建,为后续开展转基因研究,验证其生物功能奠定了基础。     

金荞麦苯丙氨酸解氨酶基因FdPAL 的克隆及原核表达

目的:克隆金荞麦苯丙氨酸解氨酶(FdPAL)基因DNA和全长cDNA序列,对该基因进行序列分析,原核表达及其活性相关研究.方法:采用同源克隆和RT-PCR技术扩增苯丙氨酸解氨酶基因的DNA序列和全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析;构建PAL原核表达载体pET30b(+)-FdPAL,在大肠杆菌Escherich coli BL21( DE3)中进行诱导表达,使用分光光度计法定量测定其酶活,使用薄层色谱法鉴定其催化活性.结果:金养麦PAL基因DNA序列全长2 583 bp,由2个外显子,1个内含子构成(命名为FdPAL,GenBank登录号为HM628904);cDNA序列包含1个2 169 bp的开放阅读框(ORF),编码722个氨基酸,理论相对标准分子质量78.31 kDa,等电点5.94.SDS-PAGE分析表明,诱导后的新生蛋白质相对标准分子质量为75.37 kDa;诱导4h后,表达产物的苯丙氨酸解氨酶比活力最高,达到4 386 nmol·g-1·min-;薄层色谱结果表明,诱导表达产物具有催化苯丙氨酸转化为肉桂酸的活性.结论:首次从金荞麦中克隆到PAL基因,该基因具有植物PAL同源基因的典型特征;重组的金荞麦PAL基因表达载体[pET30b(+)-FdPAL]能有效地在大肠杆菌Ecoli BL21 (DE3)中表达,并形成具有一定催化功能的酶.     

丹参类贝壳杉烯氧化酶(SmKOL)基因全长克隆及其生物信息学分析

根据丹参转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用RACE方法克隆类贝壳杉烯氧化酶(Sm KOL)全长c DNA,并进行生物信息学分析;采用实时定量PCR检测茉莉酸甲酯(Me JA)诱导丹参毛状根不同时期的Sm KOL表达水平。克隆得到的Sm KOL全长c DNA由1 884个核苷酸组成,具有完整编码框,编码519个氨基酸,蛋白相对分子质量约为58.88 k Da,等电点p I 7.62;实时定量PCR结果表明该基因受Me JA诱导后,表达水平在36 h时达到最大值。从丹参毛状根中克隆得到1条Sm KOL全长c DNA,为进一步研究该基因的功能和丹参次生代谢调控机制提供了靶基因。